Interfaces elétricas e optoeletrônicas bidirecionais em corações de ratos ex vivo saudáveis e isquêmicos

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação avançada de materiais e métodos ex vivo de coração de rato para biointerface bidirecional óptica e elétrica, permitindo estimulação cardíaca precisa, gravação e modelagem de infarto para pesquisa em bioeletrônica.

Resumo

Os estudos eletrofisiológicos são fundamentais para explorar as interações entre materiais e biointerfaces cardíacas. Avanços recentes introduziram vários novos materiais condutores e semicondutores para interfaces bidirecionais com modelos cardíacos, facilitando a estimulação de baixa intensidade ao lado de registros de alta espaço-temporal e alta relação sinal-ruído (SNR). O modelo de coração de roedor ex vivo serve como uma plataforma eficaz para validar as funcionalidades de novos materiais e dispositivos, unindo descobertas in vitro a insights translacionais, minimizando preocupações éticas e administrativas. Neste protocolo, detalhamos o isolamento e a perfusão ex vivo de corações de ratos adultos usando um aparelho de Langendorff, estabelecendo estimulação bidirecional precisa e registro com semicondutores e condutores de alto desempenho, incluindo silício nanoporoso, carbono nanoporoso e matrizes de microeletrodos flexíveis em forma de malha. Além disso, apresentamos um modelo de infarto do miocárdio induzido por lesão de isquemia-reperfusão (I/R), avaliado por meio de registro e mapeamento multicanal, bem como coloração de infarto, permitindo estudos relevantes para doenças cardíacas e potenciais explorações terapêuticas. Essa metodologia oferece informações valiosas sobre a pesquisa de interface materiais-bio e o desenvolvimento de bioeletrônica cardíaca de última geração.

Introdução

O campo da bioeletrônica cardíaca está avançando rapidamente, impulsionado pela necessidade de desenvolver materiais e dispositivos que permitam comunicações bidirecionais precisas e eficientes com o coração 1,2,3,4. Os estudos eletrofisiológicos desempenham um papel fundamental nesse esforço, fornecendo insights críticos sobre como os materiais interagem com as biointerfaces cardíacas por meio de modulação e detecção. Embora os modelos in vitro, como linhagens celulares HL-1 cultivadas e cardiomiócitos primários de roedores, ofereçam um ambiente controlado para avaliações iniciais 5,6,7,8, sua simplicidade muitas vezes falha em replicar as condições complexas e dinâmicas de um coração vivo. Esses modelos não possuem a arquitetura 3D do coração, crucial para a condução elétrica coordenada e a geração de força mecânica, e não podem imitar ciclos rítmicos de contração-relaxamento ou dinâmica de perfusão crítica para o fornecimento de oxigênio e nutrientes⁹. Por outro lado, os modelos in vivo fornecem os insights fisiologicamente mais relevantes, mas apresentam desafios éticos, administrativos e técnicos significativos, incluindo a necessidade de treinamento extensivo, configurações cirúrgicas sofisticadas e conformidade com estruturas regulatórias rigorosas¹⁰.

Para preencher essa lacuna, modelos de coração ex vivo, como o coração de rato adulto perfundido por Langendorff, oferecem uma alternativa convincente à pesquisa científica^11,12. Esses modelos combinam a relevância fisiológica dos sistemas in vivo com a controlabilidade e acessibilidade das configurações in vitro. Ao isolar o coração e mantê-lo em um estado funcional, o aparelho de Langendorff permite que os pesquisadores realizem estudos de alta fidelidade sobre eletrofisiologia cardíaca sob condições controladas com precisão. A ausência de variáveis sistêmicas, como entradas neurais e hormônios circulantes, simplifica a interpretação dos resultados, preservando aspectos-chave da fisiologia cardíaca. Além disso, os modelos ex vivo mitigam muitas preocupações éticas e reduzem a carga de recursos, tornando-os uma plataforma versátil e prática para pesquisa translacional¹³.

Além de seu potencial translacional, este protocolo estabelece uma referência para a avaliação de desempenho de materiais. Ao incorporar estratégias materiais representativas, como plataformas optoeletrônicas para fotoestimulação sem fio e sistemas eletrônicos para estimulação e registro com fio, estabelece uma estrutura reprodutível para estudos comparativos. Essa padronização não apenas facilita a inovação, mas também aumenta a reprodutibilidade e a confiabilidade das descobertas entre os grupos de pesquisa. No passado, muitos fotoeletrodos e eletrodos de alto desempenho se mostraram muito promissores para estudos bioelétricos, como PEDOT: PSS¹⁴, MXene¹⁵, óxidos de irídio¹⁶, platina¹⁷, molibdênio¹⁸, silício 19,20,21, pontos quânticos 22,23,24 e semicondutores orgânicos²⁵. Aqui, este protocolo apresenta materiais representativos e de última geração, incluindo silício nanoporoso²⁶, carbono nanoporoso²⁷ e matrizes de multieletrodos de ouro (MEAs) semelhantes a malha flexível ^{28 , 29} , integrando-se ao protocolo para demonstrar suas capacidades em interfaces cardíacas bidirecionais. Esses materiais permitem estimulação supralimiar de baixa intensidade, alta resolução espaço-temporal e altas gravações de SNR, mostrando seu potencial para o avanço da bioeletrônica cardíaca. Além disso, a inclusão de um modelo de infarto do miocárdio induzido por lesão de I/R fornece uma estrutura robusta para estudos relevantes para a doença e explorações terapêuticas.

Este trabalho apresenta métodos detalhados para fabricação e aplicação de materiais avançados para fotoestimulação sem chumbo e estimulação elétrica e sensoriamento com corações de ratos ex vivo (Figura 1A). As membranas de silício nanoporoso foram fabricadas por meio de padrões de fotolitografia, condicionamento iônico reativo (RIE) e liberação de ácido fluorídrico tamponado (HF) de wafers de silício sobre isolador (SOI) com uma camada de dispositivo de 5 μm, seguida de coloração e transferência para membranas macias de polidimetilsiloxano (PDMS)²⁶. Para estimulação elétrica e registro, o carbono nanoporoso foi desenvolvido por ablação a laser de substratos de celulose incubados com sal, seguida de transferência de fase aquosa e laminação por calor, oferecendo melhor capacidade de armazenamento e injeção de carga em comparação com os eletrodos de ouro tradicionais²⁷. Além disso, MEAs flexíveis foram fabricados em wafers de Si revestidos com poliimida usando fotolitografia, metalização de feixe eletrônico, gravura, encapsulamento e processos de liberação para permitir o registro e mapeamento epicárdico espacialmente resolvido^28,29.

Além da fabricação, o protocolo fornece um protocolo passo a passo para isolamento, perfusão, monitoramento e interface do coração de ratos adultos com dispositivos ópticos e elétricos. Os dispositivos foram testados em corações isolados, demonstrando resultados representativos na estimulação e registro para avaliação eletrofisiológica. Este protocolo também apresenta um método para a criação de um modelo de infarto do miocárdio por meio de I/R, validado por registros fisiológicos, colorações e avaliações morfológicas. Essa metodologia abrangente estabelece uma estrutura reprodutível para avaliar materiais e dispositivos em biointerfaces cardíacas. A Figura 1B-D descreve os fluxos de trabalho de fabricação de materiais para avaliação neste modelo cardíaco ex vivo. A Figura 2A-C demonstra os resultados esperados em fotos dos dispositivos fabricados.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago (número de protocolo 72378).

1. Fabricação de membranas de silício nanoporoso (Figura 1B, Figura 2A, Figura 3)

1. Projete o padrão de fotomáscara no software AutoCAD (Figura 3). Certifique-se de que o tamanho do dispositivo corresponda à escala de comprimento do alvo biológico. Para o coração de rato, use um tamanho de dispositivo de 2 a 10 mm. No projeto, adicione pequenas matrizes de orifícios de 20 a 100 μm de diâmetro para facilitar a liberação da camada do dispositivo de Si em HF tamponado. Faça os três orifícios grandes de 200 a 1000 μm de diâmetro, formando uma letra quiral L para ajudar a identificar o lado correto da membrana.
2. Limpe o wafer SOI com acetona e álcool isopropílico (IPA) por 3 min cada no banho ultrassônico. Execute o cozimento por desidratação a 200 °C por 20 min na placa quente.
3. Gire a camada espessa de resistência positiva AZ40XT-11D a 3000 rpm por 45 s, assando a 115 ° C por 3 min. Tenha cuidado para não derramar muito fotorresistente no wafer. Após o revestimento giratório, limpe os resíduos na parte de trás do wafer usando cotonetes de acetona.
   NOTA: AZ40XT-11D é um fotorresistente positivo muito viscoso.
4. Use o gravador direto Heidelberg MLA150 para expor o padrão fotorresistente a 375 nm e uma dose de 800 mJ/cm². Execute o cozimento pós-exposição a 110 ° C por 2 min.
5. Desenvolva o padrão no revelador AZ 300MIF por 2 min. Enxágue o wafer com água deionizada (DI) por 60 s e depois seque com ar N₂ .
6. Gravar o SOI descoberto usando um processo RIE SF₆ / CHF₃ (20 sccm: 50 sccm) por 12 min usando plasma indutivamente acoplado a 600 W e uma radiofrequência de 60 W em um gravador de flúor de plasma indutivamente acoplado com uma pressão de câmara de 10 mT, resultando em uma taxa de condicionamento de cerca de 660 nm / min.
7. Descasque o fotorresistente usando AZ NMP em um banho ultrassônico a 80 ° C por 10 min e limpe o wafer em um banho ultrassônico por 3 min em acetona, seguido por 3 min em IPA e seco com nitrogênio comprimido.
8. Mergulhe a amostra em HF tamponado à temperatura ambiente para eliminar as camadas de óxido enterradas. O dispositivo é liberado em 4 - 8 h. Aumente ligeiramente a temperatura da solução (40 °C) para facilitar a liberação.
9. Transfira cuidadosamente as membranas liberadas com papel de filtro de 1 cm x 1 cm para dois banhos-maria DI separados sequencialmente para remover qualquer HF residual.
   NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. Mergulhe a membrana em um banho IPA para armazenamento a 4 °C.
10. Transfira a membrana usando papel de filtro para uma placa de Petri com água deionizada (DI). A membrana flutuará na superfície da água devido à hidrofobicidade e tensão superficial.
    NOTA: As membranas de silicone podem se mover rigorosamente do IPA para a água devido ao efeito Marangoni³⁰.
11. Em uma placa de Petri separada, faça a solução de coloração contendo uma proporção de volume de 100:1 de HF concentrado e ácido nítrico concentrado (por exemplo, 10 mL de HF e 0,1 mL de HNO₃). Misture bem antes de gravar.
12. Transfira a membrana com papel de filtro para a solução de condicionamento de manchas e condicione por 30 s. Preste atenção ao lado da membrana de Si observando a orientação da letra L formada pelos três orifícios principais. A membrana de Si deve flutuar no corrosivo, onde apenas um lado da membrana é gravado.
13. Transfira a membrana com papel de filtro para dois pratos de água DI separados para lavar o resíduo HF.
    NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. Transferir a membrana para IPA para conservação a 4 °C.
14. Faça um substrato de suporte com PDMS fino. Misture a parte A (polímero base) e a parte B (agente de cura) em uma proporção de peso de 10:1 e desgaseifique por 30 min.
15. Camada de sacrifício de revestimento giratório de PMMA (495 A6) em lâmina de vidro a 2.000 rpm por 45 s. Asse a 180 °C por 60 s.
16. Spin coat PDMS a 4.500 rpm por 45 s no vidro revestido com PMMA, o que deve resultar em 10 - 20 μm de espessura. Catalise em forno ou placa de aquecimento a 80 °C durante 2 h.
    NOTA: Para mitigar danos mecânicos, o PDMS foi usado como um substrato macio para acomodar as membranas de silício nanoporosas, fornecendo proteção contra possíveis danos causados pelo manuseio direto com pinças.
17. Transfira a membrana de Si gravada com coloração de IPA para PDMS. Use um lenço de papel limpo para remover o excesso de IPA, e a membrana de Si se fixará firmemente ao PDMS depois que o IPA evaporar. Preste atenção ao lado da membrana de Si identificando a orientação da letra L formada pelos três orifícios principais. O Si poroso gravado deve estar voltado para fora e o Si não gravado deve interagir com o PDMS.
18. Corte o PDMS circunferencialmente usando uma lâmina de barbear que contenha a membrana de Si. Deixe espaço suficiente e tome cuidado para não danificar a membrana de Si.
19. Mergulhe o dispositivo em acetona até que o Si/PDMS seja liberado. Evite ficar de molho por muito tempo, pois pode causar inchaço da PDMS. Enxágue com água DI e seque com N₂. Realize o tratamento com plasma de O₂ a 400 W por 10 min.

2. Fabricação de matrizes de microeletrodos flexíveis (Figura 1C, Figura 2B, Figura 4)

1. Projete a estrutura de MEAs flexíveis no AutoCAD (Figura 4). Introduzimos dois designs diferentes com a mesma área de projeção do eletrodo, mas diferentes estruturas de substrato (Figura 2B, Figura 4).
2. Limpe o substrato de wafer de silício em acetona e IPA por 3 min cada em um banho ultrassônico.
   NOTA: Este protocolo não requer tratamento de superfície adicional para aumentar a adesão entre a poliimida (PI) e o wafer de Si para facilitar a liberação do dispositivo. O tratamento com plasma de oxigênio pode ser usado para melhorar a adesão, se necessário.
3. Despeje 4 mL da solução precursora de PI de poli (dianidrido-co-4,4′-oxidianilina piromelítica) no wafer. Gire o wafer a 1.500 rpm por 45 s. Use NMP ou acetona para remover o precursor na parte de trás do wafer.
4. Pré-asse a 110 °C por 3 min, depois a 180 °C por 3 min. Cure o wafer revestido com PI no forno de resistência com um modo de perfil. Comece em temperatura ambiente, aqueça até 250 °C na taxa de rampa de 4 °C/min e mantenha por 30 min. Em seguida, aqueça o wafer a 350 °C na taxa de rampa de 2,5 °C/min e mantenha a 350 °C por 60 min, depois esfrie lentamente até RT. O resultado é um filme PI de aproximadamente 5 μm de espessura.
5. Gire o wafer revestido com PI com AZ nlof 2020 a 2.000 rpm por 45 s. Asse o wafer a 110 °C por 2 min. Use o gravador direto Heidelberg MLA150 para expor o padrão fotorresistente a 375 nm e uma dose de 200 mJ/cm².
6. Execute o cozimento pós-exposição a 110 ° C por 2 min. Desenvolva o padrão no AZ 300MIF Developer por 1 min. Enxágue o wafer com água DI por 60 s e depois seque com ar N₂ .
7. Deposite 10 nm de titânio e 200 nm de ouro usando um evaporador de feixe eletrônico. Descasque o fotorresistente usando AZ NMP em banho de 80 °C por 3 h e limpe o wafer em um banho ultrassônico por 3 min em acetona, seguido de 3 min em IPA e seco com nitrogênio comprimido.
8. Gire a camada de resistência positiva espessa AZ40XT-11D a 3.000 rpm por 45 s. Limpe o fotorresistente na parte de trás do wafer usando acetona. Asse o wafer a 115 °C por 3 min.
9. Use o gravador direto Heidelberg MLA150 para expor o padrão fotorresistente a 375 nm e uma dose de 800 mJ/cm². Execute o cozimento pós-exposição a 110 ° C por 2 min.
10. Desenvolva o padrão no AZ 300MIF Developer por 3 min. Enxágue o wafer com água DI por 60 s e depois seque com ar N₂ .
11. Condicione o PI descoberto usando um processo RIE SF₆ / CHF₃ (20 sccm: 50 sccm) por 20 min com plasma indutivamente acoplado a 600 W e uma radiofrequência de 60 W em um gravador de flúor de plasma indutivamente acoplado com uma pressão de câmara de 10 mT.
12. Descasque o fotorresistente usando AZ NMP em banho de 80 ° C por 10 min e limpe o wafer com sonicação suave por 3 min em acetona, seguido de 3 min em IPA e seco com nitrogênio comprimido.
    NOTA: Use ultrassom de baixa potência para evitar que o dispositivo se desconecte. Evite a sonicação se o IP mostrar sinais de descolamento.
13. Processe o wafer em um forno de hexametildisilazana (HMDS) para aplicar o tratamento HMDS. Spin coat SU-8 2002 a 2.000 rpm por 45 s. Isso resulta em uma espessura SU8 de aproximadamente 2,5 μm.
14. Asse o wafer a 95 °C por 20 min. Use o gravador direto Heidelberg MLA150 para expor o padrão fotorresistente a 375 nm e uma dose de 950 mJ/cm².
15. Desenvolva o padrão no SU-8 Developer por 1 min. Enxágue com água IPA e DI e seque com gás N₂ . Se aparecerem manchas brancas no wafer durante o enxágue do IPA, mergulhe o wafer no revelador SU8 até que as manchas brancas desapareçam.
16. Faça um cozimento duro a 160 ° C durante a noite. Use tempos de cozimento mais curtos (~ 30 min) para experimentos agudos. Não cozer a uma temperatura inferior a 150 °C ou superior a 200 °C. Retire o MEA flexível suportado por PI do substrato.

3. Fabricação de carbono nanoporoso (Figura 1D, Figura 2C, Figura 5)

1. Projete o padrão de filme de carbono no software de projeto (Figura 5).
   NOTA: Este método contém o protocolo de fabricação para dois tipos de eletrodos: eletrodo de estimulação à base de carbono nanoporoso e eletrodo de detecção.
2. Impregnar o papel de filtro em soluções aquosas de borato de sódio (0,15 M, pH 9,4) durante 1 h e depois secar a 60 °C durante a noite (figura 1D).
   NOTA: O papel de filtro Whatman de grau 1 serviu principalmente como substrato poroso à base de fibra representativo. O borato de sódio é incorporado às fibras de celulose após o processo de impregnação e secagem. O sal atua como catalisadores que facilitam a carbonização fotoquímica sob síntese a laser²⁷.
3. Realize a síntese do laser usando um laser de CO₂ com padrões pré-projetados (Figura 5A). Conduza a padronização no modo raster com parâmetros otimizados: potência = 1,8 W; velocidade = 1,6 cm/s; pontos por polegada = 1000.
4. Prepare o filme de tereftalato de polietileno (PET) com espessura de 50 μm e limpe o filme com acetona e álcool isopropílico (IPA) por 3 min cada no banho ultrassônico.
5. Deposite 5 nm de titânio e 100 nm de ouro usando um evaporador de feixe eletrônico. Aplique o procedimento de transferência de fase aquosa para transferir o MEA para o filme PET (12.5 μm).
   NOTA: A transferência em fase aquosa foi realizada usando dois processos consecutivos: separação em fase aquosa e transferência capilar.
6. Mergulhe os substratos de papel gradualmente em água DI para delaminação durante a separação da fase aquosa.
   NOTA: A energia de deformação induzida pelo inchaço da celulose facilitou a separação da membrana de carbono do substrato de suporte em menos de um segundo, fazendo com que ela flutuasse na superfície da água.
7. Use o substrato de suporte, por exemplo, filme PET, para transferir os padrões em meio aquoso durante a transferência capilar. Mergulhe o substrato em água e coloque-o em contato com uma extremidade da membrana de carbono desejada para formar uma linha de contato (a frente de transferência). Em seguida, segure o substrato com a mão e mova-o em uma direção inclinada ou vertical em baixa velocidade.
   NOTA: Para substratos de suporte hidrofóbicos, força externa ou tratamento com plasma de O₂ podem ser aplicados para auxiliar na formação da linha de contato.
8. Após a transferência, aplique aproximadamente 20 μL de solução de polímero de ácido perfluorossulfônico (PFSA) (com uma concentração de ~ 5% em uma mistura de álcoois alifáticos inferiores e água) nos padrões de carbono e deixe secar em condições de temperatura ambiente (23 ° C) e pressão (1 atm) para fixação.
9. Prenda o eletrodo de estimulação à base de carbono nanoporoso conectando-o a um fio de usando adesivo condutor de prata. Encapsule a junção exposta entre o fio de e o eletrodo com adesivo de silicone para garantir isolamento e estabilidade. Após uma cura de 3 h à temperatura ambiente, o eletrodo de estimulação está pronto para uso. O experimento pode ser pausado aqui.
10. Projete o padrão de carbono e MEA no AutoCAD (Figura 5B). Fabrique matrizes de microeletrodos 4 x 4 em um filme PI de 25 μm usando o procedimento de fotolitografia padrão, conforme descrito na etapa 2.
    NOTA: O filme PI pode ser criado através do precursor PI ou laminando o filme PI comercial em wafer de Si usando o fotorresistente AZ2020. O protocolo para fotolitografia e deposição de metal é o mesmo da etapa 2.
11. Crie uma membrana de carbono monolítica (2 cm x 2 cm) em um substrato de papel após a impregnação de sal e a escrita a laser, como nas etapas 3.1-3.3. Transfira o padrão de carbono para um filme de suporte PET pré-projetado usando um método padrão de transferência de fase aquosa, como nas etapas 3.6-3.9.
12. Aplicar uma solução de polietileno-co-acetato de vinilo (EVA) a 10% em peso em hexano sobre o padrão de carbono e aguardar a secagem em condições de temperatura ambiente (23 °C) e pressão (1 atm). Projete e corte a laser um modelo PET de 10 μm de espessura (com um revestimento de EVA na parte inferior) com 16 orifícios alinhados ao padrão MEA, servindo como camada de encapsulamento.
13. Alinhe o MEA, a camada de encapsulamento de PET e a membrana de carbono no suporte de PET. Pressione o conjunto usando um laminador quente comercial a uma temperatura de processamento de 120 °C para transferência e encapsulamento.
14. Resfrie o eletrodo sensor nanoporoso habilitado para carbono à temperatura ambiente, remova o resíduo e enxágue-o com etanol e água 3x antes de usá-lo.

4. Isolamento, perfusão e monitoramento do coração de ratos (Figura 6)

1. Prepare os ratos antes da extração do coração (Figura 6A). Este protocolo utilizou ratos machos CD/SD de 3 a 4 meses de idade, obtidos do rio Charles.
2. Prepare a solução de Tyrode de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES) dissolvendo os produtos químicos de acordo com a Tabela 1. Ajuste o pH para 7,2-7,4 com NaOH 2M. Pré-oxigenar borbulhando gás oxigênio por 0,5-1 h e continuar a oxigenação até o final dos experimentos.
3. Coloque três tubos de solução salina balanceada de Hanks (HBSS, sem cálcio, sem magnésio) no gelo. Prepare instrumentos cirúrgicos limpos (tesoura afiada, tesoura dobrada, dois hemostáticos, pinças afiadas, dois pares de pinças pequenas).
   NOTA: A cirurgia não se destina à sobrevivência, portanto, a esterilidade não é necessária.
4. Recolha ratos machos adultos com um peso entre 400 e 500 g no biotério. Administre 0,5 mL de heparina (1000 UI / kg) por via intraperitoneal na parte inferior do abdômen. Use luvas grossas para segurar o rato para proteção.
5. Agarre o rato pela parte superior das costas, de modo que o abdômen fique exposto. Segure o rato com firmeza, mas sem força excessiva para não machucar o animal. Injete a solução de heparina com rapidez e precisão. Aguarde 20-30 min. Prepare o aparelho Langendorff enquanto isso.
   NOTA: O rato pode ser anestesiado com antecedência para garantir a etapa de preparação adequada do procedimento cirúrgico.
6. Antes de reabastecer a solução de HEPES Tyrode, lave a bolsa de terapia intravenosa (IV) com água e seque-a completamente para garantir a composição final adequada. Encha o saco com a solução pré-oxigenada de HEPES Tyrode.
7. Ligue o termostato e a circulação de água no aparelho de Langendorff a 37 °C (Figura 6A). Prepare a cânula, sutura e coloque a placa de Petri na bolsa fria para seccionamento do tecido. Prepare a cânula com HBSS gelado antes de seccionar.
8. Prepare-se para realizar a toracotomia do rato (Figura 6B). Anestesiar o animal com isoflurano em uma configuração de campânula. Coloque 8 a 10 mL de isoflurano em um tubo de 50 mL cheio de gaze. Colocar o animal com o tubo aberto (com isoflurano) num recipiente.
9. Observe o progresso da anestesia testando o reflexo de pinça do dedo do pé. Os animais serão colocados sob anestesia e perderão a consciência dentro de 2-3 minutos. Monitore cuidadosamente a condição do rato e transfira-o para a placa cirúrgica imediatamente após perder a consciência. A anestesia prolongada pode resultar na morte do rato.
10. Transfira o animal para a placa de operação. Coloque-o de costas e coloque 5 mL de isoflurano em um tubo de 50 mL cheio de gaze sobre a boca do rato. Confirme a anestesia geral beliscando uma das patas. Continue somente se nenhuma resposta for anotada.
11. Prenda os braços superiores e inferiores à placa cirúrgica com agulhas. Faça uma incisão (~ 5 cm) para abrir a caixa torácica do rato logo abaixo do peito. Corte cuidadosamente o diafragma para expor o coração e os pulmões.
12. Corte as costelas de ambos os lados para abrir totalmente a caixa torácica e fornecer acesso completo. Prenda a caixa torácica no esterno usando um hemostático. Segure a veia cava abaixo do coração usando um hemostático. Remova o coração cortando sob o hemostático com uma tesoura cega dobrada o mais próximo possível da parte inferior da caixa torácica.
13. Transfira o coração para o HBSS gelado. Minimize a duração da etapa para evitar a interrupção prolongada do suprimento de oxigênio para o coração em contração.
14. Prepare-se para realizar a perfusão e o monitoramento de Langendorff. Encha a cânula e a placa de Petri completamente com HBSS gelado. Certifique-se de que não haja bolhas no sistema.
15. Transfira o coração para a placa de Petri pré-preenchida com HBSS para seccionamento. Usando uma pinça e tesoura, remova os pulmões e outros tecidos conjuntivos (Figura 6C).
    NOTA: A dissecção romba é recomendada para o procedimento de seccionamento para evitar qualquer dano potencial ao coração. Para seccionar tecidos adjacentes, use duas tesouras e rasgue cuidadosamente o tecido.
16. Localize a aorta pressionando o coração e traçando o caminho do sangue à medida que ele sai. Corte sob a primeira artéria ascendente e canule a aorta se o arco aórtico for preservado durante a extração (Figura 6D). Prenda a aorta à cânula com um nó duplo.
    NOTA: Evite inserir a cânula muito profundamente para garantir que a válvula permaneça fechada. Não posicione a sutura muito baixa, pois isso pode obstruir as artérias coronárias.
17. Preparar o aparelho de Langendorff com uma solução de trabalho pré-oxigenada. Abra o fluxo tampão e conecte a cânula ao aparelho (Figura 6E). Certifique-se de que não são introduzidas bolhas de ar. O coração começa a se contrair nesta etapa.
    NOTA: Inicialmente, algum tampão pode espirrar dos ventrículos, mas não é esperado vazamento excessivo. Ajuste a sutura conforme necessário para evitar vazamento de tampão. Nenhuma fibrilação cardíaca será observada nesta etapa se a cirurgia e o preparo forem conduzidos adequadamente.
18. Corte os átrios. Esvazie o balão antes de inseri-lo no ventrículo esquerdo e, em seguida, encha-o com água usando a seringa conectada.
19. Conecte as sondas BP-100 à linha de perfusão e aos balões cheios de água para monitorar a perfusão e a pressão ventricular esquerda (LVP), respectivamente (Figura 6F).
    NOTA: As sondas BP-100 precisam ser calibradas antes do uso. As bolhas nos balões precisam ser expelidas para garantir a detecção precisa da pressão.
20. Monitore a pressão tampão do HEPES Tyrode e a linha de base do LVP. Certifique-se de que a pressão do tampão seja mantida dentro da faixa ideal de 80-100 mmHg. Ajuste a PVE basal para aproximadamente 20 mmHg modificando o volume de água injetado no balão (Figura 6F).
21. Conecte os eletrodos de ECG. Aterre a cânula e posicione o eletrodo nas laterais, na parte superior ou no ápice com base na preferência (Figura 6F).
22. Amplificar todos os sinais (perfusão, pressão ventricular esquerda e ECG) usando um amplificador IA-400D e conectado a um computador usando um digitalizador com software Clampex (Figura 6F).

5. Criação de infarto do miocárdio usando o processo de IR (Figura 6G, Figura 7)

1. Encher a câmara aquecida com tampão HEPES Tyrode a 37 °C pré-aquecido. Mergulhe o coração no tampão dentro da câmara aquecida e ajuste a torneira para interromper o fluxo do tampão, induzindo isquemia global. Ajuste a duração da isquemia com base nos objetivos específicos do experimento.
2. Gire a torneira para restaurar o fluxo tampão para o coração após 30 min de isquemia, iniciando a reperfusão. Permita a reperfusão do coração por 45 minutos antes de encerrar o experimento de coloração para avaliar o tamanho do infarto (Figura 6G).
   NOTA: O tempo de isquemia ou reperfusão é determinado com base nos objetivos experimentais.
3. Verifique a indução de isquemia bem-sucedida observando a redução da frequência cardíaca e os padrões irregulares de ECG (Figura 7A). Arritmia ou fibrilação ventricular serão observadas.
4. Administre lentamente 10 mL de HBSS a 4 ° C através da porta lateral da torneira para prender o coração. Remova o coração da coluna de perfusão, corte qualquer tecido atrial restante e coloque o coração em uma matriz de corte de tecido.
5. Cubra a matriz com filme transparente e congele o coração a -80 °C por cerca de 8 min ou até atingir uma consistência de marshmallow. Remova a matriz de corte de tecido do freezer e insira lâminas de barbear para cortar o coração em seções de 2 mm de espessura.
6. Remova as fatias de tecido da matriz de corte uma a uma e armazene-as a -80 ° C até que sejam necessárias para experimentos bioquímicos.
7. Realize a coloração do infarto (Figura 7B). Incube as fatias de coração em 10 mL de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 1% p / v a 37 ° C por 30 min.
8. Transfira a fatia de tecido para formalina tamponada a 10% e deixe-a fixar em temperatura ambiente durante a noite. Para obter os melhores resultados, remova o coração da formalina e obtenha imagens do tecido em 24 horas. Minimize a exposição à luz durante esta etapa para evitar a degradação da mancha.
9. Fotografe a fatia corada e use um software como o ImageJ para estimar o tamanho do infarto.

6. Estabelecimento de interfaces optoelétricas bidirecionais entre dispositivos e tecido cardíaco (Figura 8, Figura 9)

1. Coloque a membrana optoeletrônica de silicone no local desejado para estimulação. A membrana de silicone se auto-liga ao epicárdio com força capilar (Figura 8A). Se a fixação for difícil, use adesivos de tecido úmido para ajudar na fixação.
   NOTA: Reduzir a taxa de perfusão pode reduzir a quantidade de água na superfície do coração, o que facilita a fixação. Uma vez fixada à superfície do coração, a membrana de silicone normalmente se liga à posição pré-determinada durante a operação.
2. Conecte os eletrodos aos sistemas RHD ou outras plataformas eletrofisiológicas para registro de dados. Os MEAs apresentam pads de E/S de 16 canais com passo de 0,5 mm em uma extremidade, que são conectados por meio de um conector de força de inserção zero (ZIF) a uma placa adaptadora. A placa adaptadora é então ligada ao headstage através de um conector Omnetics.
3. Coloque os MEAs flexíveis nas superfícies ventriculares do coração isolado do rato (Figura 8A). Coloque os MEAs dentro da janela se estiver usando uma membrana de silicone em forma de janela (Figura 8B).
4. Programe a fonte de laser de 635 nm com a frequência desejada (por exemplo, 4 Hz) e ciclo de trabalho (por exemplo, 0,4%, duração de pulso de 1 ms) usando sinais Transistor-Transistor Logic (TTL). Focalize o ponto do laser na membrana de silicone, com tamanho de ponto em torno de 1 mm. Use óculos de proteção contra laser. Comece com baixa intensidade para focar.
5. Inicie o protocolo de gravação e estimulação. Aumente gradualmente a intensidade do laser até que uma estimulação de substituição ininterrupta seja observada (Figura 8C).
   NOTA: Nos padrões deste protocolo, ele define a intensidade limite para que o laser permita 10 s de estimulação ininterrupta.
6. Programe o perfil do laser com diferentes durações de pulso para obter o perfil de intensidade versus duração para comparar o desempenho do dispositivo (Figura 8D). A configuração permite a gravação multicanal de ECG, TTL e LVP (Figura 8E).
7. Altere a localização da membrana de silício ou da localização do ponto de luz e repita as etapas 6.3-6.6 para estudar como diferentes locais de estimulação afetam as formas de onda estimuladas e a condução cardíaca (Figura 9A).
8. Identifique os picos de QRS estimulados de cada local de gravação para construir o mapa de isócrona ou atraso de ativação. Identifique o pico QRS mais antigo e defina esse local como atraso zero para traçar o mapa de atraso de ativação (Figura 9B-C).
   NOTA: Embora o mapa de atraso de ativação em ritmo sinusal (sem estimulação) possa servir de referência, seu padrão pode variar significativamente dependendo das condições cardíacas e da colocação da MEA^18,30. Os resultados são mais significativos quando uma fonte de estimulação clara, como estimulação externa, está presente.

7. Estabelecimento de interfaces elétricas bidirecionais entre dispositivos e tecido cardíaco (Figura 10)

1. Conecte os eletrodos de estimulação (0.5 cm x 0.5 cm) em uma configuração de dois eletrodos, colocando o eletrodo de trabalho na parede do ventrículo esquerdo enquanto o contra-eletrodo está na parede do ventrículo direito.
2. Forneça formas de onda de corrente quadrada (por exemplo, 1 mA, duração de pulso de 1 ms) através de um potenciostato até a estimulação bem-sucedida (Figura 10A-B). Realize testes para obter os gráficos de corrente de estimulação versus duração do pulso e tensão de estimulação versus duração do pulso para avaliar a eficácia da estimulação do material (Figura 10C-D).
3. Execute a gravação elétrica usando uma matriz de microeletrodos 4 x 4 (espaçamento de 2 mm entre os eletrodos) e gravada usando uma placa de interface USB RHD e headstage de gravação de entrada RHD de 16 canais. Registre os sinais a 10 kS/s na largura de banda de 0.1-100 Hz.
4. Meça o ruído de cada eletrodo de registro (Figura 10E). Calcular a SNR utilizando a seguinte equação (figura 10F):
   ou
   onde Sinal é a amplitude do sinal e o_ruído padrão é o desvio padrão dos níveis de ruído. Na gravação, o filtro de entalhe de 60 Hz está desativado para refletir os resultados brutos.
5. Realize análises adicionais e plote mapas isócronos da propagação elétrica usando Python.
6. Determine um carimbo de data/hora da deflexão de pico (complexo QRS estimulado) para cada contração e calcule a média de vários sinais. Use a interpolação gaussiana para renderização de mapas para melhorar a legibilidade.

Resultados

A eletrofisiologia de estimulação de uma ampla gama de materiais optoeletrônicos e eletrônicos pode ser validada com eficiência usando o sistema cardíaco ex vivo , que fornece uma configuração conveniente e controlada (Figura 1A). Materiais de alta injeção de carga, como silício poroso e carbono poroso, facilitam a modulação bioelétrica com baixa intensidade óptica e estimulação de baixa tensão, garantindo segurança e operação capacitiva com carga balanceada.

O silício nanoporoso exibe geração de fotocorrente significativamente maior em comparação com estruturas de silício convencionais, como junções pn ou pin (Figura 11A), devido à sua heterojunção²⁰ habilitada para porosidade, capacidade aprimorada de armazenamento de carga, impedância reduzida e melhor absorção óptica. Essas fotocorrentes predominantemente capacitivas permitem estimulação biossegura e balanceada^{por carga 31} (Figura 12A-B), alcançando estimulação óptica de corações de ratos ex vivo a 240 bpm com intensidade de luz de 0,51 mW / mm² e duração de pulso de 1 ms (Figura 8C), ou tão baixo quanto 0,167 mW / mm² com duração de pulso de 10 ms (Figura 11B) - valores comparáveis ou inferiores aos métodos optogenéticos e bem abaixo dos limites de segurança do laser^{31, 32}. Abaixo dessas intensidades, pode ocorrer captação parcial ou não de pulsos de luz. Em contraste, outros materiais, como membranas de silício p-i-n ou membranas de silício p-i-n decoradas com ouro, requerem intensidades ópticas significativamente mais altas para provocar estimulação (Figura 11B). A estimulação contínua com silício nanoporoso aumenta a contração mecânica, conforme indicado pela LVP elevada (Figura 8E). Além disso, em sua forma monolítica, o dispositivo demonstra injeção de fotocorrente de alta resolução espacial sob pulsos de luz localizados, permitindo estudos de estimulação multissite e potencial de acesso aleatório²⁶.

Em estudos bidirecionais de membrana de silício em forma de janela (Figura 3D, Figura 8B), a estimulação multissítio produz perfis distintos de registro de multieletrodos e padrões de condução cardíaca, validando a originalidade da propagação da onda de cada ponto de estimulação (Figura 9). Esse recurso destaca a capacidade do sistema de analisar vias complexas de condução cardíaca com alta precisão e a capacidade de diagnosticar condições cardíacas anormais, como infarto do miocárdio.

Os MEAs fabricados têm aproximadamente 10 μm de espessura, incorporando estruturas macroporosas ou interconexões serpentinas para minimizar a rigidez à flexão e aumentar a flexibilidade ou elasticidade (Figura 4) ^{33 , 34} . As matrizes consistem em 16 locais de gravação independentes dispostos em uma configuração 4 x 4, cobrindo uma área de 6 mm x 6 mm. Essas matrizes permitem o registro direto do sinal epicárdico em vários locais da superfície do coração. Uma gravação representativa de 16 canais é ilustrada na Figura 13. Mapas isócronos construídos a partir das gravações visualizam a condução elétrica através da superfície do coração, com ou sem estimulação localizada. A estimulação localizada geralmente induz atrasos na condução que anulam o ritmo sinusal intrínseco do coração ex vivo e as vias de condução (Figura 9B).

Os materiais de carbono nanoestruturados apresentam uma solução eficaz para melhorar o desempenho de dispositivos bioeletrônicos devido à sua alta capacidade de armazenamento de carga e baixa impedância (Figura 14). Nosso método de transferência a laser assistido por sal permite a padronização fácil e a transferência instantânea de dispositivos de carbono nanoporoso em substratos flexíveis ou eletrodos de Au tradicionais para melhorar o desempenho da bioeletrônica. A caracterização da impedância confirmou ainda que o revestimento de carbono reduziu substancialmente a impedância do eletrodo de Au em aproximadamente 2 ordens de magnitude, de 7244,4 Ω para 63,1 Ω na frequência de 100 Hz pertinente aos sinais de ECG (Figura 14A-B). A capacitância de Helmholtz do eletrodo de Au aumentou significativamente após o revestimento de carbono, de 0,025 mF/^cm2 para 1,98 mF/^cm2 (Figura 14C). O aumento da capacitância usando esta estratégia de revestimento de microcapacitor pode efetivamente reduzir a tensão de polarização em comparação com o eletrodo de Au tradicional (Figura 14D).

Este protocolo estabelece uma plataforma nanoporosa baseada em carbono para biointerfaces eficazes para modulação elétrica ou detecção de sistemas cardíacos (Figura 10). Para avaliar o desempenho da eletrônica de carbono nanoporoso para estimulação cardíaca, o eletrodo Au ou Au-C foi colocado na parede do ventrículo esquerdo (VE) para injeção de carga em formas de onda de corrente quadrada bifásica³⁵ (Figura 10A). Após a estimulação de 4 Hz (1 mA), os eletrodos Au e Au-C alcançaram estimulação de overdrive efetiva (Figura 10B). No entanto, uma amplitude de ECG notavelmente maior, indicativa de força de contração, foi observada no grupo Au-C. Ambos os eletrodos demonstraram uma diminuição exponencial na corrente limiar para estimulação com a duração do pulso. Os limiares de estimulação, que indicam as tensões mais baixas para modulação de frequência efetiva, também foram medidos em várias larguras de pulso (Figura 10C-D). A curva força-duração foi modelada usando a equação:

onde I (t) refere-se à corrente de estímulo na duração do pulso (t), I_reobase é a corrente de limiar em uma duração de pulso infinitamente longa (reobase) e τ é a constante de tempo da membrana³⁶. O cálculo utiliza a carga mínima necessária para uma estimulação bem-sucedida na cronaxia como . Q_min. Os valores foram determinados como 0,79 e 0,71 μC para eletrodos de Au e Au-C, respectivamente (Figura 10C). A uma corrente de estimulação de 4 mA/^cm2, foram observadas tensões limiares para estimulação efetiva em 1,32 V e 0,90 V para eletrodos Au e Au-C, respectivamente (Figura 10D). A redução de 30,3% na voltagem limiar sugere uma diminuição potencial no estresse oxidativo durante a estimulação prolongada³¹, facilitando assim aplicações bioeletrônicas mais seguras com danos mínimos aos tecidos. Além disso, um eletrodo de Au de 16 canais enxertado com carbono foi desenvolvido para detecção aprimorada do sinal de ECG epicárdico (Figura 10E-F). A transferência de carbono nanoestruturada melhorou notavelmente a relação sinal-ruído em 8,0 vezes em comparação com os eletrodos de Au tradicionais, demonstrando a eficácia dos revestimentos nanoporosos à base de carbono para bioeletrônica de alta fidelidade.

A indução bem-sucedida de modelos de infarto I/R foi validada no local durante o experimento ou pós-experimentalmente por meio de monitoramento de sinal fisiológico ou coloração TTC, respectivamente. Após o corte e a coloração, o coração infartado exibirá uma região de cor branca, representando dano miocárdico e correspondendo ao tamanho do infarto (Figura 7B). Em contraste, um coração saudável não terá regiões brancas após a coloração. Durante o monitoramento em tempo real, um modelo de isquemia bem-sucedido exibirá uma frequência cardíaca significativamente reduzida, evidente nas leituras de LVP e ECG. Além disso, o mapeamento MEA do coração isquêmico revelará uma diminuição da velocidade de condução elétrica através do epicárdio, resultando em um aumento do tempo de atraso³⁷ (Figura 7A).

Figura 1: Ilustração esquemática do protocolo e do fluxo de trabalho de fabricação. (A) Ilustração esquemática da configuração ex vivo do coração do rato e interface do dispositivo. (B) Processo de fabricação de membrana de silício porosa (etapa 1). A fabricação da membrana porosa de Si começa com um wafer SOI, onde uma camada fotorresistente é padronizada por meio de fotolitografia para definir características hexagonais. O RIE remove seletivamente o silício exposto, seguido por um processo de decolagem em HF tamponado para liberar membranas de Si. A membrana sofre coloração em uma solução à base de HF, gerando uma estrutura nanoporosa de Si. A membrana porosa de Si resultante é cuidadosamente destacada e transferida para um substrato PDMS para suporte mecânico. Finalmente, o tratamento com plasma modifica as propriedades da superfície para fotocorrentes aprimoradas. (C) Processo de fabricação de matrizes de multieletrodos macroporosos flexíveis (etapa 2). A fabricação de MEAs flexíveis começa com o revestimento PI em um wafer de silício para servir como camada de substrato flexível. A fotopadronização é realizada usando o fotorresistente AZ 2020 para definir as áreas do eletrodo. A deposição de metal (Au / Ti) é realizada por evaporação por feixe eletrônico para criar traços condutores, seguida por outra etapa de fotopadronização usando AZ 40XT-11D para proteger regiões selecionadas do RIE para formar substrato macroporoso. Uma etapa de fotopadronização e cozimento duro do SU-8 adiciona encapsulamento antes que o processo final de decolagem libere o MEA flexível do wafer de Si. (D) Fluxo de trabalho de padronização e transferência de membrana de carbono (etapa 3), abrangendo processamento de fibra por impregnação de sal, microfabricação por síntese a laser e transferência de padrão assistida por água do substrato de papel para outros suportes. A Figura 1D foi modificada de²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens ópticas e SEM dos dispositivos fabricados. (A) SEM de seção transversal (superior) e imagem microscópica óptica (inferior) de Si nanoporoso. (B) Imagens ópticas de matrizes de multieletrodos macroporosos com desenhos ocos (superior) e serpentinos (inferior). (C) Imagem microscópica óptica transversal (superior) e foto (inferior) de substratos carbonizados. A Figura 2A foi modificada de²⁶. A Figura 2C foi modificada de²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Projetos CAD do dispositivo de membrana de Si. A figura detalha os parâmetros para (A) pequenos, (B) médios, (C) grandes e (D) dispositivos de membrana de silicone em forma de janela aberta. Unidade: mm. Este número foi modificado de²⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Projeto CAD dos MEAs macroporosos. (A) Os desenhos de projeto e anotações para o MEA de forma oca. (B) Os desenhos de projeto e anotações para o MEA em forma de serpentina. Unidade: mm. A Figura 4A foi modificada de²⁶. A Figura 4B foi modificada de²⁸. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Esquemas e projetos dos feixes de eletrodos à base de carbono para interface cardíaca. (A) Projeto para as interfaces do eletrodo de estimulação (etapa 3). Durante uma estimulação típica, os eletrodos de estimulação foram conectados em uma configuração de dois eletrodos. O eletrodo de trabalho (padrão de carbono nanoporoso serpentino) foi colocado na parede do ventrículo esquerdo, enquanto o contra-eletrodo foi colocado na parede do ventrículo direito e conectado ao solo. As formas de onda de corrente quadrada foram entregues através de um potenciostato. (B) Os MEAs de 16 canais para mascaramento e transferência de eletrodos de carbono (etapa 3). A camada 1 indica o padrão de Au de um MEA de 16 canais em um substrato PI. A camada 2 indica o filme de encapsulamento PET. Este número foi modificado de²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Representação esquemática e fotográfica da configuração ex vivo e do processo experimental. (A) Aparelhos e ferramentas usados para configuração ex vivo , incluindo recipientes de frascos cônicos, instrumentos cirúrgicos, sistemas de perfusão e sistemas de controle de temperatura (etapa 4). (B) Processo de extração do coração do rato: Anestesiar o animal com isoflurano; Prenda os braços do rato; abra a caixa torácica do rato; Colha o coração de rato. (C) Remoção do tecido adiposo circundante do coração extraído para prepará-lo para a configuração experimental. (D) Ligação do coração extraído ao sistema de perfusão ex vivo . (E) Configuração de perfusão mostrando o coração conectado ao sistema para simular condições fisiológicas. (F) Configuração de gravação de ECG cardíaco. (G) Os processos de isquemia-reperfusão (I / R) são demonstrados por meio da configuração (etapa 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Comparação entre coração isolado saudável e coração I/R. (A) Os atrasos na propagação de LVP, ECG e ECG foram registrados em corações saudáveis simulados e corações de isquemia/reperfusão (I/R). (B) Fotografias representativas de coração saudável corado com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) e seções cardíacas I / R. A área branca indica o tamanho da área infartada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Estimulação optoeletrônica bidirecional e registro elétrico do coração de rato ex vivo usando membrana de silicone porosa e MEAs flexíveis. (A) Fotografia mostrando a fixação da membrana de silício e a colocação de MEAs em forma de serpentina ao lado da membrana de silício no coração. (B) Fotografia mostrando a fixação de uma membrana de silicone em forma de janela aberta e MEAs ocos encaixados dentro da janela Si. (C) Estimulação óptica no coração de rato ex vivo mostrando não captura, captura parcial e captura total em três intensidades diferentes a 240 bpm e duração de pulso de 1 ms. (D) Gráfico de intensidade versus duração para avaliar o limiar de estimulação do dispositivo. (E) Perfis de estimulação óptica sob intensidade de 0,24 mW / mm² e duração de pulso de 10 ms. A Figura 8B-D foi modificada de²⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Ritmo e mapeamento multissite em interfaces bidirecionais. (A) Posições dos locais de estimulação e registro. (B) O mapa isócrono mostra o atraso na ativação do sinal elétrico após a fotoestimulação de oito locais diferentes em um dispositivo de Si monolítico estruturado em janela aberta. (C) O controle exemplar e os traços de ECG de 16 canais estimulados em diferentes locais de estimulação. Ao estimular vários locais, a ativação espacial induziu atrasos temporais na evolução do QRS detectados em tecidos em diferentes locais de registro. Estes podem ser descritos como um mapa de atraso de ativação, permitindo o exame das vias de condução na superfície do coração. Este número foi modificado de²⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10. Bioeletrônica nanoporosa à base de carbono para estimulação cardíaca e registro. (A) Imagem óptica de um eletrodo de Au (Au-C) enxertado com membrana de carbono poroso para estimulação cardíaca. A imagem inserida mostra a visão ampliada de um microcapacitor estruturado em serpentina no eletrodo de Au. (B) Resposta do ECG do coração isolado de ratos à estimulação bifásica da forma de onda de corrente quadrada a uma frequência de 4 Hz. Sob a mesma densidade de corrente de 4,0 mA/^cm2, o coração apresentou diferentes respostas de ECG sob estimulação de eletrodos de Au ou Au-C. (C) As curvas de duração-força dos eletrodos de estimulação Au e Au-C e seu ajuste de curva estão presentes em uma frequência de estimulação de 4 Hz. (D) A tensão limite aplicada aos eletrodos para estimulação efetiva em diferentes durações para eletrodos Au e Au-C. (E) Curvas de linha de base dos sinais de ECG registrados com o eletrodo de Au e os dispositivos de eletrodo de Au-C. (F) A relação sinal-ruído (S/N) é calculada a partir das curvas de ECG registradas. As figuras inseridas mostram as imagens ópticas do Au e do feixe de eletrodos Au-C usados para registro de ECG (tamanho do eletrodo: 1 mm; passo 7.5). Este número foi modificado de²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Comparação de fotocorrentes para diferentes dispositivos de Si e avaliação do limiar de estimulação. (A) Comparação de magnitudes fotocorrentes em quatro dispositivos baseados em Si. Os traços azuis representam as fotocorrentes médias de N = 8 dispositivos independentes, e os traços cinza sobrepostos ilustram as medições individuais do dispositivo. O gráfico de barras que acompanha mostra os valores de pico de fotocorrente (em azul) e as injeções de carga integradas (em laranja). Os gráficos de barras são expressos como média ± dp Barra de escala, 10 ms. (B) A estimulação cardíaca ex vivo foi realizada usando os três dispositivos diferentes. A estimulação foi realizada com uma frequência de 240 b.p.m. e largura de pulso de 10 ms. Este número foi modificado de²⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Caracterização do balanço de carga integrando a carga injetada e devolvida. (A) Ilustração do processo de carga e descarga no traço característico de fotocorrente. (B) Cálculo do total de encargos envolvidos na injeção de carga e devolução de carga. Os resultados mostraram um bom equilíbrio de carga sob diferentes durações de estimulação. Este número foi modificado de²⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Os sinais elétricos representativos coletados por cada eletrodo no MEA de 16 canais. Os sinais elétricos em 16 canais (Ch) mostram as informações do eletrocardiograma (ECG) do coração batendo ex vivo. O número foi modificado de²⁸. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 14. Propriedades eletroquímicas da bioeletrônica nanoporosa à base de carbono. (A) A interface eletroquímica entre tecidos excitáveis e interfaces de carbono padronizadas. (B) Espectros de impedância e fase de eletrodos de Au e Au-C com curvas ajustadas de acordo com o circuito exibido em A. (C) Medição de CV de padrões de Au e C com a mesma geometria, com uma faixa de tensão de -0,2 a 0,4 V versus um eletrodo Ag / AgCl padrão. (D) Mudanças de tensão do eletrodo Au e Au-C durante um ciclo de estimulação galvanostática bifásica. Este número foi modificado de²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composto	Variedade recomendada	Conc. [mM]	MW	Por 1 L	Por 2 L
NaCl	Sigma (S9625)	126	58.4	7.36	14.7
Kcl	Sigma (P4504)	5.4	74.6	0.4	0.8
Glicose	Sigma (G7021)	10	180	1.8	3.6
HEPES	Sigma (H4034)	10	238	2.383	4.766
MgCl2.7H2O	Sigma (M9272)	1	203	1 mL	2 mL
				Estoque 1 M	Estoque 1 M
CaCl2.2H2O	Sigma (C3881)	2	147	1 mL	2 mL
				Estoque 2 M	Estoque 2 M
NaH2PO4	Sigma (S0751)	0.39	120	1 mL	2 mL
				Estoque 0.39 m	Estoque 0.39 m

Tabela 1: Componentes da solução HEPES Tyrode.

Discussão

Este protocolo introduziu a plataforma ex vivo de coração de rato (Figura 1A) e o modelo I/R para oferecer estudos de eletrofisiologia rápidos e convenientes em nível de órgão para acompanhar os esforços de pesquisa em rápido crescimento e demandas em bioeletrônica³⁸. Ele detalhou a fabricação e validação de três sistemas de dispositivos, a saber, silício nanoporoso, matrizes de multieletrodos flexíveis e carbono nanoporoso (Figuras 1B-D), como referência para interrogações eletrofisiológicas bidirecionais. O silício nanoporoso permite estimulação de baixa intensidade, capacitiva e de alta espaço-temporalidade, matrizes flexíveis de multieletrodos permitem o registro multicanal e o mapeamento de atividades epicárdicas e o carbono nanoporoso leva à estimulação de baixa tensão e alta gravação de SNR quando combinado com MEAs²⁷.

A estimulação óptica foi demonstrada anteriormente usando optogenética, um método que requer modificação genética para expressar canais iônicos sensíveis à luz em tecidos-alvo³³. Embora eficaz, a optogenética introduz uma complexidade significativa devido à necessidade de vetores virais ou abordagens transgênicas, levantando preocupações de segurança, éticas e regulatórias, particularmente para aplicações clínicas. Em contraste, a bioestimulação não genética baseada em semicondutores oferece uma alternativa mais simples e mais viável 39,40,40,42. Materiais como silício e outros semicondutores orgânicos permitem a modulação optoeletrônica direta de tecidos sem alteração genética, aproveitando fotocorrentes capacitivas para estimulação biossegura e com carga balanceada. Essa abordagem atinge desempenho comparável ou até superior à optogenética em termos de intensidade de estimulação, operando bem abaixo dos limites de segurança do laser para minimizar o dano tecidual^31,32 (Figura 8). A natureza não genética da bioestimulação baseada em semicondutores elimina as barreiras associadas à modificação genética, abrindo caminho para uma adoção mais ampla em ambientes clínicos e diversas aplicações em engenharia de tecidos e medicina bioeletrônica. No entanto, os dispositivos precisam ser cuidadosamente projetados para se integrarem ao tecido, onde a biocompatibilidade precisa ser cuidadosamente considerada, bem como o local de interface para estimulação e registro eficientes (Figura 8A-B). Além disso, a presença de material na superfície do tecido pode impedir a possibilidade de imagens em tempo real, a menos que um dispositivo possa ser projetado para ser transparente à janela de emissão de excitação de certos agentes de imagem.

O silício nanoporoso se destaca entre os fotoestimuladores semicondutores, pois não requer um eletrodo de retorno artificial, ao contrário dos materiais relatados anteriormente²⁶. Essa propriedade única surge de sua capacidade de formar regiões de cátodo e ânodo espacialmente resolvidas com base no tamanho e na localização do ponto de luz. A superfície iluminada serve como local de injeção catódica, enquanto as regiões periféricas circundantes facilitam o retorno da corrente anódica. Esse mecanismo permite a estimulação multissite em membranas monolíticas e sem pixels, permitindo uma estimulação precisa e localizada. Notavelmente, a estimulação de luz localizada, em vez da iluminação global, é fundamental para a criação de perfis de estimulação bipolar eficientes. Além disso, o tamanho do dispositivo afeta significativamente o desempenho; Dispositivos maiores geram correntes mais altas sob as mesmas condições de estimulação, aumentando ainda mais sua versatilidade funcional.

A falha da estimulação óptica pode resultar de vários fatores, mesmo em modelos biológicos saudáveis, principalmente relacionados à integridade do dispositivo e ao acoplamento da biointerface. Primeiro, a caracterização completa da fotocorrente é crítica antes da estimulação cardíaca. Fotocorrentes abaixo do esperado podem surgir da passivação de óxido de degradação do material⁴³ após armazenamento prolongado, sobrecondicionamento durante o processo de condicionamento de manchas, fraturas do dispositivo durante o manuseio ou transferência ou orientação incorreta do dispositivo durante a interface. Para mitigar danos mecânicos, o PDMS foi usado como um substrato macio para acomodar as membranas de silício nanoporosas, fornecendo proteção contra possíveis danos causados pelo manuseio direto com pinças. Em segundo lugar, é essencial estabelecer uma interface perfeita com o epicárdio, que é perfundido com biofluidos nesta configuração. Uma espessa camada de biofluido pode impedir a fixação adequada e comprometer a eficácia da estimulação. Para melhorar o acoplamento da biointerface, bioadesivos^42,43 ou sutura podem ser empregados para estabilizar a conexão e garantir uma estimulação confiável. Notavelmente, o silício nanoporoso usado em nosso estudo é biodegradável, suportando aplicações temporárias de estimulação, mas degradando o desempenho dentro de 1-2 dias em condições fisiológicas. Para estabilidade a longo prazo, a passivação da superfície⁴⁴ ou o uso de materiais semicondutores mais duráveis devem ser considerados.

Durante a estimulação ex vivo, o aumento gradual da LVP (Figura 8E) em frequências mais altas (por exemplo, 4 Hz) provavelmente resulta de aumento da contratilidade miocárdica, acúmulo de cálcio e mecanismo de Frank-Starling⁴⁵. Taxas de estimulação elevadas melhoram a ciclagem de cálcio intracelular e a dinâmica de enchimento ventricular, aumentando a pré-carga e a força de contração⁴⁶. Embora isso possa aumentar a demanda de oxigênio do miocárdio e o risco de arritmia, esses efeitos podem ser mitigados por pré-oxigenação suficiente, monitoramento rigoroso do ECG e parâmetros de estimulação controlados. Em nossos experimentos, não foram observados efeitos adversos significativos.

Na gravação de múltiplos eletrodos, especificar as localizações dos eletrodos no coração e suas posições relativas ao eletrodo de estimulação é crucial para uma análise significativa. É essencial eliminar a diafonia entre os eletrodos para garantir a captura de formas de onda distintas e padrões resolvidos temporalmente. Feixes de eletrodos flexíveis normalmente estabelecem uma boa interface com o epicárdio; no entanto, a adesão pode ser aprimorada ainda mais usando revestimentos adesivos ionicamente condutores, como camadas finas de hidrogel^28,43 para melhorar a estabilidade e a qualidade do sinal.

Materiais nanoestruturados de grafeno/carbono, com grandes áreas de superfície para armazenamento e injeção de carga, podem melhorar o desempenho do dispositivo bioeletrônico, reduzindo a impedância nas junções eletrodo-salina e aumentando as capacidades de injeção de carga³⁵. Os métodos atuais para padronizar materiais de grafeno em eletrodos flexíveis (por exemplo, Au) incluem eletrodeposição, revestimento de rotação e serigrafia⁴⁷. No entanto, esses métodos são normalmente associados a processos de fabricação complexos, recursos limitados de padronização e desempenho reduzido devido ao volume morto de ligantes. Um método de síntese a laser foi utilizado para gerar padrões de carbono nanoestruturados em substrato de celulose e, em seguida, transferi-los para outros filmes macios para criar uma biointerface compatível, que apresenta uma maneira fácil e eficaz para a fabricação de bioeletrônica. A combinação de revestimentos de carbono padronizados com pequenos tamanhos geométricos até o nível de célula única, o que aumentaria o campo elétrico localizado, e estruturas altamente porosas de membrana de carbono para diminuir a resistência na interface eletrodo-tecido, alcançará sinergicamente estimulação biológica eficiente e registro no futuro⁴⁸.

Embora seja um modelo de doença conveniente, o modelo de I/R ex vivo de Langendorff carece de interações sistêmicas, isolando o coração das respostas neuro-hormonais e imunes, e depende da perfusão artificial com tampões, que podem alterar as condições fisiológicas, como fornecimento de oxigênio e função endotelial. Sua viabilidade limitada limita os estudos a eventos agudos. No entanto, o modelo oferece um ambiente altamente controlado com ajustes precisos de parâmetros e boa reprodutibilidade. Ele também permite a medição da função cardíaca em tempo real, tornando-se uma ferramenta valiosa para explorar novas estratégias terapêuticas para doenças cardíacas isquêmicas. Por exemplo, dispositivos eletrocêuticos podem ser imaginados para pré-condicionar o coração, treinando-o para suportar ambientes severos de espécies reativas de oxigênio (ROS) ou para mitigar os níveis de ROS para melhorar a recuperação. A eficácia de tais tratamentos pode ser avaliada por meio de métricas como padrões de batimentos cardíacos, formas de onda de ECG e velocidade de condução. Além disso, uma plataforma de estimulação multissítio poderia fornecer informações espaciais sobre o infarto do miocárdio, permitindo uma avaliação mais detalhada das regiões afetadas. Essa abordagem também pode demonstrar limiares de estimulação aprimorados, correlacionados com a gravidade do infarto, oferecendo uma estrutura abrangente para avaliação e otimização terapêutica.

Embora o protocolo tenha destacado o uso dos três dispositivos em modelos cardíacos ex vivo bidirecionais, sua aplicabilidade vai muito além dos tecidos cardíacos. Esses dispositivos podem ser prontamente adaptados para uso com outros tecidos ou órgãos eletricamente excitáveis, como tecidos neurais, músculos esqueléticos e sistemas gastrointestinais, onde a modulação elétrica precisa é crítica, tornando-os ferramentas versáteis para pesquisa e aplicações translacionais em medicina bioeletrônica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Headstage de 16 canais	Intan Technologies	C3334
Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio	Sigma Aldrich	T8877-5G	cloreto de trifeniltetrazólio
2-propanol (IPA)	Fischer Scientific	Resposta 451-4
Laser de 635 nm, 500 mW	Brilho a laser	NA
Acetona	Fischer Scientific	A18-4
Evaporador de feixe eletrônico Angstrom Evovac	Angstrom	NA
Desenvolvedor AZ 300MIF	Microquímicos	18441123163	Revelador
AZ nlof 2020	Microquímicos	1A002020
AZ NMP	Microquímicos	NA	Removedor de fotorresistência
AZ40XT-11D	Microquímicos	1000300	Fotorresistente
HF tamponado	Thermo Científico	AA44627K2
CaCl2.2H2O	Sigma Aldrich	(C3881)
Laser de CO2	Sistemas Laser Universais	VLS 4.60
Tinta prateada condutora	PELCO	16062	Adesão condutiva entre o eletrodo e o fio de conexão do
Fio de cobre encapsulado 0,1 mm	Amazona	https://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/ B09TNM51S5/ref=asc_df_B09 TNM51S5?mcid=155de761ea4 c389ea86d45ba61a83e8d& tag =hyprod-20& linkCode=df0& hvadid =693675076770& hvpos = & hvnetw =g& hvrand=664358781094905 4431& hvpone=& hvptwo=& hvqmt =& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9021716& hvtargid= pla-1878323158943& PSC = 1
Digitalizador Digidata 1550	Dispositivos Moleculares	NA
Glicose	Sigma Aldrich	G7021
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol	Thermo Científico	14175095
Heidelberg MLA150 escritor direto	Heidelberg	NA
heparina (1000 UI/kg)	Sagent Farmacêutica	1009655
HEPES	Sigma Aldrich	(H4034)
Hexano	Sigma Aldrich	Rolamento 52750-10ML	Solvente
HF	Fisher Científico	A513-500	Grau de traço metálico
Forno HMDS Vapor Prime	Sistemas de Engenharia de Rendimento	NA
HNO3	Fisher Científico	A509P500	Grau de traço metálico
Laminador a quente	Depósito de Escritório	L410-A	Encapsulamento multicamada
Sistemas Intan RHD	Intan Technologies	C3100
ECG iWorx	iWorx	IA-400D
Sonda iWorx LVD	iWorx	BP-100
Pré-amplificador iWorx	iWorx	C-ISO-256
Kcl	Sigma Aldrich	(Pág. 4504)
Balão de látex (tamanho 4)	Radnoti	170404
MgCl2.7H2O	Sigma Aldrich	(M9272)
NaCl	Sigma Aldrich	(S9625)
Solução contendo Nafion 117	Sigma Aldrich	31175-20-9	Reagente de fixação para padrão de carbono nanoporoso
NaH2PO4	Sigma Aldrich	(S0751)
NaOH	Sigma Aldrich	221465
PDMS	Fisher Científico	NC9285739
Plasma Therm indutivamente acoplado plasma fluoreto gravura	Plasma-Therm	NA
PMMA (495 A6)	Microquímicos	M130006
Poli (dianidrido-co-4,4'-oxidianilina piromelítica)	Sigma Aldrich	575801	Precursor PI
Poli (etileno-co-acetato de vinila)	Sigma Aldrich	Rolamento 437247-250G	Polímero para infiltração
Poli (álcool vinílico)	Sigma Aldrich	341584-25G
Polietileno tereftalato (PET)	Amazona	KS-6304-21-11	Folha de PET Tipo D Transparente .0005" Espessura x 27" Largura x 10 Ft Comprimento 1 pc
Potenciostato	Biológico	SP-200	Estimulação elétrica
resistir ao forno	Despachar	LCC1-15-5
Microscopia eletrônica de varredura	Carl Zeiss	Esmerilhão	Instrumento para caracterização morfológica
bolacha de silício	Materiais Eletrônicos NOVA	HS39626
Adesivo de silicone	WPI	KWIK-SIL-S	Encapsulação
Borato de sódio	Sigma Aldrich	SX0355
Bolacha SOI	Ultrasil	3-10541	Tipo-Oriente:P/B(100) DT:7+/-1um DR:<. 005 ohmcm ht: 300 +/- 10um hr: 1-30 ohmcm caixa: 1um +/- 5% ud-13998 / uh-13962
SU-8 2002	Microquímicos	Série SU-8 2000
Desenvolvedor SU-8	Microquímicos	Série SU-8 2000
Adesivo de tecido úmido	3M	1469SB
Papel de filtro qualitativo Whatman, Grau 1	Sigma Aldrich	WHA1001150	Substrato para padronização de carbono