Técnica de Biópsia Conjuntival e Imunofluorescência Direta para Diagnóstico de Penfigoide de Membrana Mucosa

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para coleta e processamento de biópsia conjuntival para identificar penfigóide de membrana mucosa.

Resumo

O penfigoide da mucosa ocular (MMP) apresenta-se como conjuntivite cicatrizante crônica que, se não tratada, pode causar cegueira. O diagnóstico oportuno e a terapia imunossupressora previnem a progressão da doença. A coloração direta por imunofluorescência (IFD) da biópsia conjuntival para deposição de imunocomplexos na membrana basal é diagnóstica de MMP. A taxa de positividade da biópsia depende das características da biópsia, lateralidade, idade avançada e atividade da doença. O artigo de métodos atuais descreve a técnica de coleta da biópsia conjuntival e o uso de cartuchos de temperatura de corte ideal para transferência de amostras e preparação de blocos. Uma biópsia é realizada em uma região não cicatrizada, não envolvida ou relativamente menos envolvida da conjuntiva em ambos os olhos. O tamanho usual da biópsia é de 4-5 mm de comprimento, 2-3 mm de largura e deve ter um pequeno tecido subconjuntival subjacente para que a membrana basal não seja perdida. Recomendamos a realização da coloração com ácido periódico de Schiff para confirmar a presença da membrana basal. Usando um protocolo especificado, as criosseções de biópsias são coradas com anticorpos conjugados fluorescentes IgG, IgM, IgA e fatores de complemento C3c e C4c. Uma biópsia positiva mostra a fluorescência verde positiva na membrana basal e, mesmo que um dos anticorpos seja positivo, é positivo para MMP. Uma biópsia negativa não descarta penfigoide; no entanto, um positivo confirma a MMP e a diferencia da conjuntivite cicatrizante induzida por drogas ou pseudopenfigóide.

Introdução

O penfigoide de mucosa (MMP) é uma doença conjuntival cicatrizante crônica de etiologia autoimune e acomete as membranas mucosas do organismo ^1,2. A conjuntivite cicatrizante crônica tem diferentes etiologias, sendo necessária a diferenciação da MMP da SSJ, sarcoidose, neoplasia escamosa ocular e pseudopenfigóide, pois a primeira requer imunossupressão sistêmica ^3,4. Além disso, a MMP é uma doença potencialmente cegante, em que os pacientes geralmente se apresentam tardiamente e são diagnosticados erroneamente inicialmente ^1,2,5. Apenas o envolvimento ocular sem envolvimento sistêmico pode ser visto em 27,4% dos pacientes com MMP ocular⁶. O diagnóstico de MMP requer uma biópsia conjuntival para mostrar a presença de autoanticorpos na membrana basal ^2,5. A imunofluorescência direta (IFD) é uma ferramenta diagnóstica fundamental para identificar doenças autoimunes que afetam a conjuntiva, como a MMP. A IFD ajuda a detectar a deposição in situ de imunoglobulinas e componentes do complemento na zona da membrana basal (ZMB), uma característica da MMP. As taxas de positividade para DIF variam de 30% a 80%^1,5. No entanto, alguns pacientes podem ter uma biópsia negativa, especialmente aqueles com MMP apenas ocular, mas a documentação clínica da progressão da doença é tratada de forma semelhante aos casos de MMP ocular positiva para biópsia ^7,8. Assim, Dart et al. enfatizaram a necessidade de critérios diagnósticos separados para MMP apenas ocular⁸.

As razões propostas para a baixa taxa de positividade entre os estudos são doença avançada com cicatrizes extensas na superfície ocular, técnicas inadequadas de processamento ou coloração de tecidos e uma variante da doença negativa para biópsia 8,9,10,11. Uma análise retrospectiva de biópsias de 27 pacientes com suspeita de MMP ocular revelou apenas uma taxa de positividade de 30%, e 63,7% tinham apenas envolvimento ocular¹². O DIF requer um protocolo específico; nem todo laboratório de diagnóstico está sintonizado com isso. Existem diferenças quanto ao local da biópsia, se a biópsia deve ser realizada de um ou ambos os olhos, e as soluções de transferência de amostra 13,14,15. Em uma análise retrospectiva das biópsias conjuntivais em nosso centro, a taxa de positividade para IFD foi de 54,1%, com mais positivos quando biopsiados bilateralmente (59% vs. 45%)⁸. Embora uma biópsia seja crítica, os sinais clínicos e a cicatrização progressiva da superfície ocular ajudam a garantir o diagnóstico de MMP. É mais fácil diagnosticar quando um sítio extraocular está envolvido, como oral ou cutâneo, relatado em 40% e 18% dos pacientes, respectivamente⁵.

Existem variações na literatura existente, e o protocolo aqui apresentado pode servir como um guia de referência com modificações introduzidas para reduzir a necessidade de um meio de transferência exclusivo¹⁴. As biópsias são transferidas em um meio de temperatura de corte ideal (OCT) e congeladas no mesmo cartucho de transferência no laboratório de patologia, evitando a necessidade de um meio de transferência adicional. O presente artigo descreve a metodologia para coloração DIF de tecido conjuntival, coleta de tecido e protocolo de transferência de amostra.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do comitê de ética em pesquisa humana do LV Prasad Eye Institute.

1. Técnica de biópsia conjuntival

1. Planeje a biópsia de ambos os olhos do paciente com suspeita de penfigoide sob anestesia tópica ou local e microscópio cirúrgico.
2. Obtenha o consentimento informado do paciente e liste os possíveis efeitos colaterais de sangramento, cicatrizes e a necessidade de iniciar esteróides tópicos após a cirurgia.
3. Coloque 1-2 gotas de proparacaína a 0,5% em ambos os olhos e aguarde 5 minutos antes de iniciar o procedimento.
4. Certifique-se de que o paciente não sinta dor ao tocar a conjuntiva com uma pinça fina. Se o paciente ainda sentir dor após a aplicação tópica de proparacaína, injete 0,2 mL de lidocaína subconjuntival a 2% com uma seringa de tuberculina de 1 mL.
5. Coloque um espéculo no olho direito ou esquerdo, o que for escolhido primeiro.
6. Examine a superfície ocular em busca de áreas de cicatrizes e queratinização. Selecione a área da biópsia que não está envolvida e não está com cicatrizes ou queratinizada.
   NOTA: Neste estudo, a conjuntiva bulbar superior afastada do limbo é preferida como local da biópsia, seguida pela conjuntiva bulbar inferior.
7. Use a pinça de Lim para levantar a esclera da conjuntiva e excise linearmente com a tesoura de Westcott, medindo 4-5 mm de comprimento e 2-3 mm de largura.
8. Transfira toda a biópsia imediatamente para um meio de corte ideal (OCT).
   NOTA: Pode-se transferir biópsias em solução salina normal ou em meio de transporte de Michel.
9. Pegue um cartucho e um molde de tecido plástico com um poço no centro, limpe-o com solução salina e seque-o ao ar.
10. Encha o cartucho com meio OCT separadamente para o olho direito e esquerdo. Mergulhe o tecido conjuntival excisado no meio OCT e envie-o para a patologia.
11. Repita os passos semelhantes para o lado contralateral também.

2. Transferência do tecido

1. Incorpore as amostras de biópsia da conjuntiva em um meio OCT para preservar a arquitetura do tecido e a antigenicidade se recebidas no meio de transporte de Michel ou solução salina normal.
2. Congele rapidamente as amostras incorporadas usando nitrogênio líquido ou gelo seco e armazene a -80 °C durante a noite.

3. Preparação e seccionamento de tecidos

1. Corte o tecido congelado em fatias de 4-6 μm (7 em número) usando um criostato a -20 °C a -25 °C.
2. Monte as seções em lâminas de microscópio revestidas de polilisina carregadas positivamente para garantir a adesão e armazene a -80 °C até a coloração em papel alumínio.

4. Coloração imunofluorescente

1. Descongele as lâminas à temperatura ambiente (RT) por 10 min e fixe em acetona fria (100%) por 10 min para preservar os antígenos e evitar danos aos tecidos.
2. Enxágüe com 1x PBS três vezes, de cada vez por 5 min para remover o excesso de meio OCT e acetona.
3. Aplique anticorpos conjugados anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM e anti-C3 diluídos (Fibrinogênio-1:10 [controle positivo], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) sobre lâminas.
   NOTA: Os anticorpos são diluídos em 1x PBS.
4. Para controles negativos, pule a aplicação de anticorpos conjugados e siga as etapas restantes mencionadas abaixo.
5. Siga as diretrizes do fabricante para diluir os anticorpos e padronize com controles positivos e negativos conhecidos.
6. Incubar as lâminas numa câmara humidificada a 37 °C durante 45-60 min.
7. Lave as lâminas com PBS (3× por 5 min cada) para remover os anticorpos não ligados.
8. Contracoloração com meio de montagem contendo DAPI (4',6 -diamidino-2-fenilidola) para visualização nuclear.
9. Coloque uma lamínula sobre as lâminas e deixe-as curar por 20 min.
10. Examinar as lâminas utilizando um microscópio de fluorescência equipado com filtros adequados para os fluoróforos utilizados (filtro verde de excitação para 488 nm).
11. Documente as descobertas com micrografias digitais.

5. Ácido periódico rápido - coloração de Schiff

1. Preparação de ácido periódico Schiff (PAS)
   1. Dissolva 1 g de fuschin básico em 100 mL de água destilada quente.
   2. Adicione 10 mL de ácido clorídrico e 2 g de dissulfito de potássio para descolorir o corante.
   3. Após o resfriamento, adicione 0,5 g de carvão ativado, mexa e filtre a solução para obter o reagente de Schiff ácido periódico claro. Armazene em uma garrafa escura.
      NOTA: Para testar o reagente de Schiff, despeje 10 mL de formalina a 37% em um vidro de relógio e adicione algumas gotas de Schiff para ser testado. Um bom reagente de Schiff rapidamente ficará vermelho-púrpura. Um reagente de Schiff em deterioração causará uma reação retardada e o produto será um azul-púrpura profundo.
2. Técnica de coloração PAS
   1. Hidrate as lâminas em água.
   2. Oxidar em solução de ácido periódico a 0,5% por 5 min.
   3. Enxágüe em água destilada.
   4. Coloque no reagente de Schiff por 15 min (as seções parecem rosa claro durante esta etapa)
   5. Lave em água morna da torneira por 5 min (as seções ficam rosa escuro).
   6. Contracoloração na hematoxilina de Mayer por 1 min.
   7. Lave em água da torneira por 5 min.
   8. Desidrate as lâminas nas seguintes soluções: Uma vez em álcool etílico a 80% por 1 min, duas vezes em álcool etílico a 90% por 1 min, duas vezes em álcool etílico a 100% por 1 min.
   9. Desidrate as lâminas três vezes em xileno por 1 min cada.
   10. Coloque uma lamínula sobre os slides usando um meio de montagem sintético (por exemplo, montagem DPX)
   11. Observe os resultados do PAS sob o microscópio de campo claro.

Resultados

A interpretação da IFD requer a confirmação da presença da membrana basal nos cortes teciduais (Figura 1). Nas lâminas coradas com PAS, a membrana basal aparecerá como uma membrana rosa brilhante situada na região basal do epitélio conjuntival (Figura 1C). A continuidade e a arquitetura da membrana basal também devem ser comentadas. A positividade da IFD será vista como MO verde brilhante (Figura 1B), indicando a deposição de IgM (<...

Discussão

A técnica de biópsia conjuntival aqui descrita utiliza o meio OCT como meio de transferência, evitando a necessidade de um meio de transferência adicional e evitando o manuseio da biópsia para transferi-lo para o meio OCT para criossecção. Um molde de cartucho de plástico preenchido com meio e biópsia é congelado diretamente para fazer blocos de tecido e depois seccionado. As vantagens da OCT são que ela congela rapidamente com danos mínimos causados pela formação de cristais e encapsula...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 N ácido clorídrico	Finar  química Limited	7647-01-0
Acetona	Qualigens	Pergunta 33517
Albumina	DAKO	F0117
Fucsina básica	Qualigens	Pergunta 39402
C3c	Biossistemas de Diagnóstico	F003
C4c	Biossistemas de Diagnóstico	F005
Cartucho	Policiências	25376-500
Carvão ativado	Sigma	C-5260
Criostato	Leica	CM1860UV
Lâminas criotomos	Leica	818
DAPI	Abcam	ab104139
Fibrinogênio	Biossistemas de Diagnóstico	F006
Microscópio de fluorescência	Olimpo	CX43
Fórceps	Joja cirúrgico	JS1528A
Câmara de Umidade	Biossistemas de Diagnóstico	SM365
IgA	Biossistemas de Diagnóstico	F007
IgG	Biossistemas de Diagnóstico	F008
Grão-mestre	Biossistemas de Diagnóstico	F009
Lâminas de vidro adesivas IHC	Tomo	33140455
Fórceps de Lim	Autódromo	S-7223
Meio tansport de Michel	Fisher Scinitics	NC0253304
Vidro de cobertura microscópico	Estrela azul	https://www.bluestarslides.com
OCT Médio	Criomatriz	6769006
PBS	DAKO	DM831
Ácido periódico	Sigma	375810-25G
Dissulfito de potássio	Sigma	Pág. 2522-500G
Proparacaína 0,5%	Sunway Private	G / 1118A
Tesoura de Westcott	Pillig Instrumentos Cirúrgicos	423480