Artigo de método

Explorando os eventos celulares sequenciais de fagocitose desencadeados por Godanti Bhasma em células de mamíferos

DOI:

10.3791/68321

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11 de julho de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

Neste artigo

Resumo

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Este estudo elucida o processamento fagocítico de partículas de Godanti Bhasma (GB) em células de mamíferos, caracterizando sua captação celular, dinâmica de vacúolos, acidificação e degradação. Essas descobertas não apenas avançam nossa compreensão dos mecanismos fundamentais de fagocitose, mas também estabelecem o GB como um sistema modelo promissor para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Resumo

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A fagocitose é um mecanismo celular vital através do qual as células engolfam e degradam partículas estranhas, patógenos ou detritos, desempenhando um papel fundamental na defesa imunológica e na manutenção da homeostase tecidual. Interrupções nesse processo estão associadas a várias doenças. Para explorar os eventos complexos envolvidos na via da fagocitose, partículas inteligentes avançadas e técnicas de monitoramento eficazes são essenciais. Godanti Bhasma (GB), uma medicina tradicional indiana composta por partículas bioativas de sulfato de cálcio, é rapidamente internalizada por fagocitose em células de mamíferos, induzindo vacuolização citoplasmática significativa. Os principais estágios da fagocitose induzida por GB foram avaliados aqui usando citometria de fluxo (FC), imagens de células vivas e técnicas específicas de coloração. A análise por citometria de fluxo demonstrou a formação de estruturas fagocíticas em forma de taça associadas à internalização de partículas. A imagem de células vivas permitiu a observação em tempo real de processos fagocíticos, incluindo absorção de partículas, formação de vacúolos, degradação de materiais engolfados e renovação vacuolar. A coloração com vermelho neutro e laranja de acridina foi empregada para avaliar a acidificação vacuolar. Curiosamente, o tratamento com o inibidor lisossômico BFA1 em células tratadas com GB não levou à vacuolização, como evidenciado pela falta de captação de vermelho neutro, enfatizando a necessidade de um ambiente ácido para que a vacuolização ocorra. Esses achados ressaltam o potencial da fagocitose induzida por GB como modelo para elucidar os eventos celulares sequenciais envolvidos nesse processo, o que é fundamental para a compreensão das interações patógeno-hospedeiro, tráfego intracelular e desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras para distúrbios relacionados à fagocitose.

Introdução

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A fagocitose é um processo celular essencial realizado por fagócitos profissionais residentes no tecido, como macrófagos e células dendríticas, bem como fagócitos não profissionais, como células epiteliais e fibroblastos, que engolfam e degradam partículas estranhas. Essas células internalizam e eliminam partículas estranhas, patógenos ou detritos celulares, contribuindo significativamente para a defesa imunológica e a homeostase tecidual1. Esse processo começa com o reconhecimento de patógenos, detritos ou partículas por meio de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), como os receptores do tipo Toll (TLRs), que se ligam a padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs)2. Esse reconhecimento desencadeia a formação de um copo fagocítico, onde as saliências da membrana plasmática se estendem ao redor da partícula alvo3. Os filamentos de actina desempenham um papel crucial nesta etapa, impulsionando a remodelação da membrana necessária para o engolfamento de partículas4. Uma vez que a partícula é encerrada em um fagossomo, uma vesícula ligada à membrana é formada. O fagossomo sofre maturação, caracterizada pela fusão com endossomos precoces e tardios, seguida pela incorporação de lisossomos contendo enzimas hidrolíticas5. Essas enzimas, como catepsinas, lisozima e nucleases, são ativadas pela acidificação dentro do fagossomo, alcançada pela ATPase vacuolar (V-ATPase), diminuindo o pH para 4,5-5,5. O processo degradativo termina com a exocitose dos restos da célula. Disfunções nesse processo dinâmico e complexo podem resultar em desafios imunológicos significativos 6,7,8.

Para avaliar com precisão o complexo processo celular de fagocitose, há necessidade de métodos aprimorados e fáceis para monitorar os principais eventos celulares da fagocitose. Tradicionalmente, o método de monitoramento para quantificação de fagocitose envolve técnicas como fixação de fagócitos em intervalos de tempo predeterminados para visualização microscópica, medição da internalização de alvos marcados com corante por meio de imagem ou citometria de fluxo ou contagem do número de células-alvo remanescentes após um período especificado de fagocitose, No entanto, esses métodos não capturam as flutuações minuto a minuto que ocorrem durante o processo de fagocitose9. Além disso, métodos que dependem de indicadores indiretos, como a absorção de corantes, podem não refletir com precisão os eventos fagocíticos reais devido à potencial transferência passiva de corantes10.

Avanços recentes em imagens de células vivas, citometria de fluxo e técnicas de coloração revolucionaram nossa capacidade de monitorar a fagocitose com alta precisão espaço-temporal. A imagem de células vivas, por exemplo, permite a observação contínua de processos dinâmicos com rastreamento sequencialde eventos 11. A citometria de fluxo é amplamente utilizada para analisar células de mamíferos e detectar biomarcadores em pesquisas clínicas12. No entanto, os métodos tradicionais de FC não estão equipados para avaliar as características morfológicas e espaciais de células individuais12. A citometria de fluxo de imagem (IFC) serve como uma alternativa robusta que permite a coleta de informações detalhadas de células individuais. O IFC combina os recursos analíticos da citometria de fluxo com imagens de alta resolução, permitindo a análise de uma única célula com detalhes morfológicos e espaciais. Várias partículas, incluindo esferas de látex fluorescentes, zymosan-APC e nanopartículas sintéticas, são comumente usadas para estudar a fagocitose, fornecendo informações sobre o envolvimento do receptor, a formação de fagossomos e as respostas imunes12.

Em contraste com as técnicas bioquímicas convencionais, que normalmente dependem da análise de endpoints, a imagem de células vivas fornece monitoramento contínuo e dinâmico dos processos celulares. Este método oferece alta resolução espaço-temporal e a capacidade de observar eventos sequenciais na fagocitose. Como resultado, é uma ferramenta poderosa para estudar o complexo processo de fagocitose, permitindo insights mais precisos e detalhados sobre comportamentos e mecanismos celulares13.

Além dos avanços nos sistemas de imagem, há uma necessidade de partículas fagocíticas inteligentes que possam destacar distintamente os eventos fagocíticos, particularmente as etapas de degradação que ocorrem dentro do fagossomo. Os estudos de fagocitose geralmente utilizam partículas como esferas de látex, zimosana, bactérias, células apoptóticas e nanopartículas sintéticas para explorar mecanismos como engajamento de receptores, formação de fagossomos e respostas imunes. Embora essas partículas forneçam informações valiosas, elas têm limitações no rastreamento do processo de degradação completo ou na avaliação direta da maturação do fagossomo. Por exemplo, as esferas de látex não são biodegradáveis e não podem demonstrar degradação, enquanto a zigosana e as bactérias geralmente requerem rotulagem complexa e podem não produzir perfis de degradação consistentes14,15.

Nosso estudo anterior demonstrou a utilidade do GB, uma formulação ayurvédica tradicional composta principalmente de sulfato de cálcio, como uma partícula ideal para estudar a maturação e degradação do fagossomo16. GB se dissolve com o tempo no ambiente ácido do fagossomo, permitindo uma visualização clara da degradação das partículas. Além disso, a capacidade do GB de induzir a formação robusta de vacúolos facilita a investigação de estágios distintos de maturação do fagossomo, desde a formação inicial até a acidificação e eventual resolução. Ao contrário de outras partículas, o GB elimina a necessidade de marcação externa, fornecendo um sistema autossustentável para estudar o ciclo de vida completo dos fagossomos, tornando-o um modelo ideal para entender a dinâmica da fagocitose e distúrbios associados16.

Este estudo apresenta um protocolo padronizado e reprodutível projetado para avaliar a fagocitose induzida por partículas e a formação de vacúolos usando Godanti Bhasma (GB) em linhagens celulares fagocíticas profissionais (RAW 264.7) e não profissionais (HeLa e 3T3-L1). O objetivo geral deste método é fornecer uma plataforma robusta para estudar mecanismos de captação celular, biogênese vacuolar e processamento de partículas intracelulares em diferentes tipos de células. O GB foi suspenso em DMEM na concentração de 10 mg/mL e, para garantir a uniformidade, as partículas maiores foram deixadas assentar enquanto a fração superior era coletada para uso experimental. Para ensaios de citometria de fluxo, as células foram semeadas a uma densidade de 2 x 105 células por poço em placas de 12 poços, e 300 μL da suspensão de trabalho GB foram adicionados a cada poço. Para análises baseadas em imagens, 5.000-10.000 células foram semeadas por poço em placas de 96 poços ou em lâminas de câmara. Este método estabelece o GB como um modelo confiável para investigar a formação de vacúolos e a internalização de partículas em diversos tipos celulares.

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Protocolo

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1. Cultura celular e semeadura

  1. Prepare o meio DMEM completo suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor e antibióticos (100 μg / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina). Esterilize todos os reagentes e equipamentos antes de usar.
  2. Cultive as células 3T3-L1, HeLa e RAW 264.7 em frascos de25 cm 2 e placas de cultura de 35 mm usando DMEM. Manter as culturas a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO2 e substituir o meio de 48 em 48 h.
  3. Para subcultura, lave as células 2x com PBS, depois retire as células aderentes usando 500 μL de tripsina-EDTA e incube por 5 min. Adicione 1 mL de DMEM para neutralizar a solução de tripsina-EDTA, pipete para criar uma suspensão de célula única e ajuste o volume para 10 mL com DMEM fresco. Centrifugue a 300 x g por 5 min, ressuspenda o pellet em 1 mL de meio fresco.
  4. Misture 10 μL de suspensão celular com 0,4% de azul de tripano (1:1), conte as células viáveis usando um hemocitômetro, calcule a densidade como Células/mL = Média x 104 x 2.
  5. Para placas de 96 poços: Dispense 100 μL da suspensão celular (contendo 10.000 células) em cada poço. Para lâminas de cavidade, semeie 50 μL da suspensão celular (contendo 5000 células) em duas cavidades, deixando a cavidade do meio vazia. Adicione 50 μL de DMEM a cada uma das cavidades semeadas.
  6. Incubar as placas e lâminas a 37 °C em CO5% 2 por 24 h para permitir a aderência e estabilização celular. Inspecione as células sob um microscópio invertido com ampliação de 20x para avaliar a morfologia, confluência e contaminação antes de prosseguir com os experimentos.

2. Preparação da solução-mãe GB/coquetel para cultura celular

  1. Adquira GB e pese 100 mg do pó com precisão. Suspenda o pó em 10 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Vortex a suspensão e deixe-a repousar por 1 min para permitir que partículas maiores se assentem. Em seguida, transfira os 5 mL superiores da suspensão para um tubo de centrífuga estéril.
  3. Designe esta suspensão GB preparada de 5 mL como a solução de reserva para experimentos de cultura de células subsequentes. Vortex a suspensão completamente para garantir uma dispersão uniforme das partículas antes de adicioná-la às células.

3. Análise por citometria de fluxo

  1. Colha células RAW 264.7, HeLa ou 3T3-L1 por tripsinização, neutralize com DMEM completo, centrifugue a 300 x g por 5 min, ressuspenda em 1 mL de meio fresco, misture 10 μL com azul de tripano a 0,4% (1:1), conte as células viáveis usando um hemocitômetro, calcule a densidade e ajuste para 2 x 105 células/mL.
  2. Semeie 2 x 105 células por poço em uma placa de 12 poços e cultive por 24 h. Incubar a 37 °C com 5% de CO2.
  3. Trate as células com suspensão GB (300 μL por poço) por várias durações: 30 min, 1 h e 12 h. Após o tratamento, lave as células 5x com PBS para remover o excesso de partículas.
  4. Tripsinize as células como na etapa 1.3 e lave-as bem com PBS. Carregar a suspensão preparada na porta de recolha do citómetro de fluxo. Inicie o software e selecione as configurações de aquisição apropriadas. Escolha o Modo de campo claro para imagens.
  5. Inicie a aquisição de dados clicando em Executar no software. Adquira dados para pelo menos 10.000 eventos enquanto o sistema captura imagens de células individuais que passam pela célula de fluxo.
  6. Use gráficos de dispersão de área versus proporção para portar células intactas únicas. Isso ajuda a excluir duplicatas e clusters. Visualize as imagens correspondentes na biblioteca de imagens. Colete imagens de células individuais da biblioteca de imagens do software para estudar as alterações morfológicas induzidas pelo tratamento.
  7. Para análise de partículas, semear 2 x 105 células por poço em placas de 12 poços e cultivar por 24 h. Trate as células com suspensão GB (300 μL por poço) por diferentes durações: 1 h, 7 h, 14 h e 24 h.
  8. Após o tratamento, agite suavemente a placa de cultura por 1 min e colete o meio de cultura em tubos de 1,5 mL. Lave as células 5x com PBS para remover quaisquer partículas extracelulares.
  9. Adicione 500 μL de tampão RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-100; 1% de desoxicolato de sódio) para lisar completamente as células.
  10. Passar o meio de cultura e as amostras de células lisadas contendo partículas separadamente através do citómetro de fluxo. Carregue as amostras na porta de amostra do sistema. Inicie o software e selecione as configurações de aquisição apropriadas. Escolha o Modo de campo claro para análise de partículas.
  11. Inicie a aquisição de dados clicando em Executar no software. Adquira dados de pelo menos 20.000 eventos enquanto o sistema captura imagens de partículas individuais que passam pela célula de fluxo.
  12. Use gráficos de dispersão de área versus proporção para bloquear todas as partículas. Use as ferramentas de gráfico de dispersão para analisar a contagem de partículas.

4. Microscopia de lapso de tempo

  1. Cultivar células 3T3-L1 (3,0 x 104) em uma placa de 35 mm com 2 mL de DMEM a 37 ° C em um CO5% 2 até atingirem 70% de confluência.
  2. Misture bem 300 μL de suspensão de GB no meio de cultura fresco pré-aquecido de 2 mL e, em seguida, coloque a placa de cultura com as células e GB, no estágio de microscópio de imagem.
  3. Selecione o objetivo 10x. Ligue a iluminação do campo claro usando o botão Brilhante. Clique no botão Filme para entrar no modo de lapso de tempo. Defina o tempo de intervalo para 5 min. Comece a gravar clicando no botão Gravar .
  4. Capture imagens a cada 5 minutos em intervalos de 16 h a 24 h, garantindo imagens contínuas sob condições padrão em uma incubadora de CO2 .
  5. Use o software ImageJ para compilar as imagens capturadas em um vídeo com lapso de tempo. Essa técnica permite a diferenciação de vários estágios da fagocitose, desde a internalização até a completa degradação das partículas.

5. Coloração vermelha neutra

  1. Após 24 h de crescimento celular em placas de 96 poços e lâminas de cavidade, misture bem o estoque de suspensão de partículas GB e adicione 30 μL da suspensão a cada poço ou cavidade.
  2. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 h para induzir a formação de vacúolos. Use poços ou cavidades não tratados como controles negativos.
  3. Para coloração Vermelho Neutro (NR), prepare uma solução de 0,5 mg / mL de NR em DMEM sem soro e filtre-a através de um filtro de 0,2 μm.
  4. Para imagens de vacúolos em placas de 96 poços e lâmina de cavidade: remova o meio, adicione 60 μL de corante NR e incube a 37 ° C por 15 min. Lave 3x com PBS para remover o excesso de corante e, em seguida, prossiga com a imagem microscópica.
  5. Examine os vacúolos ao microscópio usando a objetiva 20x, para avaliar o tamanho, a morfologia e o número de vacúolos.

6. Tratamento com Bafilomicina A1 para formação de vacúolos e inibição da acidificação

  1. Prepare uma solução de estoque de Bafilomicina A1 (BFA1) a uma concentração de 100 μg / mL (160,5 nM) dissolvendo 100 μg de BFA em 50 μL de DMSO, seguido de diluição em 950 μL de DMEM. Diluir 1 μL deste estoque em 1,6 mL de DMEM para obter uma solução de trabalho de 0,1 nM.
  2. Misture bem e adicione 100 μL da solução de BFA de trabalho aos poços contendo células nas placas de 96 poços. Além disso, adicione 30 μL de suspensão de partículas GB para avaliar a inibição do vacúolo e da formação de fagossomos.
  3. Para inibir a acidificação do fagossomo, adicione 100 μL da solução de BFA de trabalho a poços com vacúolos pré-formados (previamente tratados com partículas de GB). Incubar todos os poços a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h.
  4. Adicione 60 μL de corante vermelho neutro (NR) a cada poço, incube por mais 15 minutos e analise a formação e acidificação do vacúolo.

7. Coloração de laranja de acridina (AO)

  1. Trate as células cultivadas em lâminas de cavidade com 50 μL de GB e incube durante a noite em condições experimentais padrão.
  2. Após o tratamento, incubar as células com solução de laranja de acridina (1 mg/ml) durante 15 min a 37 °C para permitir a coloração selectiva de vacúolos e organelos vesiculares ácidos.
  3. Lave as células 3x com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) para remover o corante não ligado e minimizar a fluorescência de fundo.
  4. Analise rapidamente as lâminas com um microscópio de fluorescência equipado com uma objetiva de 20x e uma faixa de filtro de excitação azul de 450-492 nm, para avaliar a morfologia celular e a captação de laranja de acridina, o que fornecerá informações sobre a dinâmica vacuolar.

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Resultados

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O estudo destaca as principais respostas celulares às partículas GB em células de mamíferos. Utilizamos um citômetro de fluxo de imagem para investigar a internalização de partículas GB em células 3T3-L1 (Figura 1). As células foram expostas a partículas por períodos que variaram de 30 min a 12 h. Após 30 min, observamos as partículas na superfície celular (Figura 1B) e a membrana celular começou a se dobrar para dentro nos locais de fixação, indicando o início ...

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Discussão

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A fagocitose serve como um mecanismo de defesa imunológica crucial, permitindo o engolfamento e subsequente eliminação de partículas, patógenos e células apoptóticas. Para entender os processos de formação e maturação de fagossomos, partículas biocompatíveis inteligentes combinadas com técnicas avançadas de imagem são essenciais para estudar eventos dinâmicos, como a progressão vacuolar, acidificação e degradação de materiais engolfados18,19

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB) Core Research Grant (CRG/2022/009045), Departamento de Ciência e Tecnologia, Governo da Índia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
25 cm2 Frascos de culturaNEST, Índia707001
Placas de 96 e 6 poçosTarsons India Pvt. Ltd., Calcutá, Índia; Thermo Scientific, Índia980040; 140675
Laranja acridinaSRL, Índia82407
Antibióticos e solução de tripsina-EDTAAlta Mídia, Índia628242; 655111
Linhagens Celulares - HeLa, 3T3-L1 e RAW-264.7Centro Nacional de Ciência Celular (NCCS), Pune, Maharastra
pratos de cultura (35mm) SPL Lifesciences, Índia101350
Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM)MP Biomedicles, Índia1033126
Soro fetal bovino (FBS)Alta Mídia, Índia651257
Citômetro de fluxoMillipore, Estados UnidosAmnisCitômetros de fluxo de imagem Amnis,
Microscópio fluorscenteDiGi Lab, ÍndiaModelo: DiGi 110 Infinity
Godanti BhasmaPatanjali Ayurved240002
Corante vermelho neutroCDH, Índia593630
Microscópio de lapso de tempoNanoEnTek Inc.  Seul, Coréia.JuliAnalisador de células fluorescentes inteligente JuLi,
Microscópio de lapso de tempoLEEDZ MICRO IMA. Reino UnidoS.No. LIM225552358A58EA PRIME Microscópio invertido

Referências

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