Artigo de método

Isolamento e Avaliação por Citometria de Fluxo de Interações Neuroimunes em Modelo Murino Mini-AVC

DOI:

10.3791/68308

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20 de junho de 2025

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1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a função das células imunes após AVC isquêmico usando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. Este método permite o exame detalhado das interações neuroimunes e pode ser adaptado para estudar outras doenças neurodegenerativas, aprimorando nossa compreensão das respostas imunes na patologia do AVC.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade a longo prazo em todo o mundo, com o AVC isquêmico representando a maioria dos casos. Após um acidente vascular cerebral isquêmico, as células imunes residentes e infiltrantes são ativadas, contribuindo para mais danos neuronais. No entanto, os papéis do sistema imunológico na patologia do AVC isquêmico não são totalmente compreendidos, em grande parte devido à regulação complexa e dinâmica das respostas imunes em reação a mudanças no microambiente durante a neuroinflamação. Portanto, é essencial monitorar e analisar a ativação das células imunes residentes e infiltrantes ao longo do tempo após um AVC isquêmico. Neste estudo, apresentamos um protocolo para avaliar a função dessas células imunes após AVC isquêmico usando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. Microdissecamos o tecido cerebral infartado em pontos de tempo específicos e, em seguida, o dissociamos em uma suspensão unicelular usando métodos mecânicos e enzimáticos. As células são passadas por um filtro de células de 70 μm e marcadas com coquetéis de anticorpos marcados com fluorescência antes de serem quantificadas por análise de citometria de fluxo. Embora este ensaio tenha sido desenvolvido especificamente para investigar interações neuroimunes após AVC isquêmico, ele também pode ser facilmente adaptado para estudar mecanismos neuroimunes em outras doenças neurodegenerativas, como esclerose múltipla, doença de Parkinson e doença de Alzheimer.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O AVC é uma causa predominante de mortalidade e incapacidade a longo prazo em todo o mundo, sendo o AVC isquêmico responsável pela grande maioria dos casos1,2,3. O objetivo geral deste método é melhorar nossa compreensão das interações neuroimunes que ocorrem após um AVC isquêmico, fornecendo uma abordagem refinada para avaliar a ativação de células imunes residentes e infiltrantes em um modelo murino de mini-AVC 4,5. A intrincada interação entre essas células imunes e o microambiente neuronal é crucial para a compreensão da fisiopatologia do AVC isquêmico. No entanto, os mecanismos precisos subjacentes a essas interações neuroimunes permanecem pouco elucidados, principalmente devido à natureza dinâmica e multifacetada das respostas imunes desencadeadas pela neuroinflamação6. Esta técnica visa elucidar a complexa dinâmica das respostas imunes no contexto da neuroinflamação e seu subsequente impacto no dano neuronal e nos resultados da recuperação.

A lógica por trás do desenvolvimento dessa técnica decorre do papel crítico que as células imunológicas desempenham na exacerbação do dano neuronal e na influência da recuperação após um evento isquêmico. Os métodos tradicionais de estudo dessas interações geralmente carecem da resolução necessária para capturar as nuances temporais e espaciais da ativação das células imunes. Ao empregar a análise de citometria de fluxo em suspensões unicelulares derivadas de tecido cerebral infartado microdissecado, este protocolo oferece uma avaliação mais detalhada e dinâmica dos perfis de células imunes ao longo do tempo 7,8. Essa abordagem permite a identificação de populações específicas de células imunes e seus estados funcionais, que são fundamentais para a compreensão da fisiopatologia do AVC isquêmico.

Em comparação com técnicas alternativas, como coloração histológica ou sequenciamento de RNA em massa, que podem fornecer informações limitadas sobre as contribuições individuais dos tipos de células imunes, esse método de citometria de fluxo apresenta várias vantagens. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que a citometria de fluxo permite a análise de alto rendimento de vários marcadores simultaneamente, facilitando uma caracterização mais abrangente dos fenótipos e funções das células imunes 9,10,11,12,13. Além disso, a capacidade desse método de se adaptar a uma variedade de condições neurodegenerativas - como esclerose múltipla, doença de Parkinson e doença de Alzheimer - demonstra sua versatilidade e relevância no corpo mais amplo da literatura que aborda as interações neuroimunes.

Para os pesquisadores que consideram a aplicação desse método, avaliar os objetivos específicos de seu estudo é essencial. Esta técnica é particularmente adequada para investigações que requerem análise temporal detalhada das respostas imunes no contexto de acidente vascular cerebral isquêmico ou doenças neurodegenerativas relacionadas. Recomenda-se que os usuários possuam uma compreensão básica da citometria de fluxo e experiência com modelos murinos para implementar efetivamente este protocolo e interpretar os dados resultantes. Ao fornecer uma estrutura robusta para estudar as interações neuroimunes, esse método contribui significativamente para os esforços contínuos para delinear as complexidades do envolvimento imunológico na patologia do AVC.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Hospital da Amizade de Pequim, Capital Medical University. Recomendamos que todas as soluções sejam submetidas a filtração estéril e que todos os tubos utilizados sejam estéreis.

1. Preparação de reagentes e tampão

  1. Mistura enzimática de digestão: Dissolva a colagenase IV para obter uma concentração de 0,25% e dilua a DNase I para atingir uma concentração final de 2 U/mL.
  2. Tampão de classificação de células ativadas magnéticas (MACS): Dissolva a albumina de soro bovino (BSA) e o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para atingir concentrações de 0,5% e 2 mM em 1x PBS, respectivamente.

2. Modelo de AVC isquêmico focal

NOTA: Camundongos C57BL/6 J (8-10 semanas de idade) foram empregados para estabelecer um modelo de AVC isquêmico focal, conforme descrito anteriormente14. Os camundongos podem ser anestesiados alternativamente usando uma solução de avertin a 1,25% na dose de 0,2 mL por 10 g de peso corporal.

  1. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 3%, mantendo uma dosagem de 1,5% com aparelho de anestesia a gás. Mantenha a temperatura corporal a 37 °C durante todo o procedimento usando uma almofada de aquecimento.
    NOTA: Este estudo enfatiza a importância de verificar a obtenção do plano cirúrgico antes do início do procedimento. Esta etapa é crucial para garantir o acesso ideal à área-alvo e minimizar possíveis complicações durante a cirurgia.
  2. Apare o pelo na região entre o olho direito e a orelha direita usando um barbeador elétrico. Crie uma incisão vertical na área designada adjacente aos olhos sob um microscópio de dissecação.
  3. Separe suavemente todos os tecidos para expor o crânio e identificar o ramo distal da artéria cerebral média direita (ACM), caracterizada por uma estrutura vascular vertical em forma de "Y". Utilize uma furadeira elétrica para penetrar no crânio, tomando cuidado para removê-lo com cuidado.
  4. Extirpar delicadamente as meninges com microfórceps.
  5. Exponha o ramo distal da artéria cerebral média direita (ACM) e, em seguida, faça a ligadura permanente do ramo distal da ACM direita usando uma sutura 10-0.
  6. Reposicione o tecido ao seu estado original e feche a incisão da pele facial com adesivo tecidual.
  7. Posicione o mouse em decúbito dorsal e apare o pelo na área do pescoço com um barbeador elétrico.
  8. Crie uma incisão horizontal na região do pescoço e separe suavemente as glândulas submandibulares.
  9. Disseque cuidadosamente a bainha carotídea com micropinças, identificando a artéria carótida comum e separando-a do nervo vago.
  10. Passe uma sutura 4-0 pela artéria carótida comum e prenda-a com um nó corrediço.
  11. Repita o passo 10 na artéria carótida comum contralateral. Ocluir temporariamente as artérias carótidas comuns (CCAs) bilaterais por 7 min.
  12. Recoloque o tecido da glândula submandibular em sua posição original e feche a incisão no pescoço com adesivo tecidual.
    NOTA: O grupo de operação simulada foi submetido a procedimentos idênticos aos do grupo AVC, com a exceção singular de que a ACM distal e a ACC permaneceram não ligadas.
  13. Monitore o mouse durante e após o procedimento cirúrgico, incluindo sua respiração e temperatura corporal. Mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento até que esteja completamente acordado.

3. Perfusão e dissecção cerebral

  1. Prepare uma seringa de 50 mL e coloque uma agulha de 26 G em sua extremidade. Encha a seringa com solução salina.
  2. Administre uma dose dupla de 1,25% de avertin para obter anestesia profunda no camundongo.
    NOTA: O mouse deve ser completamente confirmado para estar totalmente anestesiado antes de prosseguir para a próxima etapa.
  3. Posicione o mouse em decúbito dorsal em uma placa de espuma, estendendo seus membros anteriores e posteriores, prendendo-os no lugar com agulhas 26 G.
  4. Assim que o camundongo estiver completamente anestesiado, segure a pele abdominal com uma pinça oftálmica e faça uma incisão lateral para revelar o fígado. Prossiga para cortar ao longo de ambos os lados das costelas para expor o coração.
  5. Insira a agulha 26 G no ventrículo esquerdo e corte a aurícula, depois pressione a seringa para permitir que o sangue flua.
  6. Continue o processo de perfusão até que o sangue drenado da aurícula pareça claro.
  7. Decapite o camundongo logo acima da medula espinhal usando uma tesoura cirúrgica reta.
  8. Crie uma incisão póstero-anterior na pele da cabeça para descobrir o crânio. Faça duas incisões laterais na junção das paredes laterais e na base do crânio.
  9. Corte o crânio ao longo da sutura sagital e faça uma incisão entre as órbitas.
  10. Utilize uma pinça para remover o crânio que cobre cada hemisfério, expondo assim o cérebro, e transfira-o para uma matriz cerebral de aço de camundongo. Posteriormente, corte o cérebro em fatias coronais consecutivas de 2 mm de espessura.

4. Digestão do tecido cortical em suspensão de célula única e coloração de anticorpos para citometria de fluxo

  1. Introduza 500 μL de mistura de enzimas de digestão em cada poço de uma placa de 12 poços.
  2. Separe delicadamente o tecido do infarto e transfira-o para a mistura de enzimas de digestão usando microfórceps (Figura 1).
  3. Fragmente minuciosamente o tecido nos menores pedaços possíveis com uma tesoura oftálmica e incube a 37 ° C por 20 min.
  4. Empregando uma pipeta P1000, aspire e dispense suavemente a solução 10 vezes para dissociar o tecido em células individuais e, em seguida, passe a solução por um filtro de células de 70 μm. Enxágue continuamente a placa de 12 poços e o filtro de células com HBSS gelado contendo cálcio e magnésio.
  5. Centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 5 min e, em seguida, rejeitar cuidadosamente o sobrenadante.
    NOTA: Dado que os pellets produzidos são bastante soltos e facilmente desalojados, evite perturbá-los para evitar qualquer perda de células.
  6. Ressuspenda o pellet em 1 mL de 1x PBS e repita a etapa 5. Em seguida, ressuspenda o pellet em 150 μL de 1x PBS e transfira a suspensão para uma placa de 96 poços com fundo redondo. Em seguida, centrifugue novamente a 500 × g a 4 °C durante 5 min.
  7. Segure firmemente a placa de 96 poços e inverta-a rapidamente para descartar o sobrenadante.
  8. Dilua o corante de fluorescência de viabilidade celular na proporção de 1:100 em 1x PBS e, em seguida, ressuspenda o pellet em uma alíquota de 150 μL. Incubar por 10 min em temperatura ambiente (RT), protegido da luz.
  9. Centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante. Diluir o cocktail de anticorpos de superfície celular em tampão MACS. Sem lavar as células, adicione o coquetel de anticorpos da superfície celular e incube por mais 15-20 min a 4 °C.
  10. Centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 150 μL de tampão MACS.
  11. Repita a etapa 4.10 e transfira a suspensão para tubos de centrífuga de 1,5 mL ou tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.

5. Análise e classificação por citometria de fluxo

  1. Projete um painel de citometria de fluxo multicolorido de acordo com a configuração do instrumento, utilizando técnicas manuais ou uma ferramenta de design on-line, para otimizar a seleção de fluoróforos conjugados a anticorpos e minimizar a sobreposição espectral.
    NOTA: Várias considerações importantes devem ser levadas em consideração ao projetar um painel de citometria de fluxo multicolorido. Em primeiro lugar, é essencial familiarizar-se com a configuração do instrumento em uso, incluindo os lasers e filtros, antes do início. Em segundo lugar, empregue rótulos de fluoróforo brilhantes em anticorpos para antígenos de baixa abundância, enquanto opta por marcadores de fluoróforo fracos em anticorpos direcionados a antígenos altamente expressos. Finalmente, é imperativo incluir um corante de viabilidade celular no painel para excluir efetivamente células não viáveis e detritos dos dados. Notavelmente, para garantir o bloqueio apropriado de antígenos de baixa abundância ou mal caracterizados, os controles de fluorescência menos um (FMO) devem ser utilizados15. Os controles FMO abrangem todos os marcadores de linhagem, exceto o de interesse, facilitando o delineamento preciso entre células coradas positiva e negativamente16.
  2. Ajuste as configurações dos detectores de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para garantir que as células de interesse sejam exibidas adequadamente na escala e possam ser fechadas conforme necessário.
  3. Ajuste meticulosamente o FSC e o SSC para eliminar detritos ou ruídos estranhos. Diferencie dupletos de células únicas em um gráfico de pontos que ilustra a área e a altura do FSC. Isole as células viáveis com base no sinal negativo do corante de fluorescência da viabilidade celular.
    NOTA: As configurações para vários instrumentos podem apresentar pequenas variações. Por exemplo, alguns classificadores de células empregam a largura e a altura do FSC para distinguir gibões de células individuais, enquanto outros utilizam a área e a altura do FSC para a mesma finalidade.
  4. Ajuste a compensação para cada canal.
    NOTA: Tanto as amostras celulares quanto as contas de compensação disponíveis comercialmente podem ser empregadas para fins de compensação de transbordamento fluorescente.
    1. Compare o controle de autofluorescência (células não coradas) com os controles positivos de células coradas para garantir que as células coradas sejam dimensionadas adequadamente para cada parâmetro. Além disso, ajuste a compensação analisando amostras de células multicoloridas, monitorando gráficos de pontos de 2 cores e ajustando as configurações de compensação para cima ou para baixo para garantir que as populações de células estejam alinhadas vertical ou horizontalmente umas com as outras.
    2. Utilize os sinais CD45 e CD11b para distinguir entre linfócitos (CD11b-CD45alto), microglia (CD11b+CD45int), células mieloides (CD11b+CD45alto) e astrócitos (CD11b-CD45-GLAST+)17,18.
    3. Empregue tecido cerebral simulado como controle de autofluorescência e referência para discriminar linfócitos. Se um alvo específico estiver sendo examinado, utilize um controle FMO com tecido cerebral pós-AVC.
  5. Comece a coleta de dados de controle e amostra e certifique-se de que eles sejam salvos.
    NOTA: Dado que o modelo de mini-AVC descrito aqui resulta em um pequeno infarto, normalmente menos células são coletadas do que o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Geralmente, a coleta de 5 × 105 células produz aproximadamente 5 × 103 micróglia e 1 × 105 astrócitos, respectivamente.
  6. Selecione e classifique as populações de células desejadas em tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL ou tubos de centrífuga cônicos de 15 mL.
    NOTA: Adicione 500 μL de PBS e enxágue meticulosamente o tubo para garantir a viabilidade das células e auxiliar na formação do pellet celular.

6. Análise da expressão gênica em populações celulares selecionadas

NOTA: A extração total de RNA pode, alternativamente, ser realizada usando kits comerciais seguindo as diretrizes do fabricante.

  1. Centrifugar as células do passo 5.6 a 500 × g a 4 °C durante 3 min e, em seguida, rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de reagente TRIzol.
    NOTA: O número de células classificadas é consideravelmente menor em comparação com células ou tecidos cultivados. Consequentemente, uma velocidade de centrifugação mais alta pode ajudar na formação de um pellet de célula mais compacto. As células obtidas nesta etapa podem ser utilizadas para aplicações subsequentes, como cultura de células ou pipelines de sequenciamento de RNA de célula única.
  2. Deixe a amostra em repouso em RT por 5 min para facilitar a dissociação dos complexos de nucleoproteínas.
  3. Adicione 0,2 mL de clorofórmio à amostra e prenda o tubo. Agite os tubos vigorosamente por 15 s e depois incube por 2 min em RT.
  4. Centrifugue as amostras a 10.000 g por 15 min a 4 °C. O RNA permanecerá apenas na fase aquosa superior.
  5. Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um tubo limpo, tomando cuidado para não perturbar a interface.
    NOTA: O volume da fase aquosa deve ser de aproximadamente 500 μL.
  6. Precipite o RNA da fase aquosa introduzindo 0,5 mL de isopropanol e misturando suavemente invertendo o tubo várias vezes. Incubar as amostras em RT durante 10 min.
  7. Centrifugue as amostras a 10.000 g por 10 min a 4 ° C para coletar o RNA.
  8. Transvasar o sobrenadante e remover completamente qualquer líquido residual por aspiração.
  9. Lave o pellet de RNA uma vez com etanol a 75%, adicionando um mínimo de 1 mL de etanol a 75%. Misturar bem a amostra e centrifugar a 7500 × g durante 5 min a 4 °C.
  10. Elimine todos os vestígios de etanol. Seque ao ar o pellet de RNA por 5 min.
  11. Dissolva o RNA em 10 μL de água livre de RNase pipetando para cima e para baixo.
  12. Prossiga para realizar a PCR em tempo real de acordo com as instruções do fabricante.

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Resultados

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Neste estudo, apresentamos um protocolo refinado para avaliar a funcionalidade das células imunes após AVC isquêmico, empregando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. O mini-AVC foi induzido pela ligadura permanente do ramo distal da artéria cerebral média direita (ACM), seguida por uma oclusão de 7 min das artérias carótidas comuns (ACCs) bilaterais. Essa metodologia produz um AVC leve caracterizado por volumes de lesões pequenos e consistentes e uma taxa de mortalidade notavelmente baixa. Além disso,...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar a função das células imunes após AVC isquêmico, utilizando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. As etapas críticas deste protocolo incluem o estabelecimento de um AVC isquêmico focal por meio da ligadura permanente do ramo distal da artéria cerebral média direita (ACM) ao lado de uma oclusão de sete minutos das artérias carótidas comuns (CCAs) bilaterais. Essa abordagem cirúrgica produz um AVC leve, caract...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82201622) e pela Fundação de Ciências Naturais da Mongólia Interior (nº 2020MS03017).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLNEST 615601Material de laboratório
1 e vezes; PBSCorning21-040-CMReagente
Microplaca tratada com TC de fundo redondo transparente de 96 poçosCorning3799Material de laboratório
APC anti-rato CD19Biolenda152410Anticorpo
APC/Cyanine7 anti-rato CD45Biolenda103116Anticorpo
Avertin (1,25%)Nanjing Aibei Biotechnology M2920Reagente
BD FACSAria IIBD642510Equipamento
Violeta brilhante 421 anti-rato CD4Biolenda100437Anticorpo
Violeta brilhante 605 anti-camundongo / humano CD11bBiolenda101237Anticorpo
BSASigma-AldrichA1933-1GQuímico
Colagenase IVSigma-AldrichC4-28-100MGEnzima
DNase IBiolabs da Nova InglaterraM0303LEnzima
EDTASigma-AldrichEDS-100GQuímico
Tubos de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo Falcon 5 mLCorning352052Material de laboratório
Falcão  Tubos de centrífuga cônicos de 15 mLCorning352095Material de laboratório
FlowJo V10BDSoftware
GLAST (ACSA-1) Anticorpo, PEMiltenyi Biotec130-118-344Anticorpo
IsofluranoRWD Ciências da VidaR510-22-10Reagente
PE/Cyanine7 anti-rato CD3Biolenda100220Anticorpo
PE/Dazzle 594 anti-mouse NK-1.1Biolenda156518Anticorpo
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific Inc.15596026Reagente
Água destilada sem DNase/RNase ultrapuraThermo Fisher Scientific Inc.10977015Reagente
Adesivos de tecido Vetbond3M1469SBMaterial de laboratório
Kit de Viabilidade Fixável Zombie AquaBiolenda423102Corante fluorescente reativo à amina

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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