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Artigo de método

RNA-Seq revela via de diferenciação celular Th17 como um mecanismo de lesão cerebral induzida por radiação

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DOI:

10.3791/68322

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20 de junho de 2025

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1Beijing Institute of Radiation Medicine

Neste artigo

Resumo

Este estudo tem como objetivo investigar a ativação da via de diferenciação celular Th17 em camundongos com lesão cerebral induzida por radiação.

Resumo

A radioterapia é uma modalidade terapêutica prevalente para neoplasias malignas de cabeça e pescoço; no entanto, invariavelmente resulta em danos induzidos por radiação ao tecido cerebral normal, culminando em lesão cerebral induzida por radiação (RBI). Apesar da extensa pesquisa sobre neuroinflamação induzida por radiação, a associação entre RBI e a via de diferenciação de células Th17 permanece inadequadamente compreendida. Os camundongos C57BL/6 foram submetidos a uma única administração de irradiação craniana de 30 Gy para desenvolver o modelo RBI. A função cognitiva foi avaliada por meio do labirinto aquático de Morris (MWM), teste de campo aberto, teste de reconhecimento de novos objetos e teste de rotarod. As alterações histopatológicas no tecido cerebral foram analisadas por meio da coloração de hematoxilina e eosina (H&E). A coloração por imunofluorescência foi empregada para avaliar a ativação da micróglia (IBA-1) e astrócitos (GFAP). O sequenciamento de RNA foi conduzido para identificar genes diferencialmente expressos, enquanto o Simple Western e o qPCR foram utilizados para examinar as principais moléculas de sinalização envolvidas na diferenciação celular Th17. Os camundongos RBI demonstraram déficits cognitivos acentuados, particularmente no aprendizado espacial e na retenção de memória. O exame histológico indicou ativação de micróglia e astrócitos no córtex e hipocampo de camundongos irradiados. A análise de sequenciamento de RNA identificou um enriquecimento significativo da via de diferenciação celular Th17 no córtex do grupo RBI. A validação adicional por meio de análises Simple Western e qPCR confirmou a regulação positiva de TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 e P-STAT3 no córtex de camundongos RBI. Essas descobertas sugeriram que a via de diferenciação celular Th17 desempenhou um papel fundamental na patogênese da lesão cerebral induzida por radiação. A neuroinflamação mediada por células Th17 pode ser um mecanismo crítico subjacente à disfunção cognitiva induzida por radiação.

Introdução

A radioterapia é um tratamento crucial para tumores primários e metastáticos de cabeça e pescoço, mas a lesão cerebral induzida por radiação (RBI) pode ocorrer como uma complicação grave, caracterizada por danos ao sistema nervoso central. A incidência de RBI varia de acordo com o tipo de tumor e a modalidade de tratamento, com taxas relatadas variando de 28% a 50% após radioterapia estereotáxica para meningiomas1, 1,9% a 5% para carcinoma nasofaríngeo 2,3, 1% a 24% para gliomas de baixo grau 4,5 e 8% a 20% para metástases cerebrais 6,7. A RBI é classificada em tipos aguda, tardia precoce e tardia, com disfunção cognitiva, particularmente comprometimento da memória, e déficits de aprendizagem sendo proeminentes na forma tardia. A disfunção cognitiva induzida por radiação (RICD), que afeta 50% a 90% dos sobreviventes de câncer de cabeça e pescoço em longo prazo, afeta significativamente a qualidade de vida8, mas sua patogênese permanece pouco compreendida e faltam estratégias preventivas e terapêuticas eficazes.

A neuroinflamação é uma característica patológica chave do RBI, exacerbando a ruptura da barreira hematoencefálica e dificultando a neurogênese no hipocampo. As células Th17, um subconjunto de células T CD4+ conhecidas por produzir a citocina pró-inflamatória IL-179, têm sido associadas a várias doenças neurodegenerativas, incluindo esclerose múltipla e doença de Parkinson10,11. Essas células, sob certas condições inflamatórias, podem atravessar a barreira hematoencefálica e contribuir para a neuroinflamação12. Desde sua descoberta em 2005, as células Th17 têm chamado a atenção por seu papel tanto nas respostas imunes contra patógenos quanto em seu envolvimento em doenças inflamatórias, tornando-as um alvo potencial para estudar os mecanismos de RBI e disfunção cognitiva relacionada13.

Neste estudo, apenas camundongos machos foram usados. A exclusão das fêmeas teve como objetivo evitar potenciais efeitos de confusão decorrentes de flutuações neuroinflamatórias associadas ao ciclo estral, pois os níveis de progesterona podem variar em até dez vezes em diferentes fases do ciclo14. Além disso, nosso modelo experimental foi desenhado para refletir o contexto clínico da radioterapia do câncer de cabeça e pescoço, em que aproximadamente 72% dos pacientes são do sexo masculino15. Consistente com isso, a maioria dos estudos publicados que investigam os mecanismos de lesão cerebral induzida por radiação (RBI) utilizou roedores machos para estabelecer características patológicas basais16.

Embora vários modelos tenham sido empregados para estudar o RBI, metodologias tradicionais como coloração histopatológica e Western blotting simples enfrentam limitações em termos de sensibilidade, rendimento e precisão17. Avanços recentes, como o sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e a proteômica de alto rendimento, forneceram insights mais robustos sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao RBI18. Essas tecnologias permitem uma compreensão abrangente das alterações na expressão gênica e nas proteínas, fornecendo dados mais precisos do que os métodos anteriores19. O Simple Western, em particular, é uma técnica nova e automatizada que combina as vantagens da eletroforese capilar com a detecção de proteínas por quimioluminescência, facilitando a análise de alto rendimento com volume mínimo de amostra e maior reprodutibilidade20. Em comparação com o Western blotting tradicional, o Simple Western elimina a necessidade de transferência de membrana e fornece dados quantitativos de expressão de proteínas, oferecendo várias vantagens em termos de sensibilidade e reprodutibilidade, especialmente na detecção de proteínas de baixa abundância21,22.

Diretrizes práticas para extração e preparação de RNA são cruciais para o sucesso do sequenciamento e quantificação de alta qualidade. Para uma extração ideal de RNA, recomendamos o uso de kits de isolamento de RNA de alta qualidade e a garantia de que a concentração esteja dentro da faixa de 100-1000 ng/μL, com um número de integridade de RNA (RIN) acima de 7,0 para evitar a degradação. Ao realizar a análise de proteínas usando o Simple Western, é importante garantir que as amostras de proteínas sejam devidamente desnaturadas e carregadas a uma concentração de aproximadamente 1-5 μg por capilar. Para validação de qPCR, use cDNA de alta qualidade sintetizado a partir de pelo menos 1 μg de RNA, garantindo condições consistentes de transcrição reversa. Armadilhas comuns na preparação de RNA, como contaminação com DNA genômico ou degradação de RNA, devem ser evitadas usando equipamentos livres de RNAse e realizando a separação de fases prontamente para evitar a degradação do RNA.

Ao incorporar esses métodos, este estudo visa investigar se a via de diferenciação celular Th17 é ativada em modelos murinos de RBI e como ela contribui para a patogênese da disfunção cognitiva induzida por radiação.

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Protocolo

Os procedimentos experimentais conduzidos aqui estão em estrita conformidade com as diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). A aprovação foi obtida do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Medicina de Radiação de Pequim (Aprovação nº. AF/SC-08/02; Data: 25 de fevereiro de 2024).

1. Irradiação craniana de camundongos

  1. Use um total de 10 camundongos C57BL/6 machos com idade entre 6 e 8 semanas no estudo, alocando cinco animais para o grupo RBI e cinco para o grupo controle, onde o grupo controle consiste em camundongos controle em branco que não receberam RBI. Mantenha os mouses sob condições ambientais controladas, incluindo temperatura regulada, umidade e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Aclimate os camundongos por 1 semana antes de iniciar o experimento.
  2. Anestesiar os animais com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% a 50 mg/kg de peso corporal. Confirme a anestesia adequada verificando a ausência de resposta reflexa a um beliscão firme da pata. Aplique pomada oftálmica veterinária em ambos os olhos imediatamente após o início da anestesia para evitar o ressecamento da córnea.
  3. Posicione os animais em decúbito ventral usando um dispositivo de contenção de madeira dedicado e cubra as áreas não visadas do corpo com uma placa de proteção de chumbo (Pb) de 3 mm de espessura (99,9% de pureza) para garantir a irradiação localizada.
  4. Colimar o campo de irradiação 2 x 2 cm2 com filtração inerente (1,5 mm Al + 0,25 mm). Alinhe o campo à linha média do crânio com mira de laser integrada (λ = 635 nm ± precisão de 0,5 mm) e verifique o posicionamento em tempo real com um sistema de câmera CMOS integrado e luz de fundo IR. Irradiar a região craniana com uma dose única de raios-X de 30 Gy a 1,325 Gy/min usando um sistema X-RAD 320 sob os seguintes parâmetros: 320 kVp/12,5 mA, SSD = 50 cm.
  5. Realize a calibração semanal da dose usando uma câmara de ionização rastreável posicionada no isocentro. Mantenha os parâmetros do feixe em 320 kVp/12.5 mA com filtragem de 3.2 mm HVL para atingir uma taxa de dose de 1.325 Gy/min (± variação de 3%). Verifique a uniformidade do feixe diariamente (> 95% dentro do campo) usando o filme Gafchromic EBT3.
  6. Administre meloxicam (1-2 mg / kg, por via subcutânea) uma vez ao dia por 3 dias para controlar a dor pós-cirúrgica. Colocar os animais numa câmara de recuperação pré-aquecida e monitorizar continuamente até que recuperem a plena consciência e possam manter a decúbito esternal. Não deixe os animais sozinhos durante o período de recuperação.
  7. Registre o peso corporal de todos os camundongos semanalmente durante o estudo. Observe os camundongos por um total de 4 semanas, incluindo 1 semana de aclimatação e 3 semanas após a irradiação.

2. Análise do comportamento animal

  1. Realize experimentos comportamentais 3 semanas após o RBI.
  2. Labirinto da água de Morris
    1. Encha uma piscina circular (diâmetro: 120 cm, altura: 50 cm) com água opaca (20-22 °C) usando leite em pó para obscurecer a plataforma submersa. Coloque uma plataforma oculta (diâmetro: 10 cm) 1 cm abaixo da superfície da água em um quadrante fixo.
    2. Aclimate os ratos à sala de testes por pelo menos 30 minutos antes dos testes. Comece a fase de treinamento colocando cada camundongo na água a partir de um dos quatro pontos iniciais selecionados pseudo-aleatoriamente (N, S, E, W).
    3. Deixe o mouse nadar por até 60 s para localizar a plataforma oculta. Se o mouse não conseguir encontrar a plataforma dentro de 60 s, guie-o até a plataforma e deixe-o permanecer lá por 15 s.
    4. Realize quatro tentativas por dia por camundongo com um intervalo entre tentativas de 15 minutos. Seque bem cada rato com uma toalha quente entre as tentativas para evitar hipotermia. Continue treinando por 5 dias consecutivos para avaliar a aquisição do aprendizado.
    5. No dia do teste da sonda, remova a plataforma e deixe o mouse nadar livremente por 60 s. Registre parâmetros como tempo gasto no quadrante alvo, travessias de plataforma e rotas de natação.
    6. Acompanhe e analise todos os ensaios usando um sistema automatizado de rastreamento de vídeo com experimentadores cegos para a alocação de grupos.
  3. Ensaio em campo aberto
    1. Aclimate os camundongos na sala de testes por pelo menos 30 minutos antes do experimento. Use um aparelho de campo aberto (50 cm x 50 cm x 40 cm) feito de plástico opaco. Ilumine a arena uniformemente (normalmente 25-30 lux) para evitar sombras fortes e minimizar o estresse.
    2. Limpe a arena com etanol 70% antes de testar cada animal para eliminar sinais de odor. Coloque o mouse suavemente no centro do campo aberto para iniciar o teste. Deixe o mouse explorar a arena livremente por 10 min.
    3. Registre a atividade e a posição locomotora usando um sistema de rastreamento automatizado. Defina a zona central como os 20% a 25% internos da área total. Meça o tempo gasto na zona central e a distância total percorrida.
    4. Após a sessão, retorne o mouse à sua gaiola inicial e limpe bem o aparelho.
  4. Novo teste de reconhecimento de objetos
    1. Aclimate os camundongos à sala de testes por pelo menos 30 minutos antes do experimento. Use uma arena de campo aberto (50 cm x 50 cm x 40 cm) com iluminação uniforme (20-30 lux). Limpe bem a arena com etanol 70% entre os animais para eliminar os sinais olfativos.
    2. Coloque cada rato na arena vazia e deixe-o explorar livremente por 10 minutos. Não coloque nenhum objeto durante esta fase.
    3. Após 24 h, coloque dois objetos idênticos (A e A′) em cantos opostos da arena (a pelo menos 8 cm das paredes). Coloque suavemente o mouse no centro da arena e deixe-o explorar por 10 minutos.
    4. Grave a interação do objeto usando um sistema de vídeo automatizado. Defina a exploração de objetos como o focinho do mouse a 2 cm do objeto enquanto orientado em direção a ele.
    5. Retorne o mouse à sua gaiola inicial após o teste e limpe a arena e os objetos.
    6. Após um intervalo de retenção de 1 h, coloque um objeto familiar (A) e um novo objeto (B) nas mesmas posições. Retorne o mouse para a arena e deixe-o explorar por 5 min.
    7. Registre o tempo gasto explorando cada objeto usando os mesmos critérios de antes. Calcule o índice de reconhecimento como:
      Índice de Reconhecimento (%) = [Tempo no objeto novo / (Tempo no objeto novo + familiar)] x 100
  5. Teste de Rotarod
    1. Aclimate os ratos à sala de testes por pelo menos 30 minutos antes do teste. Use um aparelho rotarod motorizado com um diâmetro de haste de ~3 cm e uma altura de ~30 cm acima da base.
    2. Defina o modo de rotação para a velocidade de aceleração (de 4 rpm a 40 rpm em 5 min). Limpe a superfície da haste com etanol 70% antes de colocar cada mouse.
    3. Coloque o mouse suavemente no centro da haste giratória, voltado para a frente. Inicie a rotação e comece a cronometrar imediatamente.
    4. Registre a latência para cair automaticamente pelo sistema. Pegue o mouse com segurança ao cair para evitar ferimentos. Deixe um período de descanso de pelo menos 15 minutos entre as tentativas para evitar fadiga.
    5. Realize 3 tentativas consecutivas por mouse por dia e calcule a média da latência como resultado final. Certifique-se de que todos os testes sejam realizados por experimentadores cegos sob condições consistentes. Retorne o mouse à sua gaiola inicial após o teste e desinfete o aparelho completamente.

3. Eutanásia animal e preparação de amostras

  1. Colete amostras de tecido 5 semanas após o RBI.
  2. Prepare pentobarbital sódico (100 mg / kg) e uma seringa estéril. Injete pentobarbital sódico por via intraperitoneal. Espere que o rato pare de respirar e que os batimentos cardíacos cessem, confirmando a morte.
  3. Decapite rapidamente na junção occipital e incise sagitalmente as suturas cranianas usando uma tesoura fina e, em seguida, eleve cuidadosamente os retalhos cranianos bilaterais com pinças curvas, preservando a integridade meníngea antes de cortar as conexões neurais.
  4. Transfira o cérebro intacto para uma matriz pré-resfriada dentro de 60 s para bissecção sagital mediana usando lâminas de barbear estéreis. Registre imediatamente as dimensões ântero-posteriores (8,2 ± 0,3 mm), largura mediolateral (4,5 ± 0,2 mm) e massa tecidual (112 ± 8 mg) com instrumentação de precisão.
  5. Disseque os tecidos corticais e hipocampais no gelo. Congele rapidamente o hemisfério esquerdo em nitrogênio líquido para sequenciamento de RNA, qPCR e Simple Western.
  6. Fixe o hemisfério direito em paraformaldeído a 4% (PFA) para histologia. Desidrate os cérebros fixos em etanol graduado de 70% a 100%, com cada passo durando 30 min.
  7. Limpe os cérebros em xileno por 2 h. Infiltrar os tecidos com parafina derretida a 60°C durante 4 h. Incorpore os cérebros limpos em blocos de parafina e deixe-os solidificar à temperatura ambiente. Corte cortes coronais com uma espessura de 5 μm usando um micrótomo.

4. Coloração de hematoxilina e eosina

  1. Desparafinize as seções de tecido imergindo as lâminas em xileno por 5 min, 3x. Reidrate as seções através de uma série graduada de etanol: 100%, 95%, 70% e água destilada, por 5 min cada.
  2. Pinte as seções com hematoxilina por 5 min, dependendo da intensidade de coloração desejada. Enxágue as seções em água corrente da torneira por 5 min para remover o excesso de hematoxilina.
  3. Diferencie as seções em ácido clorídrico a 1% em etanol por alguns segundos para obter o contraste desejado. Enxágue novamente em água corrente da torneira por 5 min. Pintar as seções com Eosin por 1 min.
  4. Enxágue brevemente as seções em água destilada. Desidratar as seções através de uma série graduada de etanol: 70%, 95% e 100%, por 5 min cada.
  5. Limpe as seções em xileno por 5 min, 3x. Monte as seções com uma lamínula usando um meio de montagem. Adquira imagens usando um microscópio Nikon Eclipse Ni-U com uma objetiva de 20x.

5. Imunofluorescência

  1. Fixe o tecido imergindo as lâminas em PFA a 4% por 15 min em temperatura ambiente. Lave as lâminas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min, 3x, para remover o excesso de PFA.
  2. Permeabilize o tecido incubando lâminas com 0,3% de Triton X-100 em PBS por 10 min em temperatura ambiente. Bloqueie a ligação inespecífica incubando as lâminas com soro normal a 5% por 1 h à temperatura ambiente.
  3. Incubar com anticorpos primários IBA-1 e GFAP, diluídos em tampão de bloqueio a uma diluição de 1:2000, durante a noite a 4 °C, dependendo das especificações do anticorpo. Lave as lâminas em PBS por 5 min, 3x, para remover o anticorpo primário não ligado.
  4. Incubar com anticorpo secundário Goat Anti-Rabbit IgG conjugado a Alexa Fluor 488, diluído a 1:1000 por 1 h em temperatura ambiente no escuro. Lave as lâminas em PBS por 5 min, 3x, para remover o excesso de anticorpos secundários.
  5. Monte as lâminas com um suporte de montagem antidesbotamento contendo DAPI. Sele a lamínula com esmalte transparente.
  6. Capture imagens de fluorescência usando um sistema de microscópio confocal com objetiva de 20x.
  7. Quantifique a intensidade da fluorescência usando ImageJ. Realize análises quantitativas usando a ferramenta Analisar partículas do ImageJ com limites de tamanho de 50-200 μm2 (microglia) e 100-500 μm2 (astrócitos). Subtraia o plano de fundo usando o algoritmo Rolling Ball (raio = 50 pixels).

6. Análise de qPCR

  1. Extraia o RNA total do tecido usando um kit de extração de RNA. Siga o protocolo do fabricante para homogeneização, lise e purificação de RNA.
  2. Quantificar o RNA extraído usando um espectrofotômetro para medir a concentração e avaliar a pureza (relação A260/A280). Certifique-se de que a concentração de RNA seja apropriada para a síntese de cDNA (100-500 ng/μL).
  3. Avalie a qualidade do RNA usando um bioanalisador. Certifique-se de que o RNA não mostra degradação (bandas afiadas para 18S e 28S rRNA) e tem um número de integridade de RNA (RIN) acima de 7.
  4. Prepare uma mistura de reação de 20 μL com 1 μg de RNA, tampão de transcrição reversa, oligo-dT, dNTPs, inibidor de RNase e transcriptase reversa.
  5. Incubar a 42 °C durante 60 min para sintetizar o cDNA. Aquecer a 85 °C durante 5 min para inativar a transcriptase inversa.
  6. Combine cDNA, master mix, primer direto, primer reverso (Tabela 1) e água livre de nuclease em uma placa de PCR de 96 poços. Use 2 μL de cDNA por reação de 20 μL e garanta uma concentração final de primer de 200 nM. Sele a placa com uma película adesiva óptica para evitar a evaporação.
GeneSequência de primer (5'-3', para frente/para trás)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TACGGACGTGGGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

Tabela 1: primers de sequência de qPCR.

  1. Coloque a placa de reação em um instrumento de PCR em tempo real e programe o termociclador. Utilizar as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 30 s.
  2. Normalize a expressão dos genes-alvo para GAPDH. Calcule os níveis de expressão relativa usando o método ΔΔCt e apresente os dados como mudanças de dobra em comparação com o grupo controle.

7. Análise de sequenciamento de RNA

  1. Anestesiar e sacrificar o camundongo seguindo os protocolos institucionais de cuidados com os animais. Perfunda imediatamente com PBS frio para remover o sangue circulante.
  2. Disseque o cérebro no gelo. Isole o córtex cerebral usando ferramentas de dissecação estéreis. Minimize o tempo de dissecção para preservar a integridade do RNA.
  3. Congele rapidamente o tecido cortical em nitrogênio líquido. Conservar a -80 °C se a extração de ARN não for realizada imediatamente.
  4. Homogeneizar o córtex congelado (30-50 mg) em 1 mL de reagente de extração de RNA usando um homogeneizador motorizado até que não restem fragmentos visíveis.
  5. Execute a separação da fase do clorofórmio. Adicione 200 μL de clorofórmio, agite vigorosamente por 15 s, incube por 2-3 min em temperatura ambiente e centrifugue a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
  6. Transfira a camada superior para um novo tubo, adicione um volume igual de etanol a 70% e prossiga com a purificação do RNA usando um kit à base de coluna de sílica.
  7. Use a digestão de DNase na coluna para remover o DNA genômico durante a purificação do RNA. Colete o RNA total em 30-50 μL e mantenha no gelo para uso imediato.
  8. Use um espectrofotômetro para quantificar a concentração e a pureza do RNA. Confirme a proporção A260/A280 de ~2.0. Analise 1 μL de RNA em um bioanalisador. Verifique se o RIN é maior que 8,0 para sequenciamento.
  9. Use um protocolo de seleção poli(A) e um kit de preparação de biblioteca entrançada. Siga o protocolo do fabricante para gerar bibliotecas de 300 a 400 pb. Purifique bibliotecas com um kit comercial.
  10. Use um Bioanalyzer para confirmar o tamanho do fragmento e quantificar com bibliotecas de pool equimolarmente. Execute o sequenciamento de extremidade emparelhada (2x, 150 bp) usando uma plataforma Illumina.
  11. Adaptadores de corte usando Trim Galore, avalie a qualidade com FastQC, alinhe leituras ao genoma do camundongo (GRCm39) usando STAR e quantifique a expressão gênica com featureCounts. Identifique genes diferencialmente expressos usando DESeq2.
  12. Use a saída do DESeq2 e filtre os DEGs de genes significativamente expressos diferencialmente (valor de p ajustado < 0,05 e |log2FC| > 1). Realize a análise de enriquecimento das vias GO e KEGG usando Phyper com base no teste hipergeométrico. Identifique as vias com valor de P corrigido ≤ 0,05 como estatisticamente significativas.

8. Análise ocidental simples

  1. Homogeneizar o córtex cerebral de camundongo em tampão RIPA com inibidores de protease e fosfatase e, em seguida, centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C para remover detritos. Determine a concentração de proteína usando um ensaio de BCA.
  2. Desnature as amostras de proteína misturando-as com tampão de amostra e incubando a 95 ° C por 5 min para garantir a desnaturação completa.
  3. Carregue 3 μL de amostras de proteína desnaturada nos capilares ocidentais simples. Certifique-se de que as amostras estejam carregadas corretamente para evitar transbordamento. Coloque os capilares no instrumento Simple Western.
  4. Incube as proteínas separadas com anticorpos primários diluídos 1:50, incluindo p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 e IL-17, por 30 min.
  5. Lave o sistema capilar com tampão de lavagem por três lavagens de 5 min cada para remover anticorpos primários não ligados. Adicione o anticorpo secundário conjugado com HRP diluído em tampão de bloqueio e incube por 30 min.
  6. Realize 3 lavagens de 5 min cada com tampão de lavagem para remover o excesso de anticorpos secundários. Execute o programa de detecção no sistema Simple Western para detectar automaticamente as proteínas usando quimioluminescência.
  7. Analise os dados usando o software Compass for Simple Western. Quantifique a expressão da proteína comparando as áreas de pico relativas no eletroferograma. Normalize os dados para a proteína GAPDH.

9. Análise estatística

  1. Abra o GraphPad Prism 9.0.0. software. Clique em Arquivo > Importar Dados para carregar os dados. Apresente os dados como médias ± DP. Use o teste t não pareado para comparações entre dois grupos.
  2. Avalie a normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk. Se a normalidade for violada (p < 0,05), aplique o teste U de Mann-Whitney para comparações entre os grupos. Se a normalidade for satisfeita (p ≥ 0,05), realizar um teste t de amostras independentes para avaliar as diferenças entre os grupos.
  3. Relate os resultados com valores de p. Considere p < 0,05 como estatisticamente significativo. Use a seguinte notação: n.s. para não significativo, * para p < 0,05, ** para p < 0,005, *** para p < 0,0005 e **** para p < 0,0001.

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Resultados

Comprometimento cognitivo em camundongos RBI
Após a exposição a uma irradiação de 30 Gy em todo o cérebro, o peso corporal dos camundongos foi monitorado semanalmente. A função cognitiva foi avaliada durante a4ª semana (Figura 1A). As medidas iniciais indicaram que os pesos corporais dos grupos controle e RBI eram semelhantes. No entanto, entre 1 e 3 semanas após a irradiação, o grupo RBI demonstrou uma diminuição significativa ...

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Discussão

Etapas críticas dentro do protocolo
Este protocolo envolve a indução de RBI em camundongos, seguida por avaliações abrangentes da neuroinflamação e da via de diferenciação celular Th17 (Figura 6). Uma etapa crítica é a irradiação craniana de camundongos C57BL / 6 com uma dose de 30 Gy, um modelo bem estabelecido para RBI1. A calibração precisa da dose usando câmaras de ionização garante a reprodutibilidade

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

O apoio a este trabalho foi fornecido pelo Instituto de Medicina de Radiação de Pequim

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Módulo de separação de 12-230 kDa, cartuchos capilares de 8 x 25 ProteinSimpleSM-W004para
anticorpo anti-GAPDHSimpleWestern ProteintechHRP-60004diluição 1:500/anticorpo para
anticorpo anti-GFAPAbcamab7260diluição 1:2000/anticorpo para imunofluorescência
anticorpo anti-IBA-1Abcamab178846Diluição/anticorpo 1:2000 para imunofluorescência
anti-IL-17 A/F anticorpoThermoMA5-23748Diluição/anticorpo 1:10 para anticorpo
SimpleWestern anti-IL-1β CST12242Diluição/anticorpo 1:50 para
anticorpo anti-IL-6SimpleWestern ThermoMA5-23800diluição/anticorpo 1:5 para
Módulo de Detecção Anti-Mouse SimpleWesternAnticorpo secundário ProteinSimpleDM-002para anticorpo SimpleWestern
anti-P-STAT3(Try705)ThermoMA5-15193diluição/anticorpo 1:2 para Módulo
de Detecção Anti-CoelhoSimpleWestern AnticorpoProteinSimple DM-001para SimpleWestern
anti-ROR&gama; anticorpo tThermo14-6988-82diluição/anticorpo 1:5 para
anticorpo anti-STAT3SimpleWestern Thermo710077diluição/anticorpo 1:20 para
anticorpo anti-TGF β-1,2,3ThermoMA5-23795diluição/anticorpo 1:10 para ensaio SimpleWestern
BACEnsaios de proteínaThermoA55860
Pacote Padrão EZ 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8para cabra SimpleWestern
Anti-Rabbit IgG H & LAbcamab1500771:1000 diluição/anticorpo para Imunofluorescência
Kit RNeasyQiagen74134Extração de RNA
SuperScript IV Sistema de Síntese de Primeira FitaThermo Fisher Scientific18091050Transcrição Reversa
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
TRIzol15596026
SimpleWestern secundário Extração do RNA de Invitrogen do reagente de

Referências

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