Visualização de raios-X de infusão ablativa intraductal à base de etanol para prevenção do câncer de mama em modelos de coelhos

Resumo

Este protocolo apresenta um procedimento para infusão guiada por imagem no sistema da árvore ductal da glândula mamária de coelho. Demonstramos a infusão controlada de uma solução ablativa à base de etanol contendo agente de contraste de raios-X em todas as aberturas dos tetos por fluoroscopia em tempo real.

Resumo

O câncer de mama é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em mulheres. Embora existam poucas intervenções proativas para mulheres de risco médio, a mastectomia profilática é a intervenção mais eficaz e redutora de risco para mulheres de alto risco. No entanto, a mastectomia profilática é um procedimento invasivo que remove todas as células epiteliais mamárias junto com o estroma, tecido adiposo e/ou musculatura circundantes. Nosso objetivo geral de pesquisa é desenvolver um procedimento de entrega intraductal (ID) não invasivo que mate localmente as células epiteliais mamárias, preenchendo toda a árvore ductal com uma solução ablativa. Demonstramos anteriormente que a entrega de etanol como solução ablativa é eficaz em modelos de roedores (camundongos e ratos). Este protocolo apresenta uma entrega ID de solução de etanol a 10-70% contendo iohexol (90-300 mg/mL) como agente de contraste de raios-X no sistema de árvore multiductal da glândula mamária de coelho. A glândula mamária de um coelho (Oryctolagus cuniculus) com um sistema de múltiplos dutos é mais parecida com o peito humano do que com a de outros animais grandes (por exemplo, vacas, ovelhas). Este protocolo de coelho aborda os desafios técnicos de escalabilidade, imagem em tempo real e entrega de ID em um sistema de árvore multiductal em um modelo intermediário de animais de grande porte. Este protocolo estabelece uma entrega de identificação de múltiplos dutos guiada por fluoroscopia com instrumentos, materiais e reagentes que podem ser aplicados diretamente na clínica. A análise tecidual permite otimizar a concentração de etanol para ablação epitelial máxima e dano tecidual colateral mínimo como ponto de partida para futura avaliação inédita em humanos desse procedimento ablativo para prevenção primária do câncer de mama.

Introdução

O câncer de mama (CM) é a morte mais comum e a segunda maior relacionada ao câncer para mulheres nos Estados Unidos. As projeções para 2025 estimam que haverá 316.950 novos cânceres de mama e 42.170 mulheres morrerão de BC¹. Atualmente, a mastectomia profilática bilateral é o procedimento mais eficaz para prevenir o CM. No entanto, este é um procedimento altamente invasivo que envolve uma remoção completa das células epiteliais, das quais surge o carcinoma de mama, e do tecido circundante. Devido à sua invasividade, bem como ao impacto psicológico e social desse procedimento, menos de 50% das mulheres de alto risco são submetidas à mastectomia redutora de risco². Nós, e outros, desenvolvemos procedimentos de entrega intraductal (ID) para prevenção primária e/ou tratamento local do câncer de mama em modelos de roedores ^2,3 como uma alternativa às prevenções e tratamentos atuais. O etanol (EtOH) tem um perfil de baixa toxicidade e segurança bem estabelecido e é utilizado em múltiplas aplicações clínicas, como agentes esclerosantes para tratamento de malformações venosas e como agente ablativo para tratamento local de alguns cânceres³. Normalmente, vários mililitros de EtOH são infundidos ou administrados em concentração de 90-100% nesses procedimentos clínicos. Em nosso trabalho anterior, a entrega de 70% de EtOH diretamente no sistema de árvore ductal de modelos de camundongos e ratos foi eficaz na ablação química de células epiteliais mamárias com danos limitados ao tecido normal adjacente e na prevenção da formação de tumor de mama 4,5,6,7. À medida que este procedimento é ampliado para o sistema de árvore ductal maior de um coelho com um volume luminal maior para a proporção da área da superfície da célula epitelial luminal, exploramos as propriedades ablativas de uma solução com uma porcentagem menor de EtOH (10% a 70%). Com um olhar atento à tradução clínica, raciocinamos que a menor porcentagem de etanol que é eficaz na ablação de células epiteliais será a mais bem tolerada e terá o melhor perfil de segurança.

A confirmação do preenchimento completo da árvore ductal é necessária para garantir que a solução ablativa entrou em contato direto com as células epiteliais mamárias. Em nossos estudos anteriores em modelos de roedores, a visualização de raios-X da(s) árvore(s) ductal(is) infundida(s) por microCT foi usada após o procedimento. Devido ao lapso de tempo necessário para anestesiar, transferir, definir e posicionar o animal para imagem, o Omnipaque (iohexol) aprovado pela FDA ou agentes de contraste de difusão rápida contendo iodo semelhantes não eram adequados para visualização da árvore ductal em roedores ^6,8. Descobrimos que os agentes de contraste à base de nanopartículas, especialmente aqueles contendo nanocristal de óxido de tântalo, eram mais^lentos No entanto, essa confirmação a posteriori por microTC não nos permite monitorar ou controlar a quantidade de volume infundido e se desvia de procedimentos diagnósticos clinicamente estabelecidos, como a ductografia^10,11, para visualização da árvore ductal. Assim, um passo fundamental para estabelecer a viabilidade técnica de traduzir esse procedimento de identificação para humanos é demonstrar a visualização da fluoroscopia em tempo real da árvore ductal infundida em um modelo animal de tamanho e complexidade crescentes de suas glândulas mamárias. Este protocolo amplia esse procedimento ablativo de roedores ^4,5 para modelos de coelhos. Evolutivamente, anatomicamente e fisiologicamente, as glândulas mamárias de coelhos são mais semelhantes aos seios humanos do que os de roedores ou outros modelos animais de grande porte, como vacas e ovelhas 12,13,14. As coelhas têm quatro pares de glândulas mamárias, cada uma contendo quatro árvores ductais, enquanto os roedores têm apenas uma árvore ductal por glândula mamária. As de coelho podem ser canuladas ^15,16 usando um procedimento semelhante à administração de ID de agente de contraste em ductografia clínica na primeira pesquisa clínica em humanos. Portanto, os coelhos fornecem um modelo intermediário prático e relevante de animais de grande porte para a aplicação translacional desse procedimento ablativo de ID em humanos. Este protocolo aborda os desafios técnicos da entrega de ID e imagens in vivo de um sistema de árvore multiductal que não poderiam ter sido abordados em modelos de roedores. Este protocolo utiliza instrumentos, reagentes e materiais compatíveis com a prática clínica atual para visualização de árvores ductais. Assim, o procedimento descrito para infusão guiada por fluoroscopia de solução ablativa à base de etanol contendo iohexol pode ser prontamente implementado e avaliado em ensaios clínicos inéditos em humanos.

Este método foi implementado em nosso laboratório para canular e infundir sequencialmente com sucesso todas as quatro árvores ductais de uma ou mais glândulas mamárias em um coelho, em uma única sessão, com uma solução ablativa à base de etanol contendo um agente de contraste (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Este método envolve a infusão da solução ablativa diretamente na abertura do teto canulado com uma agulha de ponta romba de 27 G de um coelho (virgem de 4 meses) em uma mesa de fluoroscopia. Este procedimento é realizado em um animal sob anestesia geral (isoflurano) com tratamento anti-inflamatório peri e pós-procedimento (cetoprofeno, anti-inflamatório não esteróide). A fluoroscopia nos permite monitorar o preenchimento da árvore ductal em tempo real, controlar a taxa e a quantidade de volume dispensado e/ou determinar o sucesso da entrega de ID em cada sistema de árvore individual (Figuras 1, Figura 2, Figura 3). Essa técnica de fluoroscopia se aproxima mais da aplicação clínica pretendida para orientação por imagem do tratamento ablativo e pode ajudar a limitar a dose geral de radiação imposta ao paciente. Este protocolo demonstra que o Omnipaque (iohexol) aprovado pela FDA é um agente de contraste adequado para visualizar o preenchimento inicial da árvore ductal do coelho (Figura 3). Observações por exame macroscópico e análise histológica mostram que uma concentração de etanol de 70% causa rápido dano tecidual dentro e fora da árvore ductal e estendendo-se além da estrutura da glândula mamária (Figura 3). A concentração de etanol na faixa de 10-40% fornece ablação adequada de células epiteliais com menor dano tecidual colateral do que o etanol de 70% (Figura 4). Estudos longitudinais usando este procedimento com tamanho de grupo adequadamente alimentado por solução ablativa e coletas de tecido cronometradas serão necessários para estabelecer parâmetros ideais da solução ablativa para sua avaliação clínica em pacientes humanos.

Protocolo

Todos os experimentos descritos foram conduzidos sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Michigan State University. Os coelhos (Oryctolagus cuniculus) foram cuidados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Lei de Bem-Estar Animal do USDA em uma instalação credenciada pela AAALAC.

NOTA: Este método foi conduzido em animais brancos da Nova Zelândia virgens (nulíparos) e reprodutores aposentados (multíparos) com idades (4 meses a > 1 ano) e peso (2,6 a 4,2 kg) adquiridos de fontes comerciais. Em nossa experiência, o tamanho do animal determinado pelo peso é mais confiável do que a idade do animal para prever o tamanho das. Geralmente, os animais que pesam mais de 3,3 kg apresentam tetinas adequadas para canulação. O protocolo descrito abaixo concentra-se em animais virgens de 4 a 5 meses de idade e peso superior a 3,3 kg, uma vez que são mais apropriados para estudos de eficácia a longo prazo, cicatrização de feridas, toxicidade e segurança.

1. Preparo pré-operatório

1. Aclimatar os animais nas novas instalações durante pelo menos 1 semana após a chegada, especialmente para animais destinados a procedimentos de recuperação e estudos a longo prazo. Durante esta primeira semana, monitore/verifique os coelhos diariamente e forneça guloseimas, enriquecimento nutricional conforme recomendado pelas diretrizes institucionais, para ajudar no processo de aclimatação.
2. Adquira o coelho (~ 4 meses de idade New Zealand White) da instalação de alojamento aprovada. Registre o peso corporal antes do procedimento.
   NOTA: O peso corporal pode ser registrado no dia anterior ao procedimento para preparar os cálculos necessários para a anestesia. Matrizes aposentadas (> 1 ano de idade, > 3,5 kg) também podem ser utilizadas, pois possuem tetos maiores e permitem facilitar a canulação dos ductos individuais (Figura 3). Por esses motivos, reprodutores aposentados podem ser usados em experimentos iniciais para se familiarizar e otimizar o procedimento intraductal.
3. Injete 35 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina por via intramuscular 20 minutos antes da administração de isoflurano para sedar o animal.
   NOTA: A anestesia é administrada com base no peso do coelho e os intervalos para cada medicamento são os seguintes: 15-35 mg / kg para cetamina e 2-5 mg / kg para xilazina. Certifique-se de que o animal esteja sedado antes de passar para a depilação e intubação. Isso é para o bem-estar e segurança dos animais e funcionários. Após a confirmação da sedação, o coelho pode ser colocado dorsalmente na mesa de imagem/operação.
4. Injete 5 mg/kg de cetoprofeno por via subcutânea para analgesia após a demonstração de sinais clínicos de sedação (ou seja, comportamento quieto e olhos parcialmente fechados e rosados).
   NOTA: A analgesia é administrada com base no peso do coelho e a faixa de cetoprofeno é de 2-5 mg / kg.
5. Intubar o coelho com o equipamento apropriado (por exemplo, tubo endotraqueal ou dispositivo de vias aéreas supraglóticas) e conectar a uma máquina de isoflurano (1-2% de isoflurano, 1,0 L/min de oxigênio) que tenha sido adequadamente testada e certificada para anestesiar o coelho. Monitore cuidadosamente a respiração do animal para garantir que a anestesia seja mantida em 1-2% de isoflurano. Monitore o coelho quanto à saturação de oxigênio via SpO₂, frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura durante todo o procedimento.
   NOTA: O tamanho do tubo de intubação é baseado no peso e tamanho do coelho. No entanto, a faixa de tamanho nem sempre é precisa, por isso é útil ter uma variedade de tamanhos para ver qual deles se encaixa melhor naquele coelho em particular. Uma máscara de nariz também pode ser usada no lugar de um tubo endotraqueal para fins anestésicos¹⁷, estando ciente de que essa máscara não fornece proteção das vias aéreas do animal proporcionada pela intubação. Cobertores circulantes de água quente (cobertores de aquecimento) ajustados para 37°C são colocados sob as toalhas para manter a temperatura corporal do coelho.
6. Coloque e prenda um cateter venoso de 25 G na veia marginal da orelha para permitir a administração de medicamentos de emergência.
   NOTA: Uma faixa de calibre de 24 a 26 pode ser usada dependendo do tamanho da veia do coelho.
7. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar irritação ocular e ressecamento da córnea.
8. Raspe o pelo ao redor do segundo e terceiro pares de tetinas com um barbeador elétrico. Use um aplicador de ponta de algodão para espalhar creme depilatório na área do teto. Deixe o creme entrar em contato com a área por 15 s.
   NOTA: Deve-se ter extremo cuidado para não danificar as tetinas com a navalha. Um aspirador sem fio também pode ser usado para ajudar a manter uma área de procedimento limpa.
9. Molhe uma gaze com soro fisiológico estéril e use-a para enxaguar o creme e soltar o pelo do animal após 15 s de aplicação do creme depilatório. Confirme uma boa visibilidade e acesso à área do teto de onde o pelo foi removido. Repita se necessário.
   NOTA: O creme deve permanecer no coelho pelo menor intervalo possível, entre 10 - 30 s e ser removido completamente para evitar queimaduras químicas na pele.

2. Infusão intraductal

1. Preparar uma solução ablativa misturando volumes adequados de soluções-mãe em condições estéreis numa capa de cultura de tecidos BSL2.
   NOTA: O iohexol (350 mg de iodo / mL) deve ser armazenado em uma área escura devido à sensibilidade à luz. Uma variedade de concentrações de EtOH foi usada durante este experimento. Para testar outras porcentagens de EtOH, diluir as soluções-mãe até a concentração necessária de solução ablativa. Para manter a mesma concentração de iodo em solução ablativa com diferentes porcentagens de EtOH, PBS ou água estéril podem ser usados para preencher a diferença de volume.
2. Para este exemplo, prepare uma solução ablativa fresca de EtOH a 10%, iodo 280 mg / mL de iohexol, corante alimentar a 1% em um tubo de 5 mL. Para um volume final de 5 mL, adicione 4 mL de estoque de iohexol (350 mg de iodo / mL), 500 μL de 100% EtOH (200 provas), 450 μL de PBS, 50 μL de corante alimentar azul estoque.
   NOTA: Cada árvore ductal pode ser preenchida com até 400 μL, mas normalmente 250-350 μL para animais com menos de 3,5 kg. Evans Blue até 0,2% pode ser usado em vez de corante alimentar. O Evans Blue pode ser uma opção preferida se a montagem inteira ou outras análises de tecido forem planejadas imediatamente após a(s) infusão(ões).
3. Remova qualquer pele morta que cubra as aberturas ductais com pinças pontiagudas finas.
   NOTA: Os coelhos podem ter um tampão queratinizado saindo do teto que pode impedir a canulação bem-sucedida se não for removido. A lidocaína tópica também pode ser aplicada ao redor do teto para ajudar a minimizar a irritação ao redor do local da injeção (Tabela 1).
4. Limpe o local da infusão com compressas de gaze de clorexidina.
   NOTA: A clorexidina é usada como agente de limpeza para desinfetar o local da injeção antes da canulação (Tabela 1).
5. Insira o bisel de uma agulha de 28 G (comprimento: 12,7 mm) na lateral do teto e injete lentamente 200 μL de solução salina a 0,9% a uma taxa de 200 μL / min. Isso permite uma melhor visualização das aberturas ductais.
   NOTA: Nem todos os 200 μL de solução salina podem precisar ser injetados no teto; Pare a injeção assim que vir a solução salina saindo de uma ou mais aberturas ductais.
6. Aspire 1 mL de solução ablativa preparada usando uma seringa Luer lock de 1 mL. Prenda a seringa na extremidade fêmea "alada" da linha de extensão macho-fêmea de 12 polegadas. Prenda cuidadosamente uma agulha de ponta romba de 27 G (comprimento: 12.7 mm) na extremidade macho da linha de extensão. Prepare a linha com a solução. Limpe a agulha com uma compressa de gaze com álcool. Além disso, tome cuidado para não inclinar a seringa com a solução ablativa, pois isso pode causar a formação de bolhas de ar.
   NOTA: Estes são volumes recomendados destinados ao preenchimento total da(s) árvore(s) ductal(is): até 300 μL em cada árvore e até 1,2 mL por glândulas mamárias cervicais e/ou inguinais (^1º e^4º pares), até 400 μL em cada árvore e até 1,6 mL por glândulas mamárias torácicas e/ou abdominais (^2º e^3º pares). Para outras aplicações, pode ser apropriado usar volumes menores ou maiores com base em requisitos experimentais e/ou orientação de fluoroscopia para evitar o enchimento excessivo da árvore ductal. A linha de extensão permite mais controle da taxa de fluxo e para infusão simultânea e imagens de fluoroscopia ao vivo. Para comparação, os volumes recomendados de infusão intraductal em modelos de camundongos de 9 a 12 semanas de idade⁴ são: até 30 μL nas glândulas mamárias cervicais e inguinais e até 50 μL nas glândulas mamárias torácicas e abdominais, e modelos de ratos⁵: até 100 μL nas glândulas mamárias cervicais e inguinais e até 300 μL nas glândulas mamárias torácicas e abdominais.
7. Use uma lupa de 10x lamp para ajudar a localizar as aberturas ductais. Segure suavemente a tetina com os dedos e canule a agulha na abertura ductal. Continue inserindo suavemente a agulha de ponta romba de 27 G até que a ponta esteja totalmente dentro da tetina. Para acomodar a agulha na tetina, levante a tetina em direção à agulha em vez de empurrar a agulha para dentro da tetina. Tome cuidado para seguir o caminho da abertura ductal.
   NOTA: Em alguns coelhos, você pode sentir resistência ao tentar inserir a agulha na(s) abertura(s) do teto. Aplique cuidadosamente uma leve pressão para romper a camada superior de células epiteliais. Em nossa experiência, é necessário um dispositivo de ampliação para identificar claramente a abertura ductal para canulação. Pode ser uma lâmpada de aumento, lente, lupa ou dispositivo semelhante.
8. Infundir lentamente 300 μL da solução a uma taxa constante de aproximadamente 200 μL / min assim que a agulha estiver completamente inserida. Aguarde 30 s após a infusão para remover a agulha da árvore canulada; Isso garante que o volume injetado permaneça dentro da árvore ductal e reduz a probabilidade de vazamento.
   NOTA: Normalmente, há um pesquisador canulando e segurando a agulha, enquanto um segundo pesquisador segura a seringa e empurra o êmbolo na taxa desejada. Uma bomba de seringa pode ser usada para ter uma taxa de fluxo mais controlada, pois mudanças abruptas na taxa de infusão podem estourar ou danificar as árvores ductais.
9. Limpe qualquer solução derramada com gaze umedecida ou um lenço EtOH para evitar solução de contraste estranha nas imagens.

3. Imagem de fluoroscopia

1. Faça imagens de fluoroscopia após cada árvore ductal ter sido infundida. Os parâmetros da fluoroscopia são: 30 fps, 67 kV e 17,3 mA em um instrumento de raios-X de fluoroscopia. No entanto, ajuste-os com base no experimento e nas necessidades de imagem.
2. Use as imagens de fluoroscopia para determinar se é necessário volume adicional para preencher totalmente a árvore ductal.
   NOTA: A imagem de fluoroscopia pode ocorrer ao vivo ao mesmo tempo que a infusão da solução ablativa. Pinças de metal ou plástico podem ser usadas para segurar a tetina enquanto a imagem está ocorrendo para proteger a equipe de raios-X prejudiciais. Isso permite o monitoramento do enchimento da(s) árvore(s) ductal(is). A fluoroscopia ao vivo pode orientar quando interromper a infusão com base no aumento do volume nas extremidades dos alvéolos. A fluoroscopia após a infusão pode confirmar se a árvore ductal foi totalmente preenchida ou se houve algum vazamento. Uma fluoroscopia confirmatória é normalmente realizada após a infusão de cada ducto dentro da mesma glândula mamária.

4. Cuidados pós-operatórios e recuperação

1. Interrompa o fluxo de isoflurano após a última infusão intraductal.
2. Injete 0,5 mg / kg de atipamezol por via intramuscular.
   NOTA: O tempo de recuperação varia entre os animais, mas o coelho deve começar a mostrar sinais de recuperação 5-20 minutos após a injeção.
3. Forneça suporte térmico contínuo ao animal em um cobertor de aquecimento até que se recupere totalmente da anestesia. Mantenha o fluxo de oxigênio por até 5 minutos antes de retirar da anestesia.
   NOTA: Os sinais de recuperação incluem movimentos da boca, como mastigação, tosse, espasmos nasais e/ou movimentos oculares. Os coelhos devem ter um reflexo de endireitamento e ser capazes de se manter em posição esternal antes de serem colocados de volta no transportador de recuperação. O agente de recuperação é administrado com base no peso do coelho com uma faixa de 0,1-1 mg / kg de atipamezol.
4. Injete 5 mg/kg de cetoprofeno por via subcutânea.
5. Remova o cateter intravenoso assim que o coelho puder se manter em posição esternal. Segure uma gaze no local onde o cateter foi removido para interromper qualquer sangramento excessivo.
   NOTA: A remoção do cateter pode ocorrer quando o coelho está no transportador de transporte.
6. Transporte o coelho de volta para a instalação de alojamento apropriada.
7. Continue as injeções de 5 mg / kg de cetoprofeno por via subcutânea por pelo menos 3 dias após o procedimento.
8. Monitore o coelho quanto a sinais de desconforto, angústia, dor e automutilação uma vez ao dia por pelo menos 3 dias após o procedimento. Se o coelho apresentar algum desses sinais clínicos, o tratamento com cetoprofeno pode ser estendido. Registre e monitore o peso corporal para avaliar os sinais de anorexia.
   NOTA: O cetoprofeno é administrado com base no peso do coelho com uma faixa de 2-5 mg / kg. Pode ser administrado a cada 24 h por até 5 dias após a infusão intraductal para reduzir a inflamação e minimizar as cicatrizes. Para minimizar eventos adversos de ulceração da pele ou outros problemas relacionados à cicatrização de feridas, aplique lidocaína topicamente no local da injeção. Qualquer animal que apresente sinais persistentes de desconforto, angústia, dor ou lesão após o tratamento com cetoprofeno deve ser sacrificado.

5. Análise de tecidos

1. Administre solução de eutanásia (pentobarbital sódico e fenitoína sódica) por via intravenosa a 100 mg / kg. Após 60 segundos, verifique se há sinais de vida por beliscão do dedo do pé / orelha, sinais de respiração ou batimentos cardíacos, reflexo da córnea e / ou estimulação da pupila.
2. Realize uma necropsia para obter tecido (s) da (s) glândula (s) mamária (s) e processo para o procedimento de inclusão de parafina de rotina após 24-36 h em formalina tamponada neutra^{a 10% 18}. Em seguida, realize a coloração padrão de hematoxilina e eosina (H & E) e / ou coloração imuno-histoquímica com marcador específico do tipo de célula para auxiliar nas leituras de análise desejadas¹⁸. Descarte a carcaça por meio do protocolo de descarte adequado (por exemplo, incineração).
3. Analise os tecidos da glândula mamária em consulta com um patologista. Use um programa de software de computador para auxiliar na quantificação da taxa de ablação e danos colaterais ao tecido.
   NOTA: A análise de tecido foi realizada em coelhos brancos da raça Nova Zelândia com 4 meses de idade dentro de uma hora após as infusões (Figura 4) com o software aberto QuPath para análise de bioimagem (https://qupath.github.io/). Esta análise é baseada apenas em tecidos corados com H & E. O QuPath ou software de computador semelhante requer entrada e calibração por um patologista. Algumas células podem ser classificadas erroneamente usando apenas características morfológicas (Figura 4). O uso de marcadores específicos do tipo de célula, como citoqueratinas e actina de músculo liso α, pode ser usado para melhorar a classificação assistida por computador⁶. Em última análise, a análise de classificação celular deve ser selecionada e validada por um patologista.

Resultados

Cada uma das 8 glândulas mamárias de uma coelha contém 4 árvores ductais que se abrem em orifícios independentes dos tetos (Figura 2). Devido à diferença de tamanho e número de árvores ductais por glândula mamária entre roedores (apenas 1 ducto por glândula mamária), os coelhos são um bom modelo intermediário para a tradução humana. Podemos infundir até 400 μL de solução de EtOH a 10-70% para preencher toda a árvore ductal de qualquer glândula mamária de coelhos brancos da Nova Zelândia de 4 meses de idade (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 ^4,8,9). Podemos infundir até 4 árvores ductais em até 8 glândulas mamárias com a solução ablativa em uma única sessão. Um projeto experimental típico consiste em infundir 2-3 árvores ductais dentro de uma única glândula mamária em até 4 glândulas mamárias com uma solução ablativa específica contendo agente de contraste de raios-X à base de iodo (Figura 2,  Figura 3). Para solução ablativa contendo iohexol (90-300 mg de iodo / mL), a fluoroscopia é realizada durante e / ou após cada infusão para determinar o sucesso individual da infusão de cada árvore ductal com quantidade parcial ou total de solução infundida (Figura 2, Figura 3). A coleta do tecido da glândula mamária permite avaliar como as mudanças na formulação afetam a destruição das células epiteliais mamárias (Figura 4). Essas análises de imagem fornecem informações para entender a solução mais adequada para alcançar a ablação máxima, minimizando os danos aos tecidos circundantes. Determinamos que a solução de EtOH a 10% fornece uma taxa ablativa comparável às soluções ablativas contendo uma porcentagem maior de EtOH (Figura 4).

Figura 1: Fluxo de trabalho do procedimento intraductal. As principais etapas do procedimento de identificação são destacadas. Por favor, veja o vídeo para mais detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Principais etapas da canulação e infusão intraductal. (A) Injeção de solução salina perpendicular ao teto para dilatar as aberturas ductais para canulação (visão plana mediana). (B) A canulação e o preenchimento de uma árvore ductal (D1) podem ser rastreados com corante azul na solução ablativa (visão plana mediana). (C) A fluoroscopia em tempo real oferece monitoramento preciso e de alta resolução do preenchimento da árvore ductal (D1) com iohexol na solução ablativa (visão do plano dorsal). As aberturas da árvore ductal são numeradas da esquerda para a direita, começando no quadrante superior (D1, quadrante superior esquerdo) e terminando no quadrante inferior (D4, quadrante inferior direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Tamanho do teto e entrega bem-sucedida da solução ablativa a vários ductos. Apresentação típica do tamanho das em coelhos brancos da Nova Zelândia. O tamanho do teto varia de acordo com o peso e a idade do coelho. As glândulas mamárias são numeradas do canto superior esquerdo (L1, cervical esquerdo) ao canto inferior direito (R8, inguinal direito). Todas as imagens são mostradas no plano dorsal. (A) Coelho virgem de 2,8 kg (superior) com menores, difíceis de canular, coelho virgem de 3,5 kg (meio) com tetinas adequadas para canulação e coelho multíparo de 4,1 kg (inferior) com maiores, muito mais fáceis de canular. (B) O corante alimentar azul na solução infundida pode ser usado como evidência in vivo de administração intraductal e obturação da árvore ductal. A infusão malsucedida é indicada com um contorno vermelho (entrega de almofada de gordura, superior) e infusões bem-sucedidas com um contorno azul (administração intraductal, média e inferior). Uma solução de EtOH a 70% causa mais danos à pele (eritema) minutos após a infusão (azul escuro, painel médio) em comparação com uma solução a 10% (azul claro, painel inferior). (C) A fluoroscopia fornece evidências in vivo de administração intraductal. Infusão malsucedida (entrega de almofada de gordura, painel superior). Infusão sequencial bem-sucedida de D1 ductal primeiro e D2 árvore ductal segundo (painel inferior esquerdo). A fluoroscopia ao vivo fornece orientação por imagem para preenchimento (setas brancas) da árvore ductal D3 (painel inferior direito); A linha de extensão preenchida com solução ablativa contendo iohexol e pinças para segurar o teto também são visíveis. As barras de escala correspondem a 1 cm em imagens com diferentes ampliações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise tecidual das glândulas mamárias em coelhos brancos da Nova Zelândia após procedimento intraductal com solução ablativa à base de etanol. (A-B) Coloração representativa de H&E de uma glândula mamária inguinal direita de um animal de 4 meses de idade sem tratamento ablativo em comparação com uma glândula mamária inguinal direita de outro animal com tratamento ablativo de EtOH a 10%. As fatias de tecido são cortadas ao longo do plano mediano, de modo que D1 e D3 (árvores ductais esquerdas) são representadas nas mesmas seções de tecido. A visão de tecido inteiro (A) e a visão de alta ampliação (B) exibem efeitos morfológicos e cromáticos da ablação de EtOH na coloração de H&E (painéis superiores) e classes de células epiteliais e estromais deduzidas com base no classificador treinado assistido por computador (painéis inferiores). A barra de escala preta corresponde a 1 mm em A e a barra de escala branca a 100 μm em B. (C) A barra gráfica exibe a distribuição da classe celular em árvores ductais (n > 4 por grupo) tratadas com diferentes concentrações de EtOH ou não tratadas. Os asteriscos indicam o valor-p do teste t de Welch não pareado de cada classe de células por grupo em comparação com sua classe de células correspondente no grupo tratado com 10% de EtOH (* <0,05, ** < 0,01, **** <0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Em nossos estudos anteriores, mostramos que uma entrega de ID de 70% de EtOH ablação as células epiteliais mamárias, causando danos mínimos ao tecido circundante em roedores ^6,7. Neste procedimento, demonstramos que uma infusão de ID de uma solução ablativa pode ser ampliada para um modelo de coelho. Em particular, demonstramos neste modelo maior com um sistema de árvore multiductal que a infusão sequencial de todos os ductos dentro de uma glândula mamária pode ser infundida com sucesso. Isso representa a próxima fase na tradução desse procedimento ablativo em uma alternativa viável à mastectomia profilática para a prevenção primária em indivíduos de alto risco.

O agente de contraste de raios-X à base de iodo aprovado pela FDA Omnipaque (iohexol) nos permite avaliar o sucesso da infusão, por meio da visualização ao vivo do processo de administração da solução através da árvore ductal. O uso da fluoroscopia para visualizar a glândula mamária infundida corresponde de perto ao que provavelmente serão os equipamentos e instrumentos utilizados para trazer esse procedimento guiado por imagem para a clínica^10,11. Esta modalidade de imagem nos permitirá saber quando interromper a infusão, tornando a fluoroscopia ao vivo um componente chave da implementação clínica deste procedimento ablativo. Estabelecemos a escalabilidade desse procedimento de árvores ductais de roedores para coelhos, mas mais pesquisas são necessárias para determinar a porcentagem de EtOH que melhor ablação das células epiteliais mamárias, minimizando os danos aos tecidos circundantes neste modelo animal maior. Este protocolo enfocou a viabilidade da infusão intraductal e análise tecidual imediatamente após o procedimento. Estratégias de solução de problemas e dicas úteis são detalhadas na Tabela 1. Embora o foco principal deste protocolo seja fornecer soluções ablativas à base de etanol, este protocolo pode ser usado em outras aplicações para fornecer localmente outros reagentes de imagem, sistemas modificadores de genes como CRISPR/Cas9, vetores lentivirais, siRNAs, fatores de crescimento e/ou carcinógenos ^2,3 para estudar outros aspectos do desenvolvimento da glândula mamária e oncogênese em coelhos.

Em conclusão, este protocolo fornece as ferramentas de pesquisa necessárias para realizar um estudo sistemático e longitudinal dos efeitos locais e sistêmicos de diferentes soluções ablativas. Essas informações determinarão a segurança desse procedimento e identificarão quaisquer preocupações relacionadas ao desenvolvimento e avaliação clínica em ensaios clínicos em humanos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lupa 10X com luz e braçadeira, pescoço de ganso grande	Amazona	B0D982JCZ2	Para visualização de tetos
Seringas de insulina Exel International	Fisher Científico	14-841-31	Para injeção periductal de solução salina
Agulhas rombas a granel calibre 27 comprimento 0,5	Tecnologias de Infusão SAI	B27-50 100 Bulk	Para canulação intraductal
Evans azul	Sigma	E2129-50G	Para visualização da glândula mamária
Sistema de imagem de raios-X fluoroscópico	GE HealthCare	DT-C31-01	Para aquisição de imagens por fluroscopia
Cobertor de aquecimento veterinário HotDog	Hotdog	WC71V	Para procedimento intraductal/preparação pré-operatória
Linhas de extensão macho-fêmea, comprimento 12 polegadas	Tecnologias de Infusão SAI	EXT-12	Para procedimento intraductal
Omnipaque 500 mL (350 mg de iodo/mL)	GE Saúde	0407-1414-72	Agente de contraste para visualização de raios-X (fluoroscopia)
Corante alimentar azul estéril	Mccormick	930641	Para visualização da glândula mamária
Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS)	ThermoFisher	14190250	Para preparação da solução
Seringas	BD	309659	Para perfusão intraductal
V-gel	Docsinnovent	D30001 - 30006	Para intubação (o número de catálogo depende do tamanho do V-gel)
Cetoprofeno	Covetrus	#005488	Para analgesia
cetamina	Covetrus	71069	Para analgesia
Lidocaína tópica	Covertus	70859	Para analgesia
xilazina	Covetrus	80907	Para anestesia
Euthasol	Covetrus	#009444	Para a eutanásia
lubrificante para os olhos	Covetrus	75848	Para anestesia
atipamezol	Covetrus	82124	Para anestesia
Banana Chips	Bio-Serv	#F7161	Para aclimatação
Gemas de Fúria	Bio-Serv	#F5136-1	Para aclimatação
Gotas de iogurte	Bio-Serv	#F7200-1	Para aclimatação