Artigo de método

In vivo Imagem da atividade neural em moscas adultas Drosophila não anestesiadas

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DOI:

10.3791/68332

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20 de junho de 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

Neste artigo

Resumo

Uma barreira significativa para o estudo da atividade celular durante processos cognitivos como aprendizado e memória é o uso de anestésicos para preparação de imagens in vivo . A anestesia prejudica a memória de curto prazo e a cognição em vários modelos, incluindo Drosophila. Este estudo apresenta um método único para preparar Drosophila adulta para imagens in vivo sem anestesia.

Resumo

A imagem in vivo é crucial para estudar a neurobiologia em Drosophila , pois permite a visualização em tempo real da atividade, desenvolvimento e plasticidade neuronal dentro da mosca intacta e comportada. Essa técnica fornece informações valiosas sobre processos dinâmicos, como função sináptica e conectividade de circuitos, que não podem ser capturados com precisão em preparações fixas ou ex vivo . A maioria das técnicas de preparação de moscas para imagens in vivo envolve anestesiar as moscas pouco antes da imagem funcional. No entanto, extensas evidências demonstram que a anestesia afeta vários processos cognitivos e fisiológicos. Por esse motivo, a imagem in vivo de Drosophila melanogaster adulta sem o uso de anestésicos durante a preparação animal é uma abordagem desafiadora, mas altamente desejável. O protocolo apresentado aqui envolve imobilizar a cabeça de moscas acordadas aspirando a tromba para um pequeno tubo de metal conectado a um sistema de vácuo. Enquanto a cabeça é fixa, a mosca é preparada para imagens funcionais sem a necessidade de anestesia. Este protocolo é rápido e reprodutível, garantindo que não haja danos à mosca. A principal vantagem desse método reside em evitar o uso de anestésicos, explicando assim os potenciais efeitos complexos da anestesia na atividade neural. Este método é acessível e altamente adaptável, utilizando ferramentas baratas e personalizáveis. Ele permite a imagem bem-sucedida de moscas vivas, capturando mudanças rápidas na atividade neural associada a processos cognitivos dinâmicos.

Introdução

Avanços recentes em repórteres de atividades geneticamente codificadas revolucionaram a neurociência, fornecendo insights altamente específicos em tempo real sobre a atividade neuronal. Esses repórteres, como sensores de cálcio ou voltagem 1,2,3,4,5,6,7,8,9, permitem que os pesquisadores rastreiem os sinais elétricos e químicos dentro dos neurônios com precisão temporal e resolução espacial sem precedentes. Ao permitir o monitoramento de neurônios únicos específicos para redes neurais em diferentes regiões do cérebro, essas ferramentas aprofundaram nossa compreensão de como os padrões de disparo neuronal se relacionam com processos cognitivos como aprendizado, memória ou tomada de decisão 10,11,12,13,14.

Para aproveitar esses indicadores geneticamente codificados, os pesquisadores desenvolveram métodos avançados para preparar seu organismo modelo para imagens in vivo. O primeiro relato de plasticidade neuronal por imagem funcional in vivo, muitas vezes referido como um "traço de memória", foi descoberto no lobo antenal das abelhas após o condicionamento olfativo apetitivo15. Essa descoberta inspirou pesquisas no organismo modelo geneticamente versátil, Drosophila melanogaster, levando ao desenvolvimento de técnicas inovadoras de imagem in vivo 10,16,17,18.

A Drosophila serve como um excelente modelo para a compreensão da aprendizagem e da memória devido à sua capacidade robusta de formar memórias olfativas por meio do condicionamento clássico, onde um odor (o estímulo condicionado-CS) se associa a um estímulo aversivo ou recompensador (o estímulo incondicionado-US)19,20,21,22. Em Drosophila, os odores são escassamente representados no corpo do cogumelo (MB) 23 , uma região cerebral crítica para a memória associativa que consiste em aproximadamente 2.000 neurônios de células Kenyon (KCs) por hemisfério24 . A informação olfativa é transmitida do cálice para os lobos MB por meio de axônios KC, que se agrupam para formar os lobos. Durante o condicionamento olfativo, o US, como um choque elétrico ou uma recompensa de açúcar, é transmitido aos lobos MB por meio de neurônios dopaminérgicos distintos (DANs): neurônios PPL1 para estímulos aversivos e neurônios PAM para estímulos recompensadores 25,26,27,28,29,30. Acredita-se que a aquisição de memória envolva a ativação simultânea das vias CS e US, resultando em um aumento sinérgico do AMP cíclico (cAMP), que codifica a memória31,32. Este processo induz plasticidade nas sinapses KC→MBON, modificando seu peso sináptico 11,12,13,33,34,35,36,37. A plasticidade mediada por DAN, em última análise, leva os neurônios de saída do corpo do cogumelo (MBONs) a provocar uma abordagem ou comportamento de evitação em relação ao odor aprendido34. O modelo atual sugere que o fluxo de informações dos KCs para os MBONs transforma a representação do odor da identidade do odor nos KCs em informações mais abstratas nos MBONs, como a valência de um odor com base na experiência anterior34,38. Ao contrário dos KCs, os MBONs têm respostas de odor amplamente ajustadas; qualquer odor resulta em uma resposta à maioria dos MBONs39. O ajuste do odor dos MBONs é modificado pela plasticidade sináptica e varia significativamente entre as moscas individuais, sugerindo que os MBONs mudam sua resposta aos odores com base na experiência. Existem 34 MBONs, com a maioria da rede MBON aparentemente dividida em duas classes mutuamente antagônicas que impulsionam qualquer abordagem de comportamento de evitação34. Por esse motivo, o uso de imagens in vivo para estudar a recuperação da memória por meio do registro em diferentes MBONs tem sido amplamente utilizado.

Os primeiros métodos para imagens funcionais in vivo incluem a realização de cirurgias para remover uma seção da cutícula do topo da cápsula da cabeça, que foi então coberta com um pequeno pedaço de filme plástico18. Embora isso tenha marcado o início da imagem in vivo em Drosophila, desde então houve avanços significativos nas técnicas de preparação de moscas e na entrega de estímulos ao microscópio para investigar processos como aprendizado e memória. No entanto, ainda hoje, a maioria das técnicas de preparação de moscas para imagens in vivo envolve anestesiar as moscas. Essa prática apresenta desafios, pois há extensas evidências - e todo um campo de pesquisa - demonstrando como a anestesia afeta a memória, bem como outros processos cognitivos e fisiológicos. Por exemplo, um estudo foi realizado para entender os efeitos de diferentes anestésicos que são muito comumente usados em laboratório (dióxido de carbono, isoflurano, sevoflurano e choque frio). Eles verificaram que quanto maior o tempo de exposição à anestesia, houve aumento no tempo de recuperação, alterações na atividade locomotora, menor fecundidade e pode impactar os estoques de água e lipídios40. Além disso, foi relatado que a anestesia por choque frio imediatamente após o treinamento pode interromper completamente a memória de curto prazo21. A partir deste estudo inicial, sabe-se agora que em Drosophila, existe memória não consolidada (memória sensível à anestesia) que decai dentro de 6-8 h, e uma forma de memória consolidada (memória resistente à anestesia) que é formada gradualmente após o aprendizado e pode durar cerca de 24 h41. Com base nisso, a anestesia pode afetar o processamento cognitivo e a atividade dos neurônios, o que eventualmente permite a expressão adequada da memória.

Os efeitos da anestesia na memória não se limitam à Drosophila. Numerosos estudos em humanos e outros mamíferos demonstraram resultados semelhantes. Por exemplo, um estudo transversal feito em um hospital universitário constatou que a memória de curto prazo foi significativamente reduzida em pacientes 24 h após a anestesia geral42. Outro estudo feito em camundongos descobriu que a anestesia geral reduziu robustamente a dinâmica de picos, conjuntos celulares descorrelacionados e alterou a dinâmica da coluna vertebral na região CA1 do hipocampo, uma importante área do cérebro envolvida no aprendizado e na memória em mamíferos. Para superar essas dificuldades, o objetivo deste estudo é fornecer um novo protocolo que elimine o uso de anestesia durante a preparação da mosca para imagens in vivo , deixando o corpo da mosca completamente livre. Essa abordagem permite registros de atividade neuronal mais precisos, melhora a saúde da mosca para registros mais longos e elimina possíveis efeitos de confusão da anestesia em comparação com outras abordagens. Este protocolo é projetado para registrar a atividade dos neurônios em Drosophila, observando especificamente como os neurônios exibem plasticidade durante e após a experiência de aprendizado. No entanto, o protocolo de dissecção é versátil e pode ser adaptado a várias aplicações na pesquisa de imagens ao vivo.

Protocolo

Os detalhes dos equipamentos e reagentes usados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Moscas da fruta transgênicas, Drosophila melanogaster

  1. Cruze fêmeas virgens e moscas machos (criadas a 25 ° C em 60% de umidade relativa em um ciclo claro / escuro de 12 horas) carregando as construções Gal4 e UAS desejadas, respectivamente, para produzir moscas nas quais neurônios específicos de interesse expressam o repórter de atividade geneticamente codificado desejado.
  2. Envelheça a progênie do cruzamento acima até que esteja na faixa de 2 a 5 dias após a eclosão. Tanto homens quanto mulheres podem ser usados, pois as câmaras de imagem são feitas sob medida para caber em ambos os sexos.

2. Construindo um aspirador (fluxo de trabalho de 5 minutos)

  1. Corte o tubo de silicone de 6 mm com cerca de 8 polegadas de comprimento usando uma lâmina de barbear. Pegue uma ponta de pipeta p200 e corte cerca de metade dela usando uma lâmina de barbear para o bocal (Figura 1A). Insira a ponta cortada no tubo. Corte uma ponta de pipeta p1000 o suficiente para que uma mosca possa se mover por ela.
  2. Pegue um pequeno pedaço de algodão e cubra o tubo de silicone. Isso é para evitar que a mosca aspire para a boca do experimentador. Coloque a ponta cortada p1000 no tubo coberto de algodão.
  3. Cubra a ponta da pipeta p1000 com uma nova ponta de pipeta p200. Para determinar o comprimento apropriado para cortar a ponta da pipeta p200, primeiro remova a ponta da pipeta p200 e aspire uma mosca na ponta da pipeta p1000. Recoloque a ponta p200. Sopre suavemente e bata na mosca para movê-la o mais longe possível na ponta do p200.
    1. Quando não puder mais avançar, use um microscópio de dissecação para marcar o ponto onde termina a cabeça da mosca e o tórax começa, usando uma lâmina de barbear. Aspire a mosca de volta para a ponta da pipeta p1000 e corte a ponta da pipeta p200 na posição marcada.

3. Construindo o aspirador de probóscide de tubo de metal (fluxo de trabalho de 5 a 10 minutos)

  1. Corte o tubo de metal hipodérmico de calibre 22X no tamanho desejado (~10 cm) usando ferramentas Dremel e uma lâmina de serra diamantada. Lustre as extremidades dos tubos de metal com um disco de corte Dremel 420 para criar uma abertura suave e limpa. Esta abertura acomodará a tromba da mosca.
  2. Enrole o tubo em torno de um tubo de centrífuga de 15 mL para obter a forma curva desejada (Figura 1A). A curva deve criar uma forma de gancho que permitirá que o corpo da mosca fique alinhado com a câmara.
  3. Corte um pedaço (~7 cm de comprimento) do tubo de metal hipodérmico de calibre 12TW usando ferramentas Dremel (este tubo deve caber em uma ponta de pipeta de 2 μL). Pegue uma ponta de pipeta de 2 μL e corte a extremidade usando uma lâmina de barbear para encaixar no tubo de metal de calibre 22X. Encaixe o tubo de metal maior na outra extremidade da ponta da pipeta de 2 μL.
  4. Misture uma pequena quantidade de resina e um endurecedor de cola epóxi. Aplique a mistura onde o pequeno tubo de metal encontra a ponta da pipeta e onde o tubo de metal maior se conecta à ponta da pipeta. Deixe o adesivo curar completamente durante a noite antes de conectar o conjunto a um suporte em um micromanipulador. Ajuste o ângulo conforme necessário.

4. Construindo uma pipeta de choque e odor para experimentos de aprendizado e memória sob o microscópio (fluxo de trabalho de 10 minutos)

  1. Usando uma ferramenta diamantada Dremel, corte 1 mL em pipeta de vidro 1/100 na marca de 3 mL. Corte um pequeno pedaço retangular de folha de acrílico com dimensões de 24,5 mm x 8 mm e espessura de 1/8 de polegada.
    NOTA: Alternativamente, esta peça pode ser impressa em 3D para acomodar melhor a grade de choque (os arquivos stl e obj podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 1 e no Arquivo Suplementar 2).
  2. Corte a grade de choque de cobre para caber na peça retangular de acrílico da etapa anterior. Solde dois fios elétricos em extremidades opostas da grade de cobre. Coloque a grade de cobre na peça retangular de acrílico e curve-a de forma que o abdômen e as pernas da mosca se encaixem na grade de choque (Figura 1I).
  3. Cole a grade de cobre no plástico retangular usando um pedaço de fita isolante. Usando uma pistola de cola quente, prenda firmemente a pipeta de vidro à grade de choque, garantindo que esteja reta e devidamente centralizada. Usando um multímetro digital, verifique se a grade de cobre está funcionando para aplicar efetivamente um choque nas pernas da mosca.

5. Montagem de resistor de platina para fusão de cola (ácido mirístico) (fluxo de trabalho de 20 minutos)

  1. Usando decapadores de fios, corte 200 mm de fios no comprimento desejado e descasque uma extremidade de ambos os fios. Corte cerca de 60 mm do fio de platina (esse comprimento deve ser suficiente para criar um laço que será usado para derreter a cola).
  2. Usando uma pistola de solda, solde uma extremidade do fio de platina ao fio elétrico. Passe um tubo termorretrátil pelo fio elétrico e use um bico de Bunsen para encolher o tubo no fio para cobrir as partes soldadas.
  3. Corte dois pedaços de 20 mm do tubo de borracha de 2,55 mm de diâmetro interno e passe-os pelo fio de platina (mantenha o fio de platina reto para facilitar esse processo). Use a pistola de solda para soldar a outra extremidade do fio de platina ao outro fio elétrico. Use um novo tubo termorretrátil para cobrir esta nova peça soldada.
  4. Remova o êmbolo de uma seringa BD tb 1 mL e passe os fios das etapas anteriores pelo cilindro. A platina deve estar saindo da extremidade do corpo da seringa. Não deve haver fios expostos e o pequeno tubo de borracha deve cobrir o fio de platina, exceto até o fim.
  5. Usando um descascador de fios, descasque uma pequena quantidade de ambas as outras extremidades dos fios elétricos. Usando uma pistola de solda, solde cada fio a um plugue banana até que esteja firmemente conectado.
  6. Use cola epóxi para colar a parte superior e a base do corpo da seringa para colar os fios e o barril; Isso evitará a tensão nos fios dentro da seringa e garantirá uma vida útil mais longa ao resistor. Deixe a cola curar durante a noite.
  7. Conecte o resistor acabado à fonte de alimentação CC.

6. Construção da câmara de gravação - (fluxo de trabalho de 2 dias)

  1. Seguindo o Arquivo Suplementar 3, corte a laser uma folha de calço preta (espessura de 0,0125 pol.). O tamanho da abertura no meio da câmara pode ser modificado para caber no tamanho das moscas (o tamanho na lima geralmente se encaixa em fêmeas e machos).
  2. Pegue uma lâmina de microscópio de vidro que servirá como base da câmara. Misture resina e epóxi. Pegue a câmara de acrílico preto e, usando cola epóxi, prenda ímãs de neodímio de 3 mm x 2 mm nos quatro cantos. Recomenda-se colar um ímã de cada vez e segurá-lo enquanto a cola cura com um clipe de papel.
  3. Coloque dois novos ímãs em cada um dos ímãs colados na câmara anteriormente. Usando epóxi, cole o último ímã anexado a uma lâmina de vidro e use clipes de papel para mantê-lo no lugar durante a curadoria.
    NOTA: Depois que a cola é curada, a câmara está completa e mais ímãs podem ser adicionados para ajustar a altura da câmara para experimentos. O Arquivo Suplementar 4, o Arquivo Suplementar 5 e o Arquivo Suplementar 6 mostram a câmara de gravação montada.

7. Protocolo de dissecção in vivo sem anestesia - (fluxo de trabalho de 5 a 7 minutos)

  1. Remova a ponta da pipeta p200 do aspirador. Insira o aspirador no frasco para injetáveis e aspire uma única mosca na ponta da pipeta p1000. Recoloque a ponta da pipeta p200 de volta no aspirador. Sopre e sacuda suavemente o aspirador para que a mosca fique imobilizada na parte superior da ponta da pipeta p200, de cabeça.
  2. Coloque a câmara de dissecção no suporte do manipulador. Conecte o aspirador ao tubo de retenção e ajuste o nível de fluxo conforme necessário (~500 mL/min). Use um conector rápido para conectar/desconectar o aspirador de forma fácil e rápida (Figura 1A).
  3. Mova o tubo de metal a vácuo para centralizá-lo no campo de visão ao olhar pelo microscópio. Confirme se a câmara está posicionada corretamente para que ela vá diretamente para cima do tubo de metal quando estiver pronta para colar a mosca. Aspire suavemente a tromba da mosca no suporte de vácuo (Figura 1A).
  4. Quando a mosca estiver na posição correta, mova o manipulador para que a cabeça da mosca fique alinhada com a abertura da câmara.
  5. Ligue a fonte de alimentação DC. A corrente deve ser ajustada para variar entre 0.40-0.50 Amps. Correntes mais altas podem fazer com que o ácido mirístico derreta a ponto de sua viscosidade se tornar muito baixa, aumentando o risco de a cola se espalhar pela cabeça da mosca.
  6. Usando a resistência à platina, cole os lados dos olhos e do tórax na câmara usando ácido mirístico derretido (Figura 1B). Para evitar que a cola fique na cutícula da cabeça, use o mínimo de cola possível, especialmente ao colar as laterais dos olhos.
  7. Assim que os olhos e o tórax estiverem colados, desconecte o tubo de vácuo e use o manipulador para retirar a câmara de registro do tubo de vácuo. Vire a câmara de cabeça para baixo e use a resistência de platina para colar a tromba por baixo (Figura 1C). Colar os olhos por baixo é opcional e pode ajudar a manter a mosca no lugar durante a dissecação, mas não é necessário.
  8. Depois que tudo estiver colado, desligue a fonte de alimentação CC, gire a câmara na vertical e prenda-a à base lateral de vidro. Corte um pequeno pedaço de fita adesiva com uma tesoura e aplique-o bem na frente e atrás da cabeça da mosca (Figura 1D).
  9. Gire a câmara de modo que a cabeça fique voltada para o experimentador a 90. Usando uma agulha de dissecação, faça um corte vertical ao longo das laterais dos olhos (Figura 1E). Gire a câmara para que ela seja colocada horizontalmente. Usando a agulha de dissecação, corte a cutícula (Figura 1E).
    NOTA: Certifique-se de que a "janela" da cutícula recém-criada possa ser levantada usando a agulha de dissecação. Se levantar sem qualquer resistência, coloque a agulha de dissecação de volta na tampa. A solução salina não é usada nas etapas 13 e 14 para evitar a refração da luz, o que pode obstruir uma visão clara durante os cortes.
  10. Adicione 100 μL de solução salina ao topo da cabeça da mosca (Figura 1F). Usando uma pinça afiada, remova cuidadosamente a janela (Figura 1G). Usando a pinça afiada, remova cuidadosamente qualquer gordura ou traqueia restante. O cérebro deve estar pronto para imagens agora (Figura 1H-1J).

8. Visualização da plasticidade induzida pela aprendizagem através do condicionamento olfativo aversivo (fluxo de trabalho de 20 minutos)

  1. Usando um microscópio confocal equipado com um laser e uma objetiva de imersão em água, coloque a mosca preparada no palco do microscópio. Opcionalmente, use uma câmera com lente macro para focar na mosca, certificando-se de que a mosca esteja saudável e em movimento.
  2. Ajuste a posição da grade de choque/pipeta de odor usando um micromanipulador para que a mosca fique na grade de choque.
    NOTA: A mosca ainda deve ser capaz de se mover livremente, pois a grade de choque está apenas tocando as pernas e levemente o abdômen (a mosca deve ser capaz de remover as pernas e o abdômen da grade se retraída). A pipeta de entrega de odor deve ser direcionada para as antenas da mosca.
  3. Usando o botão de ajuste Z grosso, escaneie o eixo Z do cérebro e localize a região cerebral de interesse. Ajuste o tamanho do quadro para 512 x 512 px. A frequência de varredura deve ser ajustada para a velocidade desejada - com um mínimo de 2 Hz. Por fim, defina a duração da gravação.
  4. Comece a registrar o neurônio de interesse usando um sistema de entrega de odor feito sob medida ou comercial e inicie uma entrega de odor "pré-treinamento" simultaneamente (Figura 2C). Defina a gravação para 2 min. A apresentação de odor pré-treinamento começa registrando as respostas a um primeiro pulso de odor de 5s (CS-) seguido por um pulso de odor de 5 s (CS+) com um intervalo de 30 s entre estímulos.
  5. Depois de coletar as respostas pré-treinamento, aguarde 5 minutos antes de iniciar um protocolo de treinamento no sistema de entrega de odor. Para este exemplo, apenas o CS+ foi apresentado durante o treinamento. O odor CS+ é apresentado por 1 min iniciado aos 30 s após o acionamento do sistema de liberação de odor. O estimulador de choque é programado para fornecer simultaneamente choques de 12, 90 V enquanto o odor é apresentado.
  6. Após o treino, aguarde 5 min ou 15 min antes de obter as respostas pós-treino. Registre as respostas pós-treinamento da mesma forma que as respostas pré-treinamento foram registradas na etapa 6. Salve todos os arquivos no formato apropriado para análise de imagem subsequente.

9. Análise de imagem

  1. Para analisar as gravações, desenhe uma região de interesse (ROI) ao redor da área do neurônio. Isso deve ser o mais preciso possível para limitar a influência da fluorescência de fundo.
  2. Use a ferramenta de medição para extrair dados médios de intensidade de fluorescência dentro do ROI para cada quadro da gravação. Exporte esses dados como um arquivo CSV.
  3. Abra os dados no MATLAB ou em qualquer programa de análise de dados para calcular os valores de ΔF/Fo para cada traço de odor. Combine os dados para obter a média de ΔF / Fo registros individuais de moscas e crie um gráfico dos traços médios de resposta ao odor antes e depois do treinamento (Figura 2E, F).

Resultados

Aqui, imagens in vivo de Drosophila adulta sem anestesia são utilizadas para investigar o condicionamento olfativo aversivo induzindo plasticidade em um neurônio de saída do corpo do cogumelo bem caracterizado (MBON γ2α'1)12. O indicador de cálcio GCaMP6f2, juntamente com a proteína fluorescente vermelha TdTom, são expressos em um neurônio de saída MB, cujos dendritos inervam o compartimento dos lobos MB γ e α' e é geneticamente direcionado para o MBON γ2α'1 usando a linha split-Gal4 MB077C34 ( Figura 2A , B ).

Para observar a plasticidade pós-condicionamento olfativo aversivo, a mosca é colocada sob o microscópio confocal, com seu abdômen e pernas alinhados ao meio da grade de choque e a pipeta de liberação de odor apontada para a antena da mosca. Primeiro, as respostas ao odor de cálcio foram registradas em um pulso de 5 s de 4-metil ciclohexanol (MCH) seguido por um pulso de 5 s de 3-octanol (OCT), separado por um intervalo interestímulo de 30 s. Cinco minutos depois, as moscas foram treinadas pela apresentação simultânea de um pulso de 1 min OCT (CS+) juntamente com choques de 12,90 V. Esse cronograma de condicionamento associativo produz uma memória aversiva comportamental robusta. Finalmente, 5 min e 15 min após o condicionamento, as respostas de cálcio ao MCH e OCT foram registradas como antes do treinamento. O MBON γ2α'1 responde robustamente por transientes de cálcio ao MCH e ao OCT antes do condicionamento (Figura 2D-F). No entanto, correspondendo aos achados anteriores12, 5 minutos após o condicionamento das respostas de cálcio ao CS+ (OCT) são completamente deprimidas (Figura 2D-F). Além disso, as respostas ao CS- (MCH) foram significativamente potencializadas. Quinze minutos após o treinamento mostraram resultados semelhantes, pois a resposta do cálcio ao CS+ foi significativamente deprimida e o CS- foi potencializado. Esses resultados indicam que o traço de memória observado em ambos os odores dura pelo menos 15 min (Figura 2D-F). Essas respostas foram quantificadas usando a resposta média ao odor durante o pulso de 5 s e comparadas dentro da mosca. Essas mudanças nas respostas ao odor também podem ser visualizadas por uma representação pseudocolorida da mudança na fluorescência GCaMP6 pré e pós-treinamento aversivo (Figura 2E). Em contraste, anestesiar a mosca durante a preparação mostra plasticidade reduzida para CS+ e CS-. Apenas depressão parcial para CS+ é observada em animais anestesiados, pois as respostas pós-treinamento ainda estão presentes. Além disso, as respostas do CS- não são significativamente diferentes após o treinamento (Figura 2G,H). Para melhor observar isso, calculamos a plasticidade induzida como a razão CS+/CS- e mostramos que as moscas não anestesiadas apresentam plasticidade significativamente aumentada quando comparadas aos animais anestesiados (Figura 2I). Esses resultados representativos indicam que este protocolo é adequado para estudar o aprendizado e a memória ao microscópio e garante a saúde da mosca durante a imagem dos neurônios por um longo período de tempo. Este protocolo é versátil o suficiente e pode ser aplicado a outros tipos de imagens in vivo e outros neurônios de interesse.

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Figura 1: Preparação de imagem in vivo de Drosophila sem o uso de anestesia. (A) Painel superior: Diagrama ilustrando as etapas envolvidas na preparação do aspirador. Painel inferior: Diagrama mostrando a câmara mantida em um micromanipulador durante o posicionamento da mosca. A tromba da mosca é colocada na abertura de um tubo de metal conectado a um vácuo a 500 mL / min usando um aspirador. A câmara é posteriormente posicionada acima da mosca. (B) Os lados dos olhos e tórax são colados com ácido mirístico usando um resistor de platina feito sob medida. (C) A tromba da mosca é removida do tubo de metal e a câmara é invertida para permitir que a tromba seja colada no lugar, minimizando assim o movimento durante as gravações. (D) A câmara é fixada a uma base de lâmina de vidro. A fita é aplicada na parte superior da câmara, cobrindo as antenas, e na parte de trás para evitar que a solução salina vaze. (E) Dois cortes verticais são feitos ao longo da cutícula perto dos olhos compostos, seguidos por um terceiro corte na cutícula perto do tórax, criando uma "janela" para o cérebro. (F) Entre 100-200 μL de solução salina são adicionados à cabeça da mosca no local dos cortes. (G) A janela da cutícula é levantada, puxada e destacada usando uma pinça afiada e fina para expor o cérebro. (H) A gordura e o tecido traqueal são removidos para permitir a visualização clara das células cerebrais ao microscópio. (I) A mosca preparada é colocada sob o microscópio e posicionada com o corpo alinhado no topo da grade de choque. (J) Imagem pseudocolorida mostrando o padrão de expressão de MBON γ2α′1. A região de interesse é delineada com uma linha tracejada ao redor do mandril dendrítico. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Plasticidade induzida por aprendizado em MBON γ2α′1 após condicionamento olfativo aversivo. (A) Padrão de expressão do driver MB077C-splitGal4 expressando GCaMP. Os cérebros foram dissecados e corados com anti-GFP e contracorados com anti-nc82. Barra de escala: 50 μm. (B) Imagem pseudocolorida de MBON γ2α′1 destacando o corpo celular, o processo de extensão e a árvore dendrítica. A região dendrítica representa a área da qual as respostas de cálcio foram coletadas. Barra de escala: 50 μm. (C) Esquema do protocolo de treinamento aversivo. As moscas foram expostas a pulsos de 5 s de MCH e OCT com 30 s de ar limpo entre eles. Após um intervalo de 5 minutos, as moscas foram treinadas para associar a OCT a doze choques elétricos de 90 V. Os registros das respostas de cálcio ao MCH e OCT foram realizados 5 min e 15 min após o treinamento. (D) Os traços de resposta ao odor para MCH (painel superior) e OCT (painel inferior) são mostrados para pré-treinamento e 5 min e 15 min após o treinamento. Barras pretas grossas indicam o momento da apresentação do odor. (E) Imagens pseudocoloridas do mandril dendrítico do pré-treinamento MBON γ2α′1 e 5 min e 15 min pós-treinamento, em resposta ao MCH e OCT. A potencialização da fluorescência é observada para o CS- (MCH), enquanto a fluorescência é abolida para o CS+ (OCT). Barra de escala: 20 μm. (F) A resposta média ao odor ao MCH é significativamente potencializada em 5 min e 15 min após o treinamento, enquanto as respostas ao OCT (CS+) são significativamente suprimidas. Teste não paramétrico de Wilcoxon pareado, N = 12. (G) Os traços de resposta ao odor para MCH (painel superior) e OCT (painel inferior) são mostrados para moscas anestesiadas antes e 5 minutos após o treinamento. Barras pretas grossas indicam a entrega de odor. (H) Em animais anestesiados, as respostas médias de odor ao MCH não mostram potenciação significativa após o treinamento, e as respostas à OCT exibem apenas supressão parcial em comparação com animais não anestesiados. (I) A plasticidade induzida pelo treinamento, calculada como a relação CS+/CS-, é significativamente menor em moscas anestesiadas em comparação com aquelas preparadas sem anestesia. Teste não paramétrico de Wilcoxon pareado, N = 8-12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Grid_holder (STL). STL do componente projetado sob medida usado para manter a rede elétrica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Grid_holder (OBJ). OBJ do componente projetado sob medida usado para manter a rede elétrica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Chamber_LaserCut. Arquivo Adobe Illustrator usado para cortar a laser o componente superior das câmaras de gravação para moscas machos e fêmeas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Recording_chamber (STL). STL da câmara de gravação personalizada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: Recording_chamber (OBJ). OBJ da câmara de gravação personalizada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 6: Recording_chamber_animation. Vídeo MP4 mostrando uma animação da câmara de gravação montada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Compreender o circuito neural por trás do aprendizado e da memória é um objetivo central no campo da neurociência. O kit de ferramentas genéticas disponível em Drosophila, combinado com a simplicidade e versatilidade dos testes comportamentais, torna-o um organismo modelo ideal para estudar esses processos. Estudos publicados em vários laboratórios descreveram diferentes protocolos de preparo de moscas para imagens funcionais sem o uso de anestesia44,45. No entanto, esses protocolos variam muito e geralmente dependem de ferramentas personalizadas altamente especializadas com orientação limitada sobre como construí-los ou usá-los. Neste protocolo, é apresentado um método para a realização de imagens funcionais in vivo em moscas que evita os efeitos de confusão da anestesia geral. Além disso, essa abordagem permite a captura da atividade neuronal em tempo real dentro da mesma mosca, permitindo comparações diretas das respostas neurais antes e depois da exposição a vários estímulos.

Ao concluir este protocolo, as etapas críticas incluem certificar-se de que a tromba da mosca esteja devidamente colocada no tubo de vácuo. Esta etapa garante que a colagem subsequente ocorra nos pontos certos e garante que a cabeça esteja no ângulo correto para visualizar os neurônios de interesse. A aplicação mínima de cola é essencial para manter a saúde das moscas; Usar a menor quantidade necessária para prender a mosca no lugar é o ideal. Este protocolo também permite algumas modificações para atender a necessidades específicas, como colar apenas as laterais dos olhos para que todo o corpo fique livre. Da mesma forma, uma câmara de perfusão pode ser conectada ao topo da câmara de gravação para facilitar a perfusão da campainha ou a administração do medicamento. Por fim, uma esteira flutuante rotativa pode ser colocada abaixo da braguilha conforme relatado anteriormente, permitindo a análise da direcionalidade da locomoção46,47.

Este protocolo tem algumas limitações, incluindo o estresse a que as moscas são submetidas durante a microcirurgia para prepará-las para imagens ao vivo. Manusear as pequenas moscas, aplicar cola com moderação e abrir cuidadosamente a cápsula da cabeça sem danificar nenhum tecido cerebral ou corpo requer conhecimentos substanciais, que só podem ser adquiridos por meio de prática meticulosa e repetição. Embora esse método seja particularmente benéfico para estudar processos cognitivos no nível celular, a imagem in vivo ainda tem algumas limitações quando comparada aos registros eletrofisiológicos. Além disso, embora nosso protocolo evite o uso de anestesia antes da imagem, a mosca ainda está restrita a uma câmara física, que sempre pode alterar as respostas celulares. No entanto, nossa metodologia fornece a maneira mais próxima de preservar a saúde da mosca para imagens in vivo ideais. Comparado aos métodos existentes que usam anestesia e restringem a mosca, nosso método visa manter a mosca se movendo o mais livremente possível, ao mesmo tempo em que é capaz de obter imagens das células com o mínimo de movimento.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais para 1R01GM147917-01A1 e pela Fundação de Pesquisa do Cérebro e Comportamento para 30442.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fio de platina de 0,102 mmSurepure Chemetals2690
0,25 OD, 0,125 ID, tubo de silicone curado com platinaVWR89068-474
0,3 mm ID Tubo de silicone Fisher Scientific11-189-14
Banana plugsAmazon
Folha de acrílico preta para câmara 0.0125 inPrecision Brand44250
Cloretode cálcio Sigma-Aldrich746495
Grade de choque de cobreFonte
para resistor de platinaFisher ScientificS35740
Ferramenta Dremel 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;; uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ; uas-gcamp6f;BDSC42747Esta linha uas foi combinada com ;; uas-td-tom para gerar um estoque contendo ambas as inserções
Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
Cola epóxi Medidorde fluxo de gás Gorilla 4200102
1.5 LPMAmazonB01N0UWZ2T
Glass 1 mL pipeta sorológica Fisher Scientific50-232-9516
Corrediças de VidroFisher Scientific 12-550-A3
GlicoseSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH4034
Tubulação hipodérmica de calibre 12TWMicrogrupo316H12TW
Tubulação hipodérmica de calibre 22XMicrogrupo304H22X
Cloreto de magnésio hexahidratadoSigma-AldrichM9272
Ácido MirísticoAcros Organics156961000
Ímãs de Neodímio 3X2 mmAmazonB0CXSQ387M
P1000 pontasGenesee Scientific 23-165RL
P200 dicasGenesee Scientific 23-150RL
6mm ODAmazonB07ZHG8Y1Y
Cloreto de PotássioSigma-AldrichP3911
Tubulação de PTFE 6mm ODLâminas de
 AmazonB08LYD6645
Bicarbonato de SódioSigma-AldrichS5761
Cloreto de SódioFisher ScientificS271-500
Fosfato de Sódio DibásicoSigma-AldrichS0876
SacaroseSigma-AldrichS9378
TrealoseSigma-AldrichT0167
de alimentação DC personalizada Conector de empurrar pneumático barbear Amazon

Referências

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