Este estudo mostrou que o soro contendo Jiangtangle da medicina tibetana pode melhorar a disfunção mitocondrial, aumentando os níveis de ATP mitocondrial e glicolítico.
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Artigo de investigação
Efeitos protetores do soro contendo medicina tibetana Jiangtangle na função mitocondrial em células β pancreáticas RIN-m5F
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A insuficiência β-celular causada pela disfunção mitocondrial é a principal característica do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). A medicina tibetana Jiangtangle, composta por Berberis kansuensis, Curcumaelongae Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L. e Phyllanthus emblica L., pode ser usada para remediar o DM2. No entanto, seus efeitos na função mitocondrial permanecem obscuros. Este estudo tem como objetivo esclarecer os efeitos farmacológicos da medicina tibetana Jiangtangle nas mitocôndrias. Aos 7 dias após a pré-administração do medicamento tibetano Jiangtangle, o soro de rato foi obtido por coleta de sangue da aorta abdominal. As células β das ilhotas pancreáticas de ratos (RIN-m5F) foram divididas em grupos de soro controle, modelo e contendo Jiangtangle. Os grupos modelo e soro contendo Jiangtangle foram induzidos para lesão com meio DMEM contendo 50 mM de glicose por 24 h. O grupo controle foi tratado com meio DMEM sem glicose por 24 h. Em seguida, o meio foi adicionado aos grupos controle e modelo, enquanto os grupos de soro contendo Jiangtangle foram incubados por 24 h com meio contendo 2,5%, 5% e 10% de soro contendo Jiangtangle. Os resultados do UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS indicaram 90 compostos em Jiangtangle, entre os quais 6 compostos prototípicos que entram no sangue. CCK 8 foi usado para medir a viabilidade celular, Seahorse XFe foi empregado para avaliar o metabolismo energético mitocondrial e o efeito do soro contendo Jiangtangle no modelo hiperglicêmico de células RIN-m5F foi avaliado. O soro contendo jiangtangle aumentou a viabilidade celular RIN-m5F, o nível de ATP mitocondrial, o nível de ATP glicolítico, a glicólise basal, a glicólise compensatória, o OCR, o vazamento de prótons e a respiração máxima.
Introdução
O diabetes mellitus é uma doença metabólica crônica amplamente prevalente no mundo. Sua complexa patogênese representa uma séria ameaça à saúde humana, sendo um grande problema de saúde pública a ser resolvido com urgência1. O diabetes é dividido principalmente em diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), diabetes gestacional e tipos específicos de diabetes2. Com a mudança de estilo de vida e a aceleração do processo de envelhecimento, a prevalência de diabetes tem apresentado uma tendência acentuada de aumento nas últimas décadas. A China tem a maior população diabética do mundo, com mais de 118 milhões de pessoas que sofrem de diabetes, representando aproximadamente 22% do total global, sendo mais de 90% DM2 3,4,5. Em todas as patogêneses relatadas, a disfunção das células β ilhotas foi anunciada como um mecanismo fundamental durante o processo de DM2 6,7.
As mitocôndrias, sendo o centro do metabolismo energético celular, são suborganelas envolvidas nas funções básicas da ilhota β-célula8. Estudos atuais mostraram que a ocorrência e o desenvolvimento do DM2 estão intimamente relacionados à atividade mitocondrial, função e estresse oxidativo. A falência de células β causada pela disfunção mitocondrial é a principal característica do DM29. β-células localizadas nas ilhotas são responsáveis por sintetizar e secretar insulina, um hormônio necessário para regular os níveis de açúcar no sangue. No decorrer do desenvolvimento do DM2, a função mitocondrial anormal, as espécies reativas de oxigênio fortificadas e a reação ao estresse oxidativo quebram o equilíbrio dinâmico mitocondrial das células β e afetam a secreção e o metabolismo da insulina10.
A medicina tibetana Jiangtangle é composta por Berberis kansuensis, Curcumaelongae Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L. e Phyllanthus emblica L. (Figura 1). É um pó amarelo com cheiro perfumado e sabor amargo. Pode ser usado para curar boca seca, polidipsia, emagrecimento, poliúria, pé diabético, coceira na pele e outros sintomas causados pelo diabetes. As evidências clínicas existentes mostraram que os alcalóides da casca de Berberis podem efetivamente aliviar o DM2, reduzindo o açúcar no sangue, melhorando a resistência à insulina e reduzindo a inflamação11. A curcumina tem o potencial de melhorar o DM2, reduzindo os níveis de glicose no sangue, aumentando a sensibilidade à insulina, modulando os perfis lipídicos e exercendo efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes12. Além disso, Malave Fructus, Tribulifructus, Thlaspi arvense L. e Phyllanthus emblica L. também têm atividade antidiabética ou antioxidante 13,14,15. Atualmente, a eficácia, a base material e o mecanismo da medicina tibetana Jiangtangle na terapia do DM2 ainda não foram divulgados. A composição da medicina tibetana chinesa é complexa, e sua prevenção e terapia de doenças são baseadas na teoria do uso de drogas em visões holísticas e sistemáticas. Atualmente, a farmacoquímica do soro de matéria médica chinesa pode explicar parcialmente os componentes de absorção no sangue e tornou-se um meio importante para explorar a base material dos medicamentos tibetanos16. Este estudo inicialmente elucidou o efeito protetor da medicina tibetana Jiangtangle nas mitocôndrias in vitro, com foco em testar a nova hipótese de que o soro contendo Jiangtangle pode mitigar a disfunção mitocondrial em células β ilhotas pancreáticas de ratos (RIN-m5F) sob estresse de alta glicose.
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Protocolo
O Comitê Administrativo da Sichuan Scientist Biological Testing Biotechnology Co., Ltd. aprovou o protocolo animal (número de registro: SYST-2024-019). Ratos Sprague Dawley (SD) machos, com idade entre 8 e 10 semanas e pesando 260-300 g, foram mantidos em gaiolas de ventilação independentes em ambiente controlado de 23 ± 2 °C e umidade relativa de 55% a 60% para este estudo. Esses animais livres de patógenos específicos foram adquiridos de um fornecedor comercial (consulte a Tabela de Materiais). Todos os ratos foram submetidos a um período de 1 semana de alimentação adaptativa para se aclimatar ao novo ambiente antes do início do experimento, com acesso irrestrito a água e comida.
Preparação experimental
Os medicamentos e reagentes necessários foram preparados de acordo com o fluxograma experimental (ver Tabela de Materiais). Ratos SPF SD (8-10 semanas, 260-300 g) foram usados neste estudo. Todos os animais foram adquiridos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais). Após a quarentena, os animais foram mantidos em temperatura ambiente constante com um ciclo claro-escuro de 12:12 h e alimentados com dieta padrão para roedores e água.
Tratamento animal e coleta de soro
Todos os ratos submetidos à alimentação adaptativa receberam o medicamento tibetano Jiangtangle por gavagem por 7 dias. A dose clínica foi de 0,6 g/dia, que foi convertida em uma dose de rato de 1,26 g/kg17. Após 1 h da última administração, os ratos foram anestesiados com isoflurano a 3%-4% para indução e 2% para manutenção. Os ratos anestesiados foram então fixados em uma mesa cirúrgica e o local cirúrgico foi desinfetado com iodóforo. Uma incisão foi feita ao longo da linha média do abdome para expor a aorta abdominal. O sangue foi coletado lentamente com uma seringa heparinizada da aorta (8 mL) e transferido para um tubo de centrífuga para centrifugação. O sangue coletado foi centrifugado a 2360 x g por 10 min a 4 °C para separar o soro. As amostras de soro foram então aliquotadas em tubos criogênicos a 5 mL por tubo e armazenadas em um refrigerador médico a -80 ° C (ver Tabela de Materiais) para análise subsequente.
Análise – UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS
Preparação de amostras de material medicinal: O medicamento tibetano Jiangtangle (140,0 mg) foi pesado com precisão e dissolvido em 25 mL de metanol (ver Tabela de Materiais), seguido de 30 min de sonicação a 40 kHz, 300 W. A solução resultante foi filtrada através de uma membrana de 0,22 μm para obter a amostra de teste.
Preparação da amostra de soro: 100 μL de soro foram completamente misturados com 400 μL de metanol frio e acetonitrila (v / v, 1: 1; ver Tabela de Materiais) por vórtice. A mistura foi processada por sonicação (40 kHz, 300 W) por 1 h em banho de gelo. A mistura foi então incubada a -20 °C por 1 h e centrifugada a 4 °C por 20 min a 14.000 x g. Os sobrenadantes foram então colhidos e secos sob vácuo para análise UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS.
Condições cromatográficas: Os sobrenadantes foram medidos por um sistema UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS (ver Tabela de Materiais). Para a separação do LC, foi utilizada uma coluna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm). A fase móvel consistiu em A (0,1% de ácido fórmico em água) e B (100% de acetonitrila). A taxa de fluxo foi de 0,3 mL/min, com um programa de gradiente específico de 5%-95% B (0-30 min), 95% B (30-35 min). O volume de injeção foi de 5 μL. Os dados de MS foram adquiridos nos modos ESI positivo e negativo separadamente. A fonte HESI tinha condições definidas para tensão de pulverização, temperatura capilar, fluxos de gás, etc. O instrumento escaneou m/z 70-1050 Da, com diferentes resoluções para MS completo e MS/MS. Os dados brutos de MS foram processados usando MS-DIAL para alinhamento de pico. A composição da medicina tibetana Jiangtangle foi identificada por dados precisos de massa e MS / MS em bancos de dados públicos. Apenas as variáveis com valores diferentes de 50% em pelo menos um grupo foram mantidas.
Cultura e tratamento celular
As células RIN-m5F (ver Tabela de Materiais) foram cultivadas com meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal a 10% e penicilina / estreptomicina a 1% em uma incubadora controlada de CO5 2 (ver Tabela de Materiais) a 37 ° C. As células RIN-m5F no estágio de crescimento logarítmico foram coletadas, contadas após a digestão e inoculadas em placas de 96 poços com 1 x 105 células por poço. Usando glicose de 10-60 mM, a indução celular foi feita para imitar um ambiente de alta glicose de DM2. As células RIN-m5F foram divididas em grupos de controle, modelo e soro contendo Jiangtangle de 2,5%, 5% e 10%. As células do grupo controle foram tratadas com DMEM, e os outros grupos foram induzidos com DMEM contendo glicose por 24 h. Os grupos controle e modelo foram adicionados com meio, enquanto cada grupo de soro foi adicionado com DMEM contendo 2,5%, 5% e 10% de soro contendo Jiangtangle e incubado por 24 h a 37 ° C com 5% de CO2.
Análise – CCK 8
A viabilidade celular foi medida pelo CCK 8 (ver Tabela de Materiais). As células RIN-m5F foram inoculadas em placas de 96 poços e tratadas com glicose (0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 mM). Em seguida, 100 μL de DMEM com soro contendo Jiangtangle foram adicionados aos poços e incubados a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h. Cada grupo incluiu 6 poços replicados. Após 24 h de incubação com glicose e 24 h de incubação com soro contendo Jiangtangle, 10 μL de solução de CCK 8 foram adicionados e incubados a 37 ° C por mais 1,5 h. Um leitor de microplacas de comprimento de onda completo (ver Tabela de Materiais) foi usado para detectar os valores de absorbância de cada orifício a 450 nm16.
Análise da função mitocondrial
Como relatamos anteriormente18, o analisador Seahorse XFe 24 (ver Tabela de Materiais) foi usado para avaliar a taxa de produção de ATP em tempo real e a taxa de glicólise. As células RIN-m5F foram inoculadas em microplacas Seahorse XFe24 V24. As células foram semeadas em placas de cultura de células XF24 usando um protocolo de duas etapas: 100 μL de suspensão celular foram dispensados em cada poço e a placa foi deixada intacta por 1 h. Em seguida, a placa foi transferida para uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 por 4 h para promover a fixação inicial. Em seguida, 150 μL de DMEM foram adicionados a cada poço. Após modelagem por 24 h e administração do medicamento por 24 h, a solução de detecção foi preparada adicionando 1% de glicose, 1% de piruvato e 1% de glutamina ao meio Seahorse XF DMEM. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com 1 mL de solução de detecção. Para usar o kit de medição da taxa de ATP em tempo real e o kit de ensaio da taxa de glicólise, 56 μL de oligomicina e 62 μL de rotenona/antimicina A foram ressuspensos e adicionados aos poços do cartucho do sensor A e B, respectivamente. E a placa de cultura de células foi colocada em uma incubadora de cultura de células livres de CO2 por 60 min. Por fim, a taxa de produção de ATP e a taxa de glicólise foram monitoradas em tempo real por um sistema de injeção automática. Todos os experimentos foram conduzidos a 37 °C, e os dados foram analisados usando o software XF Wave19.
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Resultados
UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS mostrou que a medicina tibetana Jiangtangle continha compostos como fenóis, alcalóides, flavonóides, nucleosídeos, ácidos orgânicos, aminoácidos, terpenóides, cumarinas, glicosídeos, taninos, lignanas, esteróides e outros. (Figura 2, Tabela 1). Os ratos SD receberam por via oral 1,26 g / kg do medicamento tibetano Jiangtangle uma vez ao dia. Uma visão geral da estratégia de gating sérico é apresentada na
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Discussão
O DM2 é geralmente considerado uma doença metabólica crônica com início oculto e alta prevalência, e é acompanhado por muitas complicações relacionadas ao diabetes, como disfunção ocular, cardiovascular e renal 20,21,22,23. Suas manifestações clínicas incluem elevação da glicemia, poliúria, polidipsia, perda de peso e até cegueira, que ameaçam seriamente a vida...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Construção de Conotação do 14º Plano Quinquenal da Universidade de Medicina Tibetana (2023ZYYGH05) e pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2024NSFSC1845). Enquanto isso, os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lu Yang, engenheiro sênior de equipamentos do Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Phamacy/Academy for Interdiscipline, por fornecer serviços técnicos para as técnicas do Seahorse XF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| -80 > C refrigerador médico | Mether | MDF-86H118 | |
| 0.22 µ m membrana aquosa | Jinteng | JTMF0445 | |
| 0,22 µ membrana de filtro microporoso tipo agulha m | Jinteng | JTSFM013001 | |
| Acetonitrila | Aladdin | A104440 | |
| Agilent OpenLab software Agilent | Versão 2.X | ||
| Gabinete de biossegurança | Airtech | BSC-1004 II A2 | |
| Kit de contagem de células-8 | Bioground | BG0025 | |
| CelMate CO2 Incubadora | Esco Micro Pte Ltd. | CLM-240B-8 | |
| Coluna cromatográfica | Agilent | SB-C18 | |
| Descoloração agitador | Kylin-Bell | TS-2 | |
| Meio de águia modificado de Dulbecco | Gibco | 8121587 | |
| Tampão de eletroforese | NCM Biotech | 20230801 | |
| Ácido fórmico | Aladdin | F298778 | |
| Glicose | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | P012-180-180222 | |
| Software GraphPad Prism | Software GraphPad, LLC | Versão 9.5.1 | |
| Centrífuga refrigerada de alta velocidade | Thermo Fisher Scientific | Legend Micro 17R | |
| Centrífuga de baixa velocidade | Hallon | NH5 | |
| Metanol | Aladdin | M116118 | |
| Penicilina-estreptomicina | NCM Biotech | C125C5 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (1 e vezes;) | Gibco | 8120485 | |
| Ilhota pancreática de rato β-células | ATCC | CRL-11605 | |
| ReadMax 1500 enzima de comprimento de onda total de absorção de luz | Flash | ReadMax 1500 | |
| Seahorse XF kit de ensaio de taxa de glicólise | Agilent | 103344-100 | |
| Seahorse XF kit de medição de taxa de ATP em tempo real | Agilent | 103592-100 | |
| Seahorse XFe 24 analisador | Agilent | XFe24 | |
| Tripsina (0,25%, 1 e vezes;) | Analisador HyClone | J210045 | |
| UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS | Thermo Scientific | QE Q Misturador | |
| Kylin-Bell | XW-80A |
Referências
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Reimpressões e permissões
