Artigo de método

Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática: Uma Ferramenta Reutilizável Impressa em 3D para Microscopia Intravital Hepática

DOI:

10.3791/68337

⸱

17 de março de 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

Neste artigo

Resumo

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Esse protocolo introduz uma Ferramenta de Imagem Hepática Reutilizável (RHIT) de ponta para microscopia intravital (IVM) de camundongos vivos, que aprimora a estabilidade dos tecidos para experimentos rápidos e agudos. O design impresso em 3D do RHIT oferece produção, escalabilidade e versatilidade com custo-benefício, permitindo observação prolongada dos processos metabólicos em camundongos de vários tamanhos.

Resumo

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A função e disfunção hepática podem ser avaliadas visualizando diretamente os processos dinâmicos do fígado usando microscopia intravital confocal (IVM). Em particular, é possível alcançar excelente precisão espacial e temporal na extração de informações tanto qualitativas quanto quantitativas. No estágio do microscópio, manter as condições fisiológicas dos tecidos enquanto se alcança estabilidade e repetibilidade continua sendo desafiador. O aumento do peso e do teor lipídico hepático tem um efeito prejudicial nesse processo em modelos animais de diabetes tipo II (DT2) e doença hepática gordurosa não alcoólica (MAFLD). Para superar essas limitações, criamos o RHIT, um projeto revolucionário de instrumento de imagem que melhora o acesso e a estabilidade dos tecidos. RHIT é um dispositivo de imagem hepática reutilizável e escalável fabricado usando impressão 3D em um método eficiente em uma única etapa. Suas dimensões podem ser alteradas para se adequar a ratos de diferentes tamanhos. Resumidamente, RHIT é um aparelho impresso em 3D para posicionamento e estabilização de animais de laboratório durante microscopia hepática intravital, usado após uma breve preparação cirúrgica para minimizar o manuseio, o estresse e a variabilidade. Seu design padronizado e reutilizável é facilmente produzido e personalizado, suportando uma variedade de tamanhos e potenciais projetos experimentais. Os resultados iniciais demonstram uma melhora notável na estabilidade e confiabilidade da imagem intravital hepática, permitindo a visualização detalhada de estruturas subcelulares, como gotículas lipídicas. Essa precisão aprimorada facilita estudos metabólicos e fisiológicos com maior clareza, reprodutibilidade e potencial para desenhos longitudinais. O protocolo oferece uma abordagem padronizada e acessível que aborda desafios técnicos antigos na MIV hepática.

Introdução

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A microscopia intravital é uma ferramenta poderosa para visualizar processos biológicos in vivo dinamicamente 1,2,3, em contraste com a histologia tradicional de imunofluorescência com imagem de tecidos fixos ou células vivas e análise de citometria de fluxo de células isoladas. Para a inspeção hepática, a MIV tem sido utilizada para examinar secreção e fluxobiliar 4,5, mobilização de glicose 6,7, células não parenquimatosas 8,9,10 e doençashepáticas 11,12. Além disso, no que diz respeito à investigação do acúmulo lipídico, a MIV permite informações em tempo real sobre a dinâmica da formação, crescimento e degradação de gotículas lipídicas em tecidos vivos, como a visualização e quantificação de gotículas lipídicas em alta resolução espacial, e para a correlação direta do acúmulo de gotículas lipídicas com outros processos celulares efisiológicos 13. Apesar dessas vantagens, a IVM ainda é tecnicamente desafiadora: requer equipamentos especializados e conhecimento, pode causar danos tecidos, alterar o comportamento celular e exigir procedimentos invasivos. Estudos tradicionais in vivo, baseados em observação comportamental, monitoramento fisiológico e análise genética, fornecem informações valiosas, mas carecem da resolução espacial e temporal oferecida pela microscopia intravital.

O primeiro grande desafio com a IVM é controlar a instabilidade dos artefatos causada pelo batimento cardíaco e respiração do animal inspecionado, o que pode comprometer a qualidade da imagem, resultando em imagens obscurecidas ou distorcidas dos processos biológicosobservados 15. Tentativas de corrigir isso com processamento de imagem frequentemente resultam na perda de informações espaciais e temporais importantes ou na exigência de equipamentos cirúrgicos avançados e manutenção16,17. Em segundo lugar, modelos camundongos para estudos de doenças hepáticas, como MAFLD e DT2, são frequentemente obesos e, portanto, mais difíceis de estabilizar devido ao aumento do tamanho e do teor lipídicodos tecidos 16,18. Em modelos de camundongos obesos com NAFLD e T2D, o aumento da massa corporal apresenta desafios mecânicos para a imagem intravital, ao exceder a capacidade de carga dos estágios padrão do microscópio e complicar a estabilizaçãoanimal 19. Esse peso adicional aumenta o risco de artefatos de movimento e compressão tecidual, ambos prejudicando a precisão de imagem20.

Simultaneamente, o elevado teor lipídico hepático aumenta a opacidade dos tecidos e o espalhamento da luz, o que degrada a resolução e o contraste da imagem. Esses efeitos são frequentemente agravados por comorbidades metabólicas, como perfusão alterada e inflamação, reduzindo ainda mais a distribuição do corante e a clarezado sinal 21. Por fim, pode ser difícil e prejudicar a repetibilidade manter uma temperatura corporal estável durante a imagem para sustentar a fisiologia dos tecidos e as atividades biológicas. Além disso, a posição estável do fígado no palco do microscópio durante a MIV é crucial para prevenir estresse mecânico ou danostecidulares 7. Expor o tecido hepático é um procedimento delicado que requer precisão técnica para evitar sangramentos graves e danos ao parênquimahepático 7. Para reduzir artefatos de movimento, a caixa torácica do camundongo foi previamente levantada do palco do microscópio usando papelão, permitindo que a gravidade arraste o fígado para longe do restante docorpo 22. Embora essa abordagem tenha se mostrado bem-sucedida em produzir dados quantificáveis, o material de papelão é insustentável, pois perde a forma e é difícil de limpar. Além disso, é difícil alterar as dimensões do inserto de papelão para acomodar modelos de camundongos obesos.

Nos últimos anos, surgiram várias técnicas avançadas de microscopia hepática intravital, incluindo microscopia de campo de varredura e sistemas ópticos computacionalmente aprimorados, que demonstraram melhorias na resoluçãoespaço-temporal 23, redução dafototoxicidade 24, maior profundidade de imagem25,26 e supressão de artefatosde movimento 27. Esses desenvolvimentos, como demonstrado em estudosrecentes 28, 29, 30, representam um importante progresso tecnológico na área. Este artigo apresenta a Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática (RHIT), uma ferramenta inovadora para a MIV do fígado murino. O RHIT contribui para esse cenário em evolução ao oferecer uma ferramenta escalável e reutilizável que aumenta a estabilidade mecânica e o acesso aos tecidos em diversos modelos animais, incluindo aqueles com doenças metabólicas. Seu design aborda os desafios persistentes de movimento, variabilidade e complexidade de configuração ao integrar ajuste anatômico, reprodutibilidade de estágios e facilidade de uso. A compatibilidade do RHIT com modalidades de imagem convencionais e avançadas amplia a utilidade dessas técnicas emergentes, promovendo imagens hepáticas intravitais confiáveis e fisiologicamente estáveis.

Embora várias abordagens para estabilizar o tecido durante a IVM tenham sido propostas, como uma janela cirúrgica 9,31,32,33,34,35,36 e acrílico montado sob medida no estágio 6,37, esses métodos também introduzem inúmeras limitações e complexidades em relação à escalabilidade, reprodutibilidade e habilidades cirúrgicas. Comparativamente, o RHIT é funcionalmente distinto em seu propósito e design. Ele não depende de compressão direta ou embedding à base degel 38. Em vez disso, o RHIT serve como uma ferramenta escalável, reutilizável e anatomicamente contornada que apoia o isolamento do fígado por meio do posicionamento gravitacional, mantendo a orientação fisiológica sem restringir ou distorcer o tecido. De forma crítica, o RHIT melhora a reprodutibilidade dos dados, a fidelidade de imagem e a consistência procedural em uma ampla variedade de tamanhos de mouse. Elimina a necessidade de géis, adesivos ou interfaces cirúrgicas complexas, ao mesmo tempo em que simplifica o alinhamento dos tecidos e o controle de temperatura. Além disso, o RHIT é uma ferramenta especializada que faz a ponte entre o animal e o microscópio, projetada para auxiliar tanto no suporte fisiológico quanto na precisão da imagem.

O RHIT aborda diretamente os desafios mecânicos e ópticos de modelos metabolicamente comprometidos por meio de sua geometria escalável, que acomoda animais de maior porte enquanto distribui o peso de forma uniforme para minimizar a instabilidade da plataforma. A abertura hepática recuada estabiliza o tecido usando a gravidade sem força de compressão, permitindo acesso consistente e reduzindo o movimento durante a imagem. Seu design reutilizável e quimicamente inerte garante compatibilidade com tecidos biológicos enquanto apoia a reutilização higiênica. Ao permitir posicionamento consistente, minimizar artefatos de movimento e manter a integridade dos tecidos, o RHIT oferece um avanço fundamental nos fluxos de trabalho intravitais de microscopia. Sua adaptabilidade e disponibilidade de código aberto promovem ainda mais ampla utilidade em laboratórios e modelos animais, estabelecendo um novo padrão para ferramentas de imagem que suportam tanto o espécime quanto o sistema de imagem.

Além disso, estágios de microscópio aquecidos comercialmente disponíveis podem exigir configurações avançadas e manuseiode 39 microscópios. Eles não são escaláveis ao espécime e geralmente são mais caros, tornando-os menos acessíveis para muitos pesquisadores. Assim, um inserto reutilizável e escalável é importante para padronizar a IVM para diferentes modelos animais. A tecnologia impressa em 3D, também chamada de manufatura aditiva, tornou-se cada vez mais popular nos laboratórioscientíficos, transformando protocolos de laboratórios de bioquímica, física e biologia. Para a IVM, a tecnologia 3D tem sido usada para fabricar janelas ópticas levesde imagem 41,42, melhorar a acessibilidade dos tecidos43 e facilitar o reparo e reconstrução de tecidos44. Assim, uma ferramenta personalizada para estabilização de tecidos, que, até onde sabemos, não foi descrita, representa uma excelente oportunidade para empregar impressão 3D e superar alguns dos desafios da MIV hepática.

O RHIT é criado utilizando um método de impressão 3D em uma etapa e melhora substancialmente a estabilização dos tecidos por um período prolongado. O RHIT é altamente acessível e adequado para experimentos agudos de MIV que exigem conhecimento cirúrgico mínimo. Além disso, o RHIT é facilmente escalável para o tamanho animal e possui baixo custo de produção. Por fim, demonstramos que o RHIT permite imagens de fluorescência estáveis em time-lapse e melhora a estabilidade dos tecidos em comparação com o inserto de papelão usado anteriormente. A RHIT simplifica a IVM da homeostase lipídica hepática sem contato direto ou impacto mensurável em condições fisiológicas. Consequentemente, o RHIT apresenta uma vantagem competitiva como uma contribuição acelerada, reutilizável e adaptável aoIVM 34, 36, 45.

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Figura 1: Projeto RHIT. (A) Projeto e dimensões de um RHIT de 3,0 mm escalado para um camundongo obeso. A vista do rosto (esquerda) mostra as dimensões, posicionamento e tamanho da abertura do tecido, bem como a orientação do camundongo durante a imagem. A vista lateral (à direita) inclui dimensões e indica a posição da almofada térmica e do inserto da sonda de temperatura. Parâmetros de escala para diferentes tamanhos de mouse são fornecidos na Tabela 1. (B) Vista 3D enface do RHIT gerada a partir do arquivo STL de código aberto, mostrando onde o fio retal da sonda é inserido pela porta personalizada (rotulada como dimensões do inserto retal da sonda mostradas no canto superior direito). (C) Montagem técnica do RHIT mostrando a integração do dispositivo de aquecimento e dos insertos estruturais personalizados para vários tamanhos do RHIT, o fio é encaixado no inserto retal da sonda para acesso à sonda de temperatura. Abreviação: RHIT = Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O RHIT foi originalmente projetado como um conjunto de peça única usando ABS (Estireno de Butadiena de Acrilonitrila), um polímero termoplástico amplamente utilizado na modelagem por deposição fundida para impressão3D 45. O ABS oferece várias vantagens para essa aplicação: é leve, resistente ao calor (ponto de fusão ~200 °C) e possui boa resistência ao impacto 46,47,48. O design do RHIT aproveita a densidade ajustável do ABS, permitindo que absorva movimentos fisiológicos como batimentos cardíacos e respiração. O aumento da densidade de preenchimento melhora o amortecimento de movimento, resultando em maior estabilidade de imagem e melhor qualidade de imagem.

O RHIT é projetado para absorver movimento por meio de ajustes na densidade de um material quimicamente inerte, como o ABS. Nesse contexto, densidade refere-se especificamente à porcentagem interna de preenchimento usada durante a impressão 3D, que afeta a rigidez e a capacidade da plataforma de amortecervibrações 49,50,51. O aumento da densidade do ABS tem sido observado como reduzindo a transmissão de movimentos causada pelo batimento cardíaco e pela respiração, resultando em uma plataforma estável para imagem e melhoria da qualidade da imagem. Testamos construtos do RHIT com densidades de preenchimento interno variáveis (20-100%) e observamos qualitativamente que configurações de maior densidade levavam a artefatos de movimento visivelmente reduzidos durante a imagem intravital hepática em camundongos. A quantificação formal não foi realizada, pois a configuração de alta densidade mostrou-se suficientemente resistente e eficaz em todos os tamanhos do RHIT testados, e forneceu consistentemente desempenho confiável sob condições de imagem rotineiras. Para a maioria dos usuários, essa densidade padrão será adequada sem ajustes adicionais. No entanto, para experimentos que exigem características mecânicas específicas, a densidade de preenchimento e os parâmetros de projeto podem ser modificados, e instruções completas de impressão 3D foram fornecidas para suportar essa personalização.

Materiais alternativos podem ser usados para impressão; no entanto, o ABS é o material preferido para a fabricação do RHIT, pois oferece várias vantagens importantes. É quimicamente inerte, minimizando o risco de interação com tecidos ou fluidos corporais, e insolúvel em água, permitindo limpeza, armazenamento e reutilização eficientes. Essas propriedades tornam o ABS uma escolha confiável e durável para uso experimental. Quando o acesso a uma impressora de modelagem por deposição fundida é limitado, outras técnicas e materiais de impressão 3D podem ser utilizados. Estereolitografia, sinterização seletiva a laser e fusão multi-jato são opções adequadas com materiais como náilon, resinas fotopoliméricas ou pós compostos. O nylon oferece durabilidade e flexibilidade, enquanto as resinas de estereolitografia oferecem alta resolução para aplicações que exigem detalhes estruturais finos. O design RHIT pode ser facilmente adaptado às tolerâncias e restrições de diferentes materiais, tornando-o compatível com uma variedade de plataformas de impressão. Os usuários devem selecionar materiais com base na estabilidade mecânica, biocompatibilidade, compatibilidade com fluxos de trabalho de imagem e recursos de impressão disponíveis.

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Protocolo

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Todos os estudos com animais foram realizados nas instalações dos Institutos Nacionais de Saúde em conformidade com diretrizes e protocolos autorizados pelo Comitê de Ética para Experimentos com Animais (protocolo nº LCMB-037). Todo o pessoal deve ser devidamente treinado antes de prosseguir com os seguintes protocolos. O manuseio dos animais foi realizado em conformidade com as diretrizes institucionais.

O protocolo RHIT descreve a preparação de Ferramentas de Imagem Hepática Reutilizáveis (RHITs) para uso em experimentos de microscopia intravital (IVM). Os procedimentos experimentais são realizados em uma sala de microscópio esterilizada, ou capuz, e envolvem uma série de etapas: primeiro, a impressão do RHIT, anestesia e marcagem fluorescente do camundongo, depois a montagem do microscópio, depois o procedimento cirúrgico e, por fim, a aplicação da MIV assistida por RHIT. A Figura 1 e a Figura 2 ilustram os componentes necessários para a imagem de amostras vivas usando um microscópio confocal, que incluem um inserto metálico 5,6,7 (adaptador de microscópio para imageamento de amostras vivas) para a colocação do RHIT, bem como RHITs para uso em esteatose avançada ou controlada. Para testar o sistema, foram obtidos machos C57BL/6J Mus musculus de 6 a 10 semanas e alimentados com dieta padrão ou ocidental por 8 a 10 semanas antes do experimento.

1. Projetando o RHIT com modificações

  1. Para recriar o RHIT, use software de design de produtos 3D (veja a Tabela de Materiais). Abra o software de design e crie uma nova peça padrão. Salve o arquivo com uma descrição apropriada.
  2. Crie o esboço do RHIT no plano frontal usando o recurso Criar Esboço 2D .
    1. Clique no ícone do retângulo e coloque o canto inferior esquerdo na origem do plano do esboço.
    2. Desenhe um segundo retângulo dentro do primeiro para representar a janela de imagem do RHIT.
    3. Adicione dimensões a ambos os retângulos usando a característica Dimensão , garantindo que todos os comprimentos e larguras sejam referenciados à origem e relativos entre si.
    4. Ajuste as dimensões do RHIT de acordo com o tamanho do mouse.
    5. Adicione espessura ao RHIT selecionando apenas o retângulo externo e clicando em extrudar. Quando aparecer um pop-up, selecione o esboço usando a ferramenta Extrude para deixar uma abertura no centro.
    6. Selecione a face inferior do RHIT extrudado e comece um novo esboço 2D usando o recurso Start 2D Sketch .
  3. Desenhe um retângulo para definir o bolso da almofada térmica. Aplique as dimensões adquiridas usando o recurso Dimension .
    1. Saia do esboço 2D e realize uma remoção de material usando a ferramenta Cut Extrude para criar uma cavidade profunda para a almofada térmica.
  4. Comece um novo esboço para a sonda de temperatura na mesma face da cavidade. Clique em iniciar um esboço 2D e selecione o ícone do círculo . Coloque o círculo na superfície plana e dimensione-o de acordo. Saia do modo esboço .
    1. Clique em extrudar e selecione o esboço do círculo. No modo deextrusão , clique em extrude cortada e espere aparecer um popup com uma opção de remoção geral para remover material. Clique em OK. Sair do modo extrusão .
    2. Adicione filetes nas bordas da janela clicando no ícone de filete e selecionando todas as oito bordas nítidas. Adicione o tamanho do filete e saia do modo filete .
      NOTA: Se se deseja absorção adicional de movimento, os usuários podem aumentar a densidade interna de preenchimento durante a preparação para impressão 3D.
  5. Prepare o modelo para impressão 3D navegando até a aba ambiente e selecionando a aba Impressão 3D.
    1. Use a função Set Orientation para garantir que o modelo esteja deitado plano sobre a base de impressão e não orientado verticalmente.
    2. Clique em Opções de Impressão para configurar as configurações da unidade e ajustar a escala, se necessário.
    3. Salve o modelo finalizado. Formatação STL usando a função de exportação STL .
    4. Saia da aba ambiente e clique em salvar para salvar o RHIT como uma parte sólida.
  6. Feche o programa de design.
    NOTA: Certifique-se de que a impressora é compatível com o arquivo . Formato de arquivo STL ou converter para o formato apropriado conforme exigido pelo software da impressora 3D.

2. Upload e impressão do RHIT a partir de arquivos STL

  1. Importe o arquivo .stl da Figura 1A ou Arquivo Suplementar 1 para um software de design assistido por computador (CAD) 3D clicando em Importar e selecionando o arquivo .stl. Clique no botão Preparar para cortar o modelo em camadas finas para impressão 3D.
  2. Selecione a impressora comercial 3D apropriada e clique em Imprimir. Depois, monitore o progresso da impressão e, uma vez concluída, remova e limpe o objeto impresso em 3D conforme necessário.
Tamanho do Mouse.Peso Corporal do Rato (g)Espessura RHIT (mm)Imagem da Janela Tamanho L x W (mm)
Pequeno (S)17-201.517 x 17
Médio (M)22-252.521 x 21
Grande (L)35-40326 x 26

Tabela 1: Escalonando o tamanho do mouse para RHIT. O peso do camundongo é ajustado à espessura do RHIT, onde um peso maior que 30 g (ponta de seta) corresponde ao maior RHIT (3,0 mm). O camundongo mais leve corresponde ao RHIT mais fino, e os camundongos obesos são representados pelo RHIT mais espesso. Essas dimensões podem ser ajustadas em softwares CAD. O comprimento e a abertura de imagem do RHIT podem variar conforme a localização do órgão do espetáculo utilizado; comprimento constante e abertura de imagem para os três RHITS foram adequados para este estudo. Abreviações: RHIT = Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática; CAD = projeto assistido por computador.

3. Preparação de microscópio e utilização do RHIT

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Figura 2: Metralhadora intravenosa do fígado usando a técnica RHIT. (A) Esquema do sistema do microscópio confocal invertido com um rato anestesiado. (B) Um adaptador metálico de microscópio (insert) era usado para posicionar o rato no palco do microscópio para imagens ao vivo. (C) O RHIT impresso em 3D foi usado com uma tira de gaze para manipular facilmente o parênquima hepático. (D) Imagem do fígado pré-exteriorizado antes do posicionamento RHIT. O cone do nariz foi usado para anestesia antes e durante a cirurgia. (E) Imagem do fígado exteriorizado antes do posicionamento RHIT durante um procedimento agudo. Não era necessário fazer a barba. (F) Imagem do rato invertido na posição final virada para baixo no RHIT para imagem. (G) RHIT fixado firmemente ao palco do microscópio. (H) Um mouse posicionado em RHIT e adaptador metálico. (I) Camundongos magros (seta azul) e obesos (seta verde) mostrados com respectivos insertos escamados na RHIT em J-L representam imagens anatômicas grosseiras do fígado obeso e magro (respectivamente). A IVM em alta resolução imagens M,N do fígado de camundongos obesos e magros marcados com BODIPY (verde, representado por uma seta rosa) para marcar gotículas lipídicas e Hoechst 33342 (branco, representado por uma seta ciano) para marcar os núcleos, respectivamente. Abreviações: RHIT = Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática; IVM = microscopia intravital. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

  1. Prepare um microscópio confocal invertido convencional para MIV hepática, conforme mostrado na Figura 2.
    1. Insira um adaptador de palco para acomodar a amostra. Para seguir esse protocolo, utilize um inserto metálico personalizado com abertura circular de 35 mm e um vidro de cobertura de 40 mm.
    2. Limpe cuidadosamente ambos os lados do vidro da cobertura antes e depois de cada imagem, usando etanol a 70% conforme necessário.
  2. Fixe o RHIT apropriado com base no tamanho do mouse (Tabela 1) com fita adesiva (opcional) alinhando a abertura do RHIT com a lente objetiva e paralelamente sobre o revestimento de imagem (Figura 2G) no inserto metálico com fita sobre o vidro da cobertura.
  3. Escolha um objetivo para imagem com base no tamanho da área, resolução espacial e tempo de imagem, como um objetivo de água de 25x/0,95.
    NOTA: Embora uma ampliação maior melhore a resolução, ela também aumenta a probabilidade de artefatos de movimento.
    1. Nivele o objetivo perto do vidro da cobertura.
  4. Prenda uma tira de gaze (aproximadamente 1 x 8 cm, Figura 2C,D) na janela RHIT com fita adesiva para ajudar a posicionar o tecido e separá-lo de outros órgãos abdominais (Figura 2C).
  5. Pré-aqueça a RHIT usando uma almofada térmica inserida na ranhura e fixe a sonda térmica adjacente à RHIT (Figura 2G,H) para manter a temperatura corporal do camundongo durante a imagem.

4. Marcagem fluorescente e anestesia de camundongos

  1. Reduza o estresse do rato higienizando a câmara de indução anestésica para eliminar quaisquer últimos vestígios de cheiro animal.
  2. Ligue o condensador de oxigênio, um sistema de proteção ambiental (EPS) e o vaporizador de isoflurano.
  3. Coloque o camundongo na câmara de indução e anestesie usando isoflurano a 2-3% por aproximadamente 3-5 minutos, ou até que o animal apresente respiração estável e perda dos reflexos de endireitamento e pedal.
    1. Uma vez anestesiado, transferir o camundongo para a almofada térmica e manter a anestesia usando isoflurano 1-2% administrado pelo cone nasal (Figura 2D), ajustando conforme necessário para garantir um plano cirúrgico estável de anestesia durante todo o procedimento.
    2. Avalie a profundidade da anestesia fazendo um teste de beliscão do dedo para observar qualquer movimento voluntário.
  4. Para marcar estruturas ricas em lipídios, injete 200 nmol de BODIPY 665/676 diluído em PBS (volume total 200 μL) pela veia caudal usando uma seringa de insulina de 31 G.
    1. Para um sinal ideal, administre BODIPY uma vez ao dia por 2 dias consecutivos antes da imagem. Deixe pelo menos 3-4 horas após a segunda injeção para garantir a eliminação sistêmica do fundo e estabilização do sinal tecidual.
  5. Para fornecer contraste nuclear, injete Hoechst 33342 (2 μg/g de peso corporal) diluído em 1x solução de heparina (preparada misturando 120 μL de heparina com 180 μL de soro fisiológico para obter 400 U/mL) através do seio retroorbital usando uma seringa de insulina de 31 G.
    NOTA: Hoechst é administrado separadamente para evitar precipitação quando misturado com outros corantes.
  6. Para visualizar a vasculatura, injete 18 μg/g de peso corporal de dextrano fluorescente (70 kDa) diluído na mesma solução 1x de heparina descrita no Passo 4.5, via o seio retroorbital contralateral usando uma seringa de insulina de 31 G (Tabela 2).
    NOTA: A heparina é incluída para reduzir a formação de coágulos e promover fluxo sanguíneo consistente durante a obtenção de imagens.
  7. Espere de 10 a 15 minutos após as injeções de Hoechst e dextran antes de iniciar a cirurgia e a imagem.
Repórter de FluorescentePropósitoDose por peso (ou concentração)
Hoechst 33342Núcleos de coloração2 μg/g: suplemente o volume do injetor a 50 μl com solução de heparina
Carroceria 665/676Gotículas lipídicas de mancha0,8 μg/g: suplementar o volume do injetor até 200 μl em solução fisiológica
2M tetrametil rodamina-dextrano (Dextran)Vasculatura de manchas18 μg/g: suplemente o volume do injetor até 50 μl com solução de heparina

Tabela 2: Opções de repórteres fluorescentes. Esta tabela fornece uma descrição detalhada dos métodos usados para marcar tecidos de camundongos para imagens in vivo. A solução de heparina é preparada primeiro e depois usada para produzir as soluções DAPI-heparina edextran-heparina 7. Hoechst 33342 é injetado retro-orbitalmente em um olho, enquanto BODIPY é injetado diretamente na veia caudal 2-3 dias antes, com concentração maior para camundongos obesos. Dextrano é injetado retroorbitalmente no outro olho. É importante realizar injeções retroorbitais separadamente em cada olho. Abreviação: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol.

5. Procedimento cirúrgico de camundongo

  1. Raspe o pelo abdominal usando um aparador e/ou creme depilador. Remova resíduos de cabelo e use etanol 70% para limpar a pele exposta.
    NOTA: Dependendo dos requisitos institucionais da IACUC, pode ser usada uma aplicação alternada de betadine e etanol para garantir a preparação adequada do local cirúrgico.
  2. Reavalie a profundidade da anestesia antes da cirurgia.
  3. Expor o fígado fazendo uma incisão horizontal em forma de crescente de 2-3 cm sob a caixa torácica com tesouras cirúrgicas a partir do xifoide, terminando no lado lateral esquerdo do abdômen superior.
  4. Após a incisão inicial, faça cuidadosamente uma incisão secundária menor na camada muscular para expor o lobo esquerdo do fígado, cauterize (opcional) conforme necessário para evitar sangramento (Figura 2E).
    1. Evite danos ao fígado durante o uso do cauterizador colocando uma gaze embebida em soro entre o fígado e a camada muscular para absorver o calor emanado da camada muscular.
    2. Evite qualquer sangramento excessivo, trauma cirúrgico ou mecânico, ou compressão externa.
  5. Uma vez exposto o fígado, transfira o camundongo para o estágio do microscópio.

6. Colocação do mouse no palco do microscópio

  1. Posicione o abdômen do rato anestesiado voltado para baixo sobre a plataforma RHIT do microscópio.
    1. Ajuste o cone do nariz para que o camundongo permaneça sob anestesia.
    2. Utilize um aplicador umedecido com ponta de algodão umedecido com soro para manobrar delicadamente o lobo lateral esquerdo do fígado contra a cobertura, aplicando uma pressão externa suave na cavidade torácica.
      NOTA: Aproveite a gravidade para manobrar cuidadosamente o fígado para fora e sobre o vidro da cobertura.
    3. Use uma tira de gaze para separar suavemente o fígado do corpo do rato (Figura 2E-H).
  2. Verifique novamente o cone do nariz para garantir que o camundongo permaneça sob anestesia durante a imagem.
  3. Previna a desidratação dos tecidos aplicando um gel à base de água ao redor das bordas da cavidade exposta e evitando contato direto com a almofada térmica.
    NOTA: Manter temperatura e umidade também pode ser facilitado por um microscópio com câmara de umidade fechada 5,6,7.
  4. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea.
  5. Configure uma MIV em time-lapse para começar a imagem 7,52.
    1. Abra as persianas do laser, avalie a marcação fluorescente e identifique uma região estável de interesse com fluxo sanguíneo notável. Selecione parâmetros apropriados de aquisição de imagem, incluindo formato de imagem, velocidade de aquisição, intervalos de imagem, duração total de aquisição e média linha/quadro (512 × 512 pixels; 1-5 quadros s⁻¹ por região; intervalos de imagem de 5-30 s; tempo total de aquisição de 5-20 min; média linha/quadro de 2-8, dependendo dos requisitos experimentais). Otimize a exposição ao flash de fluorescência para acomodar os fluoróforos utilizados.
    2. Defina limites superiores e inferiores para as pilhas Z selecionando a Pilha Z no painel de aquisição , ajustando os planos focais superior e inferior usando os controles de posição Z, e confirmando a faixa com Definir Primeiro/Colocar Último; em seguida, inicie a gravação em lapso de tempo clicando em Iniciar Experimento (ou Iniciar Aquisição). Ao final da exame de imagem, eutanasie o animal de acordo com os protocolos institucionais de cuidado animal e utilize os protocolos aprovados pelo comitê.

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Figura 3: Medindo a melhora da estabilidade hepática da MIV do RHIT com SSIM. MIV hepática do lobo inferior esquerdo do fígado sob três condições de estabilização: (A) sem inserção (NENHUMA), (B) inserção de papelão e (C) RHIT. Os tecidos são marcados com BODIPY (magenta, lipídios), Hoechst 33342 (verde, núcleos) e Dextrano (ciano, vasculatura); os painéis A e B mostram distorção visível e artefatos de movimento, enquanto o C demonstra maior clareza com o RHIT. (D) O índice de similaridade estrutural (SSIM) foi calculado para quantificar a estabilidade da imagem. Barras mostram a média ± SEM, e cada ponto colorido representa uma réplica biológica individual: RHIT (n = 14), Papelão (n = 10), Sem Inserção (n = 8). Esses grupos são subconjuntos provenientes da coorte experimental geral de aproximadamente 50-70 camundongos. Apenas sessões que atenderam a critérios específicos de imagem (por exemplo, alinhamento consistente de quadros e qualidade de imagem) foram analisadas via SSIM. O RHIT produziu consistentemente valores SSIM mais altos (média de 0,511 ± SEM), indicando melhor estabilidade e resolução em todas as condições de imagem. Barras de escala = 15 μm. Imagens representativas são mostradas; O SSIM reflete sessões seriadas de IVM sem danos ou perturbações teciduais observáveis. Abreviações: RHIT = Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática; IVM = microscopia intravital; SSIM = índice de similaridade estrutural; CARD = inserção de papelão. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Resultados

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O RHIT foi projetado usando uma aplicação CAD (Figura 1). As dimensões do RHIT são ajustadas para acomodar camundongos pequenos, médios e pesados (Tabela 1). O projeto RHIT consiste em um material plano ABS de 107,50 mm de comprimento com uma abertura posicionada para acomodar imagens hepáticas. A IVM foi realizada sob condições ótimas (RHIT) e subótimas (sem inserção ou papelão) (ver Figura 3A-C

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Discussão

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A microscopia intravital hepática tem sido amplamente estudada, porém métodos anteriores frequentemente exigem procedimentos cirúrgicos altamente invasivos e não padronizados para imagem terminalestabilizada 5,6,7,9,31,32. O movimento é, possivelmente, a barreira mais desafiadora que impede a...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramuros dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA, do Instituto Nacional do Câncer e da biblioteca do NIH. H. Sanchez Cornejo agradece à Agência Peruana CONCYTEC pelo apoio financeiro por meio da bolsa nº PE501087367-2024-PROCIENCIA. Queremos agradecer aos membros do laboratório Porat-Shliom e colaboradores do grupo de Física Quântica da Universidade de Cambridge pela leitura crítica, à equipe da biblioteca do NIH e a Geneti Gaga pela assistência técnica. A imagem renderizada em 3D na Figura 2A foi criada usando Biorender.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
½-inch fita de máscaraFita de Máscara de Uso Geral 3M:b40069428
Coberturas de 40 mmBioptech40-1313-03191
Etanol de 70% (v/v)Thermo Fisher ScientificBP2818-470% etanol em volume e 30% água em volume
Máquina de anestesia: AMD-3 PlusSomniAMD-17106
Gel de transmissão de ultrassom Aquasonic 100Laboratórios Parker  01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932Veja a Tabela 2
Software CAD (Autodesk Inventor ou equivalente) & nbsp;Autodesk (software CAD representativo)N/ASoftware
Sistema de CautéreosGêmeosGEM 5917
Desinfetante ClidoxLaboratórios de Pesquisa Farmacêutica Inc.VWR, MSPP-96118F
Microscópio confocal (Leica SP8 ou equivalente)LeicaSP8
Aplicadores com ponta de algodãoProdutos Médicos Puritanos25-806 1WC
Inserto de palco de alumínio feito sob medida (3 mm de espessura, depressão de 35 mm)N/AN/A
FORANO (isoflurano, USP) líquido para inalação, 250 mLBaxter10019-360-60
Cortador de cabelo (opcional)Ônix Fine InstrumentsASWRHC
Almofada térmica com sonda retalInstrumentos Científicos da ALAALMOFADA TÉRMICA-1/2
Heparina sódica, 1000 USP U/mLHikma0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249Veja a Tabela 2
Tapete térmico do mouseInstrumentos Científicos da ALAALMOFADA TÉRMICA-1/2
Mus musculusO Laboratório JacksonC57BL/6Rato de laboratório
Soro fisiológico normal (cloreto de sódio 0,9%)Thermo Fisher Scientific7210-16
RHIT (Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática) tamanho aplicávelFornecidoN/AVeja a Tabela 1
Pinças cirúrgicas, ponta curvaFerramentas Científicas Finas11251-23
Gaze cirúrgicaMckesson6939
Tesoura cirúrgicaFerramentas Científicas Finas14001-14
Tetrametilrodamina DextranoThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139Veja a Tabela 2
Seringas de insulina Ultra Fine U-100, 31 gBetty MillsBD326730

Referências

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