Artigo de método

Técnica de Biópsia Conjuntival e Imunofluorescência Direta para Diagnóstico de Penfigoide de Membrana Mucosa

DOI:

10.3791/68303

⸱

17 de junho de 2025

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1Prof. Krothapalli Ravindranath Ophthalmic Research Biorepository, LV Prasad Eye Institute, 2Brien Holden Centre for Eye Research (BHERC), LV Prasad Eye Institute

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para coleta e processamento de biópsia conjuntival para identificar penfigóide de membrana mucosa.

Resumo

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O penfigoide da mucosa ocular (MMP) apresenta-se como conjuntivite cicatrizante crônica que, se não tratada, pode causar cegueira. O diagnóstico oportuno e a terapia imunossupressora previnem a progressão da doença. A coloração direta por imunofluorescência (IFD) da biópsia conjuntival para deposição de imunocomplexos na membrana basal é diagnóstica de MMP. A taxa de positividade da biópsia depende das características da biópsia, lateralidade, idade avançada e atividade da doença. O artigo de métodos atuais descreve a técnica de coleta da biópsia conjuntival e o uso de cartuchos de temperatura de corte ideal para transferência de amostras e preparação de blocos. Uma biópsia é realizada em uma região não cicatrizada, não envolvida ou relativamente menos envolvida da conjuntiva em ambos os olhos. O tamanho usual da biópsia é de 4-5 mm de comprimento, 2-3 mm de largura e deve ter um pequeno tecido subconjuntival subjacente para que a membrana basal não seja perdida. Recomendamos a realização da coloração com ácido periódico de Schiff para confirmar a presença da membrana basal. Usando um protocolo especificado, as criosseções de biópsias são coradas com anticorpos conjugados fluorescentes IgG, IgM, IgA e fatores de complemento C3c e C4c. Uma biópsia positiva mostra a fluorescência verde positiva na membrana basal e, mesmo que um dos anticorpos seja positivo, é positivo para MMP. Uma biópsia negativa não descarta penfigoide; no entanto, um positivo confirma a MMP e a diferencia da conjuntivite cicatrizante induzida por drogas ou pseudopenfigóide.

Introdução

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O penfigoide de mucosa (MMP) é uma doença conjuntival cicatrizante crônica de etiologia autoimune e acomete as membranas mucosas do organismo 1,2. A conjuntivite cicatrizante crônica tem diferentes etiologias, sendo necessária a diferenciação da MMP da SSJ, sarcoidose, neoplasia escamosa ocular e pseudopenfigóide, pois a primeira requer imunossupressão sistêmica 3,4. Além disso, a MMP é uma doença potencialmente cegante, em que os pacientes geralmente se apresentam tardiamente e são diagnosticados erroneamente inicialm....

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Protocolo

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O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do comitê de ética em pesquisa humana do LV Prasad Eye Institute.

1. Técnica de biópsia conjuntival

  1. Planeje a biópsia de ambos os olhos do paciente com suspeita de penfigoide sob anestesia tópica ou local e microscópio cirúrgico.
  2. Obtenha o consentimento informado do paciente e liste os possíveis efeitos colaterais de sangramento, cicatrizes e a necessidade de iniciar esteróides tópicos após a cirurgia.
  3. Coloque 1-2 gotas de proparacaína a 0,5% em ambos os olhos e aguarde 5 minutos antes de i....

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Resultados

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A interpretação da IFD requer a confirmação da presença da membrana basal nos cortes teciduais (Figura 1). Nas lâminas coradas com PAS, a membrana basal aparecerá como uma membrana rosa brilhante situada na região basal do epitélio conjuntival (Figura 1C). A continuidade e a arquitetura da membrana basal também devem ser comentadas. A positividade da IFD será vista como MO verde brilhante (Figura 1B), indicando a deposição de IgM (<.......

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Discussão

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A técnica de biópsia conjuntival aqui descrita utiliza o meio OCT como meio de transferência, evitando a necessidade de um meio de transferência adicional e evitando o manuseio da biópsia para transferi-lo para o meio OCT para criossecção. Um molde de cartucho de plástico preenchido com meio e biópsia é congelado diretamente para fazer blocos de tecido e depois seccionado. As vantagens da OCT são que ela congela rapidamente com danos mínimos causados pela formação de cristais e encapsula.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos à Hyderabad Eye Research Foundation, Índia, por apoiar este estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 N ácido clorídrico Finar  química Limited 7647-01-0
Acetona QualigensPergunta 33517
AlbuminaDAKOF0117
Fucsina básicaQualigensPergunta 39402
C3cBiossistemas de Diagnóstico F003
C4cBiossistemas de Diagnóstico F005
CartuchoPoliciências25376-500
Carvão ativado SigmaC-5260
Criostato Leica CM1860UV 
Lâminas criotomos Leica 818
DAPIAbcam ab104139
FibrinogênioBiossistemas de Diagnóstico F006
Microscópio de fluorescênciaOlimpoCX43
Fórceps Joja cirúrgicoJS1528A
Câmara de Umidade Biossistemas de Diagnóstico SM365
IgABiossistemas de Diagnóstico F007
IgGBiossistemas de Diagnóstico F008
Grão-mestreBiossistemas de Diagnóstico F009
Lâminas de vidro adesivas IHC Tomo 33140455
Fórceps de LimAutódromo S-7223
Meio tansport de MichelFisher Scinitics NC0253304
Vidro de cobertura microscópicoEstrela azulhttps://www.bluestarslides.com
OCT Médio Criomatriz 6769006
PBS DAKODM831
Ácido periódicoSigma375810-25G
Dissulfito de potássioSigmaPág. 2522-500G
Proparacaína 0,5%Sunway Private G / 1118A
Tesoura de WestcottPillig Instrumentos Cirúrgicos423480

Referências

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  1. Jain, N., Jakati, S., Shanbhag, S. S., Basu, S. Direct immunofluorescence findings and factors affecting conjunctival biopsy positivity in ocular mucous membrane pemphigoid. Cornea. 43 (2), 159-165 (2024).
  2. Vazirani, J., et al.

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Etiquetas

Conjuntivite CicatrizanteMembrana BasalColora o PASMicroscopia de Fluoresc nciaSeccionamento em CriostatoDeposi o de ImunoglobulinasPrepara o de Amostras

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