Este protocolo descreve técnicas otimizadas para analisar a degeneração e preservação de fotorreceptores em um modelo murino de retinite pigmentosa, incluindo administração intravítrea de drogas, seccionamento de criostato e imunofluorescência. O método garante a integridade da retina e fornece dados quantitativos sobre a eficácia das intervenções terapêuticas.
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Artigo de método
Analisando a degeneração e preservação de fotorreceptores em um modelo murino de retinite pigmentosa
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Neste artigo
Resumo
Resumo
As retinopatias afetam centenas de milhões de pessoas em todo o mundo e são causas significativas de deficiência visual e cegueira. Dentre essas doenças, a retinite pigmentosa (RP) é uma doença ocular hereditária caracterizada por degeneração progressiva da retina, afetando aproximadamente 1,5 a 2 milhões de pessoas em todo o mundo. Estudos de prova de conceito em modelos animais de distrofias retinianas hereditárias formam uma importante base de evidências para estudos em mecanismos fisiopatológicos da doença, eficácia e segurança do tratamento. A injeção intravítrea em camundongos e o seccionamento do criostato são técnicas amplamente utilizadas para investigar os efeitos de drogas em modelos de RP, pois permitem uma entrega precisa de substâncias no humor vítreo e a preparação de amostras histológicas de alta qualidade para análise detalhada das alterações retinianas. Além disso, a contagem de células por meio de imunofluorescência usando anticorpos contra a recoverina, uma proteína dependente de cálcio expressa em fotorreceptores retinianos, tem sido recentemente empregada para estudar alterações celulares associadas à degeneração retiniana em modelos de RP, pois essa abordagem facilita a avaliação da perda de fotorreceptores e potencial preservação celular após intervenções terapêuticas. A injeção intravítrea foi otimizada para garantir a integridade ocular e resultados confiáveis, utilizando uma agulha fina para administrar a solução na câmara vítrea. Após um período pré-definido para avaliar os efeitos do fármaco, é realizado o processamento histológico, com amostras seccionadas a 10 μm de espessura usando um criostato, seguido de marcação por imunofluorescência com anticorpos recoverina. Por fim, a contagem de células é realizada para avaliar se o tratamento com drogas exerceu efeito protetor, evidenciado pela preservação dos fotorreceptores. Embora essas técnicas tenham sido amplamente aplicadas para gerar dados consistentes na pesquisa de retinopatia, persistem desafios para alcançar o manuseio preciso do tecido e a qualidade do processamento. Este protocolo fornece uma abordagem padronizada para otimizar cada etapa, desde a injeção intravítrea até a preparação de cortes histológicos, garantindo resultados reprodutíveis e de alta qualidade.
Introdução
A visão é um dos sentidos mais complexos do sistema sensorial, essencial para captar estímulos visuais ambientais e traduzi-los em sinais eletroquímicos, que são processados no cérebro para formar imagens. Vários fatores biológicos, como envelhecimento, defeitos genéticos e doenças, podem comprometer a visão, impactando significativamente na qualidade de vida e nas atividades diárias.
O olho humano consiste em três câmaras primárias. A camada externa, formada pela córnea e esclera, fornece suporte estrutural ao globo ocular. A camada intermediária inclui a íris, o corpo ciliar e a coroide, sendo esta última responsável por fornecer sangue aos fotorreceptores. Por fim, a camada interna compreende a retina, uma estrutura responsável por processar estímulos luminosos e converter a luz em sinais elétricos enviados ao cérebro para a formação de imagens 1,2.
A retina neural é composta por várias camadas celulares, incluindo células especializadas, como fotorreceptores, células bipolares, células horizontais, células amácrinas e células ganglionares. Além disso, a retina contém células gliais, como microglia, astrócitos e células de Müller, bem como células epiteliais pigmentadas. Este último, localizado na porção não neural da retina, desempenha um papel crítico na manutenção da integridade estrutural, proteção e suporte aos fotorreceptores 3,4. A porção neural abriga células sensoriais e neuronais diretamente envolvidas na captura e processamento de luz 5,6,7.
Sendo essencial para a visão, a retina é frequentemente afetada por patologias que podem levar à cegueira. Dentre essas condições, destaca-se a retinite pigmentosa (RP) como uma das principais retinopatias hereditárias, com mais de 80 genes associados à suaetiologia8,9. A FRy é uma doença heterogênea, predominantemente herdada de forma autossômica dominante ou recessiva, mas também pode ocorrer como ligada ao cromossomo X ou devido a mutações espontâneas10.
Com prevalência global estimada entre 1 em 3.000 e 1 em 7.000 indivíduos, dependendo da população e região geográfica11,12, a FRy geralmente se manifesta durante a adolescência ou início da idade adulta, com sintomas iniciais como diminuição da visão noturna e perda do campo visual periférico. À medida que a doença progride, a visão central fica comprometida, podendo levar à cegueira total 9,13.
Embora ainda não haja cura para a RP, várias terapias em desenvolvimento mostraram potencial para retardar ou reverter a progressão da doença. Entre essas abordagens estão as terapias genéticas, celulares e farmacológicas, bem como os dispositivos eletrônicos. Para avançar na compreensão do RP e avaliar novas intervenções, modelos murinos de degeneração retiniana têm sido amplamente utilizados. Esses modelos, muitas vezes chamados de rd (degeneração da retina), são ferramentas valiosas para estudar a base molecular e as terapias para RP. Dentre os vários modelos utilizados no estudo da retinite pigmentosa, a linhagem de camundongos Pde6βrd10/rd10 (rd10) apresenta uma mutação missense no gene que codifica a subunidade β específica do bastonete da fosfodiesterase14, exibindo uma degeneração lenta dos fotorreceptores semelhante à que ocorre em humanos15.
A administração intravítrea de medicamentos tem sido amplamente utilizada em vários estudos 16,17,18. Este protocolo é adequado para pesquisadores que estudam os efeitos dos medicamentos na retina, particularmente em relação à sobrevivência das células fotorreceptoras. Desta forma, o objetivo primário deste protocolo é otimizar a administração de fármacos via injeção intravítrea em um modelo murino de retinite pigmentosa (RP) e avaliar a sobrevida dos fotorreceptores usando imunofluorescência para recoverina, um marcador de células fotorreceptoras. A injeção intravítrea permite a administração localizada de medicamentos, minimizando os efeitos colaterais sistêmicos, aumentando a biodisponibilidade da retina e reduzindo os efeitos adversos em outros órgãos. Por outro lado, a imunofluorescência para recoverina permite uma análise específica da sobrevida dos fotorreceptores, fornecendo uma ferramenta eficaz para avaliar a eficácia dessa estratégia terapêutica. No entanto, sua aplicabilidade depende de fatores como seleção do modelo animal, precisão da injeção e duração do tratamento, que devem ser considerados ao adaptar esse método a outros cenários experimentais.
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Protocolo
O projeto e todos os protocolos realizados dentro dele seguem as diretrizes de cuidados com os animais do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA - UFF) sob o número 1464280219.
1. Animais
- Use a cepa murina rd10, que sofre degeneração dos fotorreceptores, e a cepa C57 Black / 6 (fundo de rd10). Manter estas estirpes num ciclo claro-escuro de 12 h/12 h, com acesso ad libitum à água e aos alimentos.
2. Anestesia
- Realizar uma injeção intraperitoneal com um anestésico preparado na dose de 80 mg/kg de cetamina e 8 mg/kg de xilazina, diluídos em água destilada. A cetamina atua como um inibidor do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), proporcionando efeitos analgésicos, enquanto a xilazina funciona como um sedativo anestésico.
- Para a injeção intraperitoneal, calcule o volume a ser injetado como 10 μL x Peso (g).
- Contenha o mouse para garantir o acesso livre ao abdômen. Limpe o quadrante inferior direito da cavidade abdominal com álcool 70%, onde a agulha deve ser inserida com o chanfro voltado para cima.
- Para confirmar a ausência de reflexo de dor, aperte suavemente a cauda ou a pata do animal. Se não houver reação, isso indica que o animal está devidamente anestesiado.
3. Injeção intravítrea
- Com os animais anestesiados, exponha os olhos e, utilizando um microscópio estereoscópico binocular com aumento de 10x, identifique a área do limbo, uma faixa cinza entre a córnea e a esclera, onde será realizada a injeção.
- Para realizar a injeção, é necessária a assistência de outra pessoa. Sob um microscópio estereoscópico binocular, uma pessoa tem que segurar o animal e inserir a agulha, enquanto o assistente pressiona o êmbolo da seringa para introduzir a substância no olho.
- Primeiramente, utilize uma seringa ultrafina com agulha fixa (31 G x 6 mm) para fazer uma punção na região do limbo, tomando cuidado para não inserir a agulha muito profundamente; Inserir apenas metade do chanfro é suficiente.
- Em seguida, insira a Micro Seringa portátil pré-esterilizada (calibre 26 S sem chanfro), contendo 1 μL do líquido/medicamento de interesse, na punção feita pela seringa de insulina.
- Peça ao assistente que pressione o êmbolo da seringa lentamente, garantindo que todo o volume seja administrado por aproximadamente 30 s.
- Repita o processo para o outro olho do mesmo animal e registre o tempo.
- Se houver mais de um grupo experimental, marque a orelha do animal para garantir a identificação adequada de cada grupo.
- Use 1 gota de solução 0,01 M PBS em cada olho do animal para evitar o ressecamento.
- Após esses procedimentos, coloque os animais em uma almofada de aquecimento, com a temperatura ajustada para 37 °C, até que eles acordem. Pode levar de 1 a 2 horas. Monitore os animais continuamente enquanto anestesiados e, uma vez acordados, devolva-os às gaiolas até o momento da análise.
- Realize uma sessão de treinamento inicial usando um corante visível, como azul de tripano, para ajudar os operadores a refinar sua técnica de injeção intravítrea em camundongos.
NOTA: O corante facilita a visualização do trajeto da agulha, permitindo ajustes precisos na profundidade e no ângulo da injeção, reduzindo o risco de danos à estrutura ocular e aumentando a segurança do procedimento.
4. Eutanásia e preparação ocular
- Após uma duração específica de tratamento após a injeção, eutanasiar os animais por inalação de uma overdose de isoflurano a 5%. Continue a exposição até pelo menos 1 minuto após a cessação da respiração. Para garantir a morte, segure o animal pela nuca e aplique tração firme na cauda até que a luxação cervical seja alcançada.
- Antes de remover os olhos, marque o pólo temporal. Aplique cuidadosamente o marcador ou agulha/pino quente na região temporal da esclera, garantindo que a marcação seja visível e precisa. Esta etapa servirá como um ponto de referência para orientação durante o processo de seccionamento.
- Em seguida, exponha os olhos e, com um bisturi estéril e uma tesoura de iridectomia, corte o tecido circundante para separar os tecidos conjuntivo e muscular e expor o globo ocular. Em camundongos, disseque os músculos oculares com cuidado, pois isso pode ser um desafio. Para facilitar o procedimento, faça uma incisão lateral com um bisturi estéril em ambos os cantos da pele do olho.
- Usando uma pinça curva de ponta média, remova suavemente os olhos da órbita ocular segurando-os pelo nervo óptico e fixe imediatamente o tecido por 5 minutos em uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% à temperatura ambiente (RT).
- Após a fixação em solução de PFA, transfira os olhos para uma placa de vidro, usando uma pinça curva de ponta média. Esta placa funciona como uma plataforma de dissecação e garante que contém um tampão fosfato a uma concentração de 0,1 M pH 7,4.
- Em seguida, coloque a placa sob um microscópio estereoscópico binocular com uma ampliação de 10x e faça uma pequena incisão logo acima do limbo (borda da córnea) usando um bisturi. Em seguida, faça um corte circunferencial seguindo o limbo com tesoura de microiridectomia para separar a córnea.
- Remova a córnea, juntamente com a íris e o cristalino, usando uma pinça Dumont #5. Por fim, fixe os olhos novamente na solução de PFA a 4% por 55 min. Depois disso, lave os olhos três vezes com tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4.
5. Criopreservação e congelamento
NOTA: A secção do criostato do tecido retiniano foi realizada conforme descrito anteriormente com alguns ajustes19.
- Criopreservar os olhos com um gradiente de sacarose de 10%, 20% e 30%, diluído em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Mergulhe os olhos sequencialmente nas soluções de sacarose, começando com a concentração mais baixa (10%) e aumentando gradualmente até a mais alta (30%). Cada etapa dura o tempo necessário até que os olhos se acomodem no fundo do recipiente, indicando que a próxima concentração pode ser usada. Na concentração final, conservar os olhos a 4 °C durante cerca de 12 h.
- No dia seguinte, retirar o excesso de sacarose a 30% e colocar os olhos em um recipiente redondo de alumínio de 2 cm de diâmetro, disposto de acordo com os grupos experimentais.
NOTA: Faça um recipiente de papel alumínio no tamanho apropriado de acordo com o número de grupos experimentais. - Sob um microscópio estereoscópico binocular com aumento de 10x, remova o excesso de sacarose de dentro e ao redor do globo ocular usando uma pipeta ou papel de filtro, tomando os cuidados necessários para não danificar a estrutura do tecido.
- Incorporar os olhos em um meio de congelação de temperatura de corte ideal (OCT), tendo o cuidado de evitar a formação de bolhas no interior ou à volta dos olhos, e deixá-los durante 1 h em temperatura elevada.
- Após 1 h em OCT, posicione os olhos com o ponto de referência previamente marcado voltado para cima. Coloque o recipiente de papel alumínio em uma placa de alumínio adequada dentro de uma pequena caixa de isopor para congelar.
- Despeje cuidadosamente nitrogênio líquido na placa de alumínio, ao redor do recipiente de alumínio. Certifique-se de que o nitrogênio se espalhe uniformemente pela superfície. Isso promove o congelamento uniforme do tecido. Certifique-se de que o nitrogênio líquido não entre em contato direto com os olhos dentro do recipiente de alumínio. Em seguida, prossiga com a secção dos olhos usando um criostato.
6. Preparação da lâmina
- Espalhe poli-L-lisina (200 μg/mL) nas lâminas de vidro fosco.
- Aguarde 12 h para que as lâminas sequem e estejam prontas para uso.
7. Seccionamento do criostato
- Em um criostato, posicione o bloco congelado na plataforma.
- Gire o volante para fazer seções com uma espessura de 10 μm.
- Ajuste a posição do bloco para garantir que todos os olhos estejam igualmente presentes no corte.
- Continue cortando até que o nervo óptico seja identificado, usando um microscópio de campo claro.
- Recolha as secções nas lâminas pré-tratadas com poli-L-lisina.
- Armazenar as lâminas a -20 °C até à análise.
8. Imunofluorescência
NOTA: A imunofluorescência foi realizada conforme descrito anteriormente, com alguns ajustes 19,20.
- Incubar as lâminas obtidas da seção no criostato com 100 μL de Triton X-100 a 0,5% em PBS 0,01 M por 15 min em RT para permeabilizar a membrana plasmática celular.
- Lave as lâminas duas vezes com 0,01 M PBS por 5 min cada em RT para remover o excesso de Triton X-100.
- Incubar com 100 μL de albumina sérica bovina a 1% (BSA) em PBS 0,01 M por 30 min em RT para bloquear locais de ligação de anticorpos não específicos.
- Após o bloqueio, incubar os cortes com 100 μL de anti-recuperaina na concentração de 1:1500 diluída em BSA 1% para marcar as células fotorreceptoras, durante a noite a 4 °C (geladeira).
- No dia seguinte, incubar as secções com 100 μL de anticorpo secundário policlonal anti-coelho 488 ou anticorpo secundário policlonal anti-coelho 568 1:500 diluído em BSA 1% durante 2 h à RT.
- Lave as lâminas duas vezes com 0,01 M PBS por 5 min cada em RT.
- Incube as seções com 100 μL de DAPI 1 mg / mL (4',6-diamidino-2-fenilindol) por 2-3 min em RT.
- Lave a lâmina uma vez com 0,01 M PBS por 5 min em RT.
- Finalmente, trate as seções com um meio de montagem contendo 2,5 g de galato de n-propil em 40 mL de glicerol em tampão fosfato 0,1 M pH 7,4. Eles atuarão como um reagente anti-desbotamento e um meio de montagem, preservando as amostras. Coloque uma lamínula (24 mm 50 mm) em cima das lâminas e, em seguida, sele as seções com esmalte. Depois disso, prossiga com a visualização das amostras ao microscópio.
9. Fotomicrografia de microscópio de fluorescência
- Para adquirir imagens das células marcadas usando a técnica de imuno-histoquímica, use um microscópio óptico de fluorescência equipado com filtros azul, verde e vermelho. Além disso, conecte uma câmera para fotomicrografia de slides. Para a obtenção das fotomicrografias, utilizar um computador com o software LAS V3.7 (Leica) (software de imagem), que deve estar aberto para visualização simultânea com o microscópio.
- Coloque a lâmina na platina do microscópio. Inicialmente, use a objetiva de menor ampliação e o filtro azul.
- Ajuste o foco usando os botões de foco grosso e fino até que a retina com as células marcadas em azul (núcleos celulares) seja claramente visualizada.
- Selecione a área desejada da retina para a imagem. Aumente gradualmente a ampliação até 40x a objetiva, ajustando o foco conforme necessário.
- Depois de ajustar o foco, puxe o pino de bypass para transferir a imagem do microscópio para o software de imagem. Selecione os filtros desejados (A4 (azul), L5 (verde) e TX2 (vermelho)). Ajuste os seguintes parâmetros: Exposição, Ganho e Gama, para garantir que a imagem seja nítida e o mais próxima possível do que é observado ao microscópio.
- Com ampliação de 400×, capturar quatro campos com área de 113 × 113 μm, seguindo uma orientação da periferia para o centro da retina. Certifique-se de que dois desses campos representem a região periférica e dois representem a região central da retina.
- Para obter fotomicrografias de campo periférico, capture imagens a aproximadamente 50 μm das bordas do olho. Para fotomicrografias de campo central, selecione áreas adjacentes localizadas a 50 μm do nervo óptico e adquira as imagens. Use os olhos direito e esquerdo para quantificações, resultando em um total de oito campos analisados por tratamento.
- Após completar todas as fotomicrografias, prossiga com a quantificação manual das células imunomarcadas.
10. Quantificação celular
- Abra o programa ImageJ v.1.54g. Dentro do programa, clique em Arquivo, depois em Abrir e selecione a imagem salva no computador.
- Com a imagem já aberta, clique em Multiponto. Use esta ferramenta para quantificar as células clicando com o botão esquerdo em cada célula a ser contada.
- Quantifique as células colocalizadas, ou seja, positivas para recoverina e DAPI, na camada nuclear externa (ONL).
- Quando a contagem estiver concluída, clique duas vezes com o botão esquerdo do mouse para ver o número total de células que foram marcadas.
- Depois de determinar o número de células positivas para recuperação, insira o número de células na tabela de quantificação do Excel e passe para a próxima fotomicrografia.
- Repita todas as etapas para os 8 campos correspondentes a cada animal.
- Calcule a média desses oito campos, correspondendo a um único ponto experimental para toda a retina (n = 1). Para o gráfico de retina periférica, utilize a média dos campos periféricos, totalizando quatro campos: dois do olho esquerdo e dois do olho direito. Essa média corresponde a um ponto experimental para a retina periférica (n= 1). Crie o centro do gráfico de retina da mesma maneira que o gráfico periférico, alterando apenas a região.
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Resultados
A técnica de imunofluorescência para marcação de fotorreceptores, células recoverin-positivas, permitiu observar o padrão de degeneração dos fotorreceptores em animais rd10 e C57Bl6, sendo este último considerado saudável (Figura 1). Como pode ser visto, a marcação para células positivas para recoverina é exclusiva da camada nuclear externa (ONL) onde os fotorreceptores são encontrados, incluindo a marcação de segmentos internos a essas células, tanto em anim...
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Discussão
A retina é um tecido delicado e de difícil acesso; Portanto, a técnica a ser utilizada para realizar o tratamento farmacológico direcionado a esse tecido precisa ser considerada. A injeção intravítrea é uma técnica bem estabelecida e amplamente utilizada para a administração de medicamentos diretamente na retina, particularmente no tratamento de doenças oculares, como degeneração macular relacionada à idade21, retinopatia diabética22 e...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi realizado durante uma bolsa de pesquisa apoiada pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), e também foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,3% Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Solução para bloqueio de buffer |
| 1% BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | Solução para bloqueio de buffer |
| 1% Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | Fc Block necessário para bloquear buffer |
| 150 W Lâmpada LED | Amazon | B07VH3CVSF | Fonte de luz LED para fotoirradiação de tecido |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Solução para bloquear etapas de buffer e lavagem |
| Recipiente de armazenamento de 20 galões | Amazon | B001B1C4G0 | Recipiente para processo de fotoirradiação |
| Lâmpada LED de inundação RGBW de 40 W | Fonte | de | luz Amazon B08QFPJSMD RGB para fotoirradiação de tecido |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Actina de músculo liso alfa DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Kit de bloqueio de avidina/biotina | Abcam | ab64212 | Solução de bloqueio de avidina e biotina |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | Solução de fixação de 554714 | de |
| desparafinação BOND | Solução de | desparafinização | Leica Biosystems |
| epítopos BOND 1 | Leica Biosystems | NC0235529 | Solução de recuperação de epítopos de pH 6 à base de citrato ( ER1) |
| Solução de Recuperação de Epítopos BOND 2 | Leica Biosystems | NC0235530 | Solução de Recuperação de Epítopos de pH 9 à base de EDTA (ER2) |
| Sistema de Detecção de Pesquisa BOND | Leica Biosystems | NC0396648 | Reagente de coloração de pesquisa automatizado |
| BOND RX Research Stainer | Leica Biosystems | NA | Plataforma automatizada de coloração de pesquisa |
| BOND Wash Solution | Leica Biosystems | NC0221077 | Tampão de lavagem |
| CD15 | BD Biosciences | 347420/AB_400298 | Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82/AB_11150959 | Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& D Systems | FAB8165G/AB_2728839 | Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| CD45 Ficoeritrina (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE/NA | Anticorpo para imagem IBEX. Veja a Tabela 1. |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135/AB_2892745 | Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Anticorpo anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Anticorpo anti-rato IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/ AB_2762830 | para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Anticorpo anti-rato IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Anticorpo anti-coelho IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Sistema de coloração EasyDip | Newcomer Supply | 5300KIT | Sistema de coloração deslizante |
| Fluoromount-G | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | Mídia de montagem |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Coloração nuclear para imagem IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Imaris File Converter x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Conversor de arquivos gratuito | |
| ImarisViewer software x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Software de processamento de imagem gratuito | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Caneta de barreira hidrofóbica |
| Borohidreto de lítio (1 grama) | STREM Chemicals | 93-0397 | Produto químico para inativação de corantes, compre pequenas alíquotas deste produto químico (1 grama) |
| Lumican Biotina | R& D Systems | BAF2846 | Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48393-241 | Tampas de lâminas |
| de vidro Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Sistema de Microondas PELCO BioWave Pro | Ted Pella Inc | 36500-230 | Microondas científicas sem aquecimento |
| PELCO SteadyTemp Pro | Ted Pella Inc | 50062 | Controle de temperatura totalmente automatizado para microondas científicas |
| SimpleITK | Software | Software de registro e processamento de canais | |
| Streptavidin Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | Reagente de marcação para imagens IBEX. Veja a Tabela 1. |
| Microscópio de campo amplo | Leica Microsystems | NA | Leica Microsystems Gerador de imagens THUNDER com fonte de luz LED8 e software LAS X (3.7.1.21655). Para imagens de fluorescência, um filtro quad-band personalizado com roda de filtro externo (PN: 11536075) com dois filtros adicionais de banda única (PN: 8118215) foi usado para obter imagens de sete canais de corante por passagem. As linhas de excitação, dicróica e de emissão do filtro são (1) cubo de banda quádrupla: dicróico em 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, sem filtros de excitação ou emissão; (2) Roda do filtro externo posição 1: 434/32, posição 2: 520/40, posição 3: 585/20, posição 4: 720/60, posição 5: passagem; (3) banda única 1— 585/22 excitação, 594 dicróica, 625/30 emissão; (4) banda única 2— 635/20 excitação, 647 dicróica, 667/30 emissão. |
| Limpador de lentes ópticas Zeiss | Amazon | B00GPVQVCO | Microscópio limpador de lentes objetivas |
| Anticorpos | |||
| Ag85B | Abcam | ab43019 | IgG policlonal de coelho, ciclo 1 |
| Actina de músculo liso alfa DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R | 1A4/asm-1, ciclo 1 |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R&;D Sistemas | FAB8165G | IgG policlonal de cabra, ciclo 1 |
| CD8 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 372906 | C8/144B, ciclo 1 |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | KP1, ciclo 1 |
| Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814 | Burro policlonal, ciclo 1 |
| Burro anti-rato IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787 | Burro Policlonal, ciclo 1 |
| Burro anti-coelho IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794 | Burro Policlonal, ciclo 1 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Rótulo nuclear, ciclo 1 |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | MMA, ciclo 2 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | L26, ciclo 2 |
| CD45 Ficoeritrina (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 2B11 + PD7/26, ciclo 2 |
| Burro anti-rato IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020 | Burro Policlonal, ciclo 2 |
| Lumican Biotina | R& D Systems | BAF2846 | IgG policlonal de cabra, ciclo 2 |
| Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | AE-1/AE-3, ciclo 2 |
| Estreptavidina Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | N/A, ciclo 2 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | ciclo 2 |
| Solutions | |||
| Blocking Buffer (Ciclo 1) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.3% em volume |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 1% em volume |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1% em volume |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 97,7% por volume |
| Solução de coloração de anticorpos primários #1 (Ciclo 1) | |||
| Tampão de bloqueio (Ciclo 1) | Veja acima | Aumente o volume após adicionar anticorpos | |
| Hoechst | Biotium | 40046 | 1:5000 |
| CD8 AF647 | BioLegend | 372906 | 1:10 |
| Solução de coloração de anticorpos primários #2 (Ciclo 1) | |||
| Blocking Buffer (Ciclo 1) | Veja acima | Aumente o volume após adicionar anticorpos | |
| CD4 AF488 | R & D Systems | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | 1:100 |
| Secondary Antibody Staining Solution #1 (Ciclo 1) | |||
| Blocking Buffer (Ciclo 1) | Veja acima | Aumente o volume após adicionar anticorpos | |
| Donkey Anti-Goat AF Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | 1:100 |
| Burro anti-coelho AF Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| Burro anti-rato AF Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| Solução de coloração de anticorpos primários #3 (Ciclo 1) | |||
| Tampão de bloqueio (Ciclo 1) | Veja acima | Aumente o volume após a adição anticorpos | |
| CD68 iF594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| BSA-free Blocking Buffer (Ciclo 2) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.3% em volume |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1% em volume |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 98,7% em volume |
| Solução de coloração de anticorpos primários #4 (Ciclo 2) | |||
| Tampão de bloqueio sem BSA (Ciclo 2) | Veja acima | Aumente o volume após adicionar anticorpos | |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | 1:30 |
| Lumican Biotina | R& D Systems | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 1:20 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | 1:10 |
| Pan-Citoqueratina AF750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | 1:10 |
| Solução de coloração de anticorpos secundários #2 (Ciclo 2) | |||
| Tampão de bloqueio sem BSA (Ciclo 2) | Veja acima | Aumente o volume após adicionar anticorpos | |
| Donkey anti-Mouse IgM AF488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| Strepavidin AF594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | 1:200 |
Referências
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