Biossensores geneticamente codificados baseados em fluoróforo para imagens de fluorescência raciométrica em micróbios

Resumo

Este protocolo descreve a aplicação de biossensores geneticamente codificados baseados em fluoróforos em micróbios para imagens quantitativas de fluorescência raciométrica sob condições controladas. Ao integrar essas estratégias de biossensoriamento com técnicas avançadas de imagem, o método permite análises de alta resolução e em tempo real no nível de uma única célula, fornecendo insights mais profundos sobre a dinâmica de moléculas pequenas.

Resumo

Investigar a dinâmica de pequenas moléculas dentro de micróbios é essencial para estudos abrangentes da função microbiana. A dinâmica de pequenas moléculas intra-organismo e inter-organismo desempenha papéis críticos na fisiologia microbiana, simbiose e doença. No entanto, o monitoramento dessas dinâmicas continua sendo altamente desafiador usando a maioria das técnicas existentes. Os biossensores geneticamente codificados baseados em fluoróforos são ferramentas poderosas para rastrear a dinâmica de pequenas moléculas in vivo e possuem alto potencial para impulsionar novas descobertas. Esses biossensores são mais comumente usados em imagens de fluorescência, muitas vezes em combinação com dispositivos de perfusão que permitem um controle preciso sobre as condições ambientais. Quando integrada a técnicas avançadas de imagem, essa abordagem fornece dados de alta resolução, resolvidos espacial e temporalmente, permitindo insights sobre as respostas microbianas de uma única célula. Apesar de sua promessa, a implementação de tais biossensores continua sendo tecnicamente desafiadora. Compreender as principais etapas é crucial para uma adoção mais ampla. Aqui, apresentamos um protocolo projetado para apoiar a implantação efetiva de biossensores recém-projetados em micróbios para imagens de fluorescência raciométrica quantitativa sob condições controladas.

Introdução

Os biossensores baseados em intensidade de fluoróforo único e fluoróforo duplo são amplamente utilizados por pesquisadores para uma variedade de aplicações¹. Alguns estudos empregaram análises de biossensores multiplex para rastrear simultaneamente vários sinais dentro das mesmas células². Muitos desses biossensores dependem de domínios de ligação ao ligante, onde os eventos de ligação induzem mudanças conformacionais que alteram as propriedades de fluorescência ^3,4. Os biossensores geneticamente codificados tornaram-se ferramentas essenciais para imagens in vivo em uma variedade de sistemas⁵, permitindo o monitoramento de alta resolução dos níveis de íons e metabólitos no espaço e no tempo¹. Os primeiros biossensores, no entanto, eram limitados na faixa dinâmica e na relação sinal-ruído (SNR)⁶. Avanços recentes em biossensores intensiométricos de fluoróforo único baseados em proteínas fluorescentes conformacionalmente sensíveis (csFPs) melhoraram significativamente o desempenho. No entanto, variações nos níveis de expressão de proteínas podem afetar as medições in vivo usando biossensores baseados em fluoróforos geneticamente codificados⁶, que são comumente empregados para visualizar moléculas de sinalização e metabólitos em células vivas ^7,8. Os biossensores intensiométricos de fluoróforo único não permitem a normalização dos níveis de expressão do biossensor, que podem flutuar in vivo. A incorporação de uma proteína fluorescente de referência, no entanto, pode converter biossensores de fluoróforo único em versões raciométricas de fluoróforo duplo, permitindo quantificações mais confiáveis⁹. Devido à perda de energia de processos não radiativos, o espectro de emissão fluorescente é deslocado em relação ao espectro de absorção, um fenômeno conhecido como deslocamento de Stokes¹⁰. A proteína fluorescente de deslocamento de grande porte de Stokes (LSSFPs) tem sido empregada como fluoróforos de referência ideais em biossensores ratiométricos de fluoróforo duplo ^9,11. Um avanço recente é o desenvolvimento de biossensores Matryoshka Green-Apple (GA) monocromaticamente excitáveis, conhecidos como GA-MatryoshCaMP6s, que incorporam um LSSFP vermelho, chamado LSSmApple¹². Quando combinados com microdispositivos como sistemas microfluídicos, os biossensores geneticamente codificados baseados em fluoróforo oferecem uma abordagem minimamente invasiva para imagens raciométricas quantitativas usando técnicas como microscopia confocal. Essa integração permite imagens de alta velocidade e monitoramento em tempo real da dinâmica de pequenas moléculas em células individuais sob estresse ambiental. Por exemplo, os biossensores de cAMP e glicose foram aplicados com sucesso em leveduras. Quando usados em conjunto com cepas mutantes, esses biossensores ajudaram a elucidar as principais redes regulatórias que regem a absorção de açúcar^13,14. Apesar do progresso significativo, essas tecnologias ainda não atingiram todo o seu potencial para investigar questões biológicas críticas envolvendo a dinâmica de pequenas moléculas in vivo¹⁵. Como resultado, sua ampla adoção em todos os laboratórios permanece limitada e ainda faltam metodologias padronizadas para uma implementação mais ampla.

Em comparação com as metodologias tradicionais que dependem de biossensores de fluoróforo único não raciométricos ou medições em nível de massa, nosso protocolo baseado em biossensores GA Matryoshka permite imagens de célula única de alta resolução com análise raciométrica quantitativa. Ao integrar o grande fluoróforo de deslocamento de Stokes como referência interna, o método compensa a variabilidade na expressão do biossensor, uma limitação importante dos projetos anteriores. Além disso, a combinação com dispositivos microfluídicos permite o controle preciso das condições ambientais, oferecendo uma melhoria em relação às câmaras de perfusão convencionais ou sistemas de cultura estática¹². Essa abordagem também oferece vantagens distintas para o estudo de interações dinâmicas entre micróbios e seus hospedeiros, como interações planta-patógeno e associações simbióticas, como micorrizas, onde a resolução espacial e temporal em nível celular é essencial para descobrir os mecanismos moleculares de comunicação e troca de nutrientes.

Nesse contexto, apresentamos um protocolo passo a passo detalhado para imagens de biossensores raciométricos em micróbios. Embora especificamente otimizado para a implementação em leveduras, este protocolo pode ser adaptado para uso em outros micróbios, incluindo bactérias, e estendido a organismos não modelo, como micróbios associados a plantas. Por exemplo, os biossensores podem ser usados em conjunto com sistemas microfluídicos para imagens quantitativas de fluorescência da sinalização de cálcio em leveduras, permitindo o monitoramento em tempo real das respostas de cálcio sob estresse ambiental¹⁴.

Este protocolo destina-se a orientar os pesquisadores na implantação eficaz de biossensores recém-projetados, avançando assim na exploração de processos biológicos por meio de imagens fluorescentes baseadas em biossensores em sistemas microbianos. Inclui recomendações práticas sobre as condições de cultura de levedura, configurações ideais de excitação/emissão e compatibilidade com cepas de levedura comumente usadas (por exemplo, K601 e W303-1A MAT-a). Limitações notáveis incluem fotobranqueamento durante sessões de imagem prolongadas e desafios relacionados à expressão de biossensores em amostras biológicas. Uma vez que vários fatores podem influenciar o resultado de experimentos de imagem de biossensores in vivo , este protocolo passo a passo também visa ajudar os pesquisadores a antecipar e superar possíveis desafios, facilitando assim implementações reprodutíveis.

Protocolo

1. Projeto racional de biossensores raciométricos (Figura 1)

NOTA: A proteína de ligação de interesse é selecionada como o domínio sensorial com base em critérios relevantes, incluindo (i) especificidade, (ii) afinidade, (iii) informação estrutural e (iv) rearranjo de conformação após a ligação do ligante. A especificidade garante que o biossensor responda seletivamente à molécula alvo sem reatividade cruzada. Considera-se que a afinidade está alinhada com a faixa de concentração esperada da molécula-alvo no contexto biológico. As informações estruturais, derivadas de dados experimentais ou modelos computacionais, como os gerados pelo AlphaFold, fornecem insights sobre a organização tridimensional do domínio sensorial e as mudanças conformacionais induzidas pelo ligante. Esses insights são usados para identificar pontos de inserção adequados para os fluoróforos. Uma estratégia de validação é então desenvolvida para avaliar a capacidade de resposta e a faixa dinâmica do biossensor, dependendo das aplicações pretendidas.

1. Construa o design Matryoshka in silico inserindo o Green-Apple Matryoshka¹² no domínio sensorial de tal forma que a Proteína Fluorescente Verde circularmente permutada (cpGFP), que é sensível a mudanças conformacionais, responda aos rearranjos induzidos pela ligação do ligante do domínio sensorial.
   1. Use um software de visualização molecular, como o Chimera, para analisar a estrutura do domínio de ligação. Se a estrutura tridimensional não estiver disponível, use o AlphaFold para gerar um modelo confiável.
   2. Identifique alças flexíveis dentro da estrutura da proteína como pontos fracos e possíveis locais de inserção para o de fluoróforo duplo, escolhido para evitar interromper a função ou estabilidade geral da proteína.
   3. Use o AlphaFold novamente para prever a estrutura da proteína quimérica contendo o dual-FP inserido, confirmando que a inserção não introduz mudanças estruturais desfavoráveis.
   4. Clone as construções do biossensor em DNA de plasmídeo que permite a expressão em células de levedura. Especificamente, insira o gene que codifica o biossensor recém-projetado no vetor de transporte de levedura pAG416, que contém elementos apropriados para a expressão de leveduras, usando uma técnica de clonagem adequada 12,13,14.
   5. Após a clonagem, transformar o plasmídeo recombinante em células bacterianas para amplificação do DNA do plasmídeo. Use DNA de plasmídeo purificado para transformação de leveduras.
   6. Introduzir o plasmídeo purificado nas células de levedura através da transformação mediada pelo polietilenoglicol (PEG), conforme publicado¹⁶. Células de levedura transformadas em placa em meio deficiente em uracila, que seleciona clones positivos contendo o plasmídeo que carrega o marcador de seleção URA3.

2. Preparação da amostra

1. Listre transformantes de levedura expressando biossensores GA-Matryoshka em placas de meio seletivo (ou seja, SC-Ura) e incube a 30 ° C por 2-3 dias para permitir o crescimento da colônia.
   NOTA: A cepa de levedura carrega uma auxotrofia ura3, que é complementada pelo gene URA3 no plasmídeo, permitindo a seleção em meios deficientes em uracila. O plasmídeo que codifica o biossensor inclui um que complementa a auxotrofia (por exemplo, pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
2. Gerar transformantes de levedura a partir da cepa K601/W303-1A MAT-a (genótipo: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). Realize a transformação com um vetor de expressão comumente usado para Saccharomyces cerevisiae, como pAG416¹².
3. Após a transformação, cultivar células de levedura a 30 °C em meio SC-Ura, preparado por litro da seguinte forma, até que apareçam colônias transformadas independentemente: 0,77 g CSM-Ura, 6,7 g de Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) com sulfato de amônio, 20 g de glicose, 20 g de ágar e adenina adicionados a uma concentração final de 150 μM.
4. Prepare células de levedura competentes e realize a transformação mediada por PEG 3350 de acordo com um protocolo estabelecido¹⁶.
5. Para experimentos de captura de células microfluídicas, coloque 25% de estoques de glicerol em placas SC-Ura e incube a 30 ° C por 2 dias para permitir o crescimento de colônias únicas independentes. Ressuspenda colônias individuais em 5 mL de meio SC-Ura líquido e incube a 30 ° C com agitação até que o OD600 atinja 0,5-1,0, tornando-as adequadas para carregamento no sistema de perfusão.

3. Preparo do sistema de perfusão (Figura 2)

1. Prepare a placa microfluídica para células de levedura haplóides, carregando-a com 50 μL de células de levedura expressando biossensores GA-Matryoshka, juntamente com meio SC-Ura final para crescimento e solução tamponada para tratamentos (por exemplo, NaCl ou sorbitol).
   1. Remova a solução de armazenamento dos poços 1-8. Aspire a solução salina tamponada com fosfato (PBS) dos poços e adicione 400 μL de água estéril.
   2. Lave os poços 1-6 e 8. Lavagem 1: Aspire a solução de água estéril dos poços 1-8 e adicione 400 μL de água estéril. Lavagem 2: Repita a lavagem aspirando e adicionando 400 μL de água estéril. Lavagem 3: Repita mais uma vez com 400 μL de água estéril.
   3. Enchimento final para poços 1-6: Aspire a solução aquosa e adicione 300μL de soluções finais de perfusão/crescimento, como SC-Ura para crescimento de leveduras, ou uma solução tamponada contendo os analitos de interesse para tratamento.
   4. Carga celular no poço 8: Adicione 50 μL de suspensão de células de levedura (OD600 = 0,5-1,0).
2. Sele as placas com o coletor de temperatura controlada da plataforma microfluídica e conecte-o ao sistema de imagem de células vivas. Os coletores mantêm um ambiente térmico estável a uma temperatura de 28 °C, enquanto a tubulação e uma bomba garantem a vedação adequada e a perfusão contínua.
   1. Alinhe a placa no coletor. Ligue o aspirador. Ligue a plataforma microfluídica.
   2. Pressione Seal e espere até que a luz verde acenda. Abra o software da plataforma microfluídica, crie um novo experimento e selecione a placa de levedura apropriada na lista suspensa.
   3. Clique no botão Executar sequência de escorva líquida . Clique na Run Cell Loading Sequence para carregar as células de levedura do poço 8 na câmara de cultura, onde serão capturadas e cultivadas sob perfusão contínua de meio seletivo SC-Ura durante a noite a 10 kPa a 28 °C.
   4. Na guia Modo Manual, clique em Executar uma Sequência Personalizada ou use o Editor de Protocolo para definir parâmetros experimentais, como temperatura a 30 °C, vazão a 10 kPa, duração do passo (por exemplo, 10 min) e canais a serem abertos para perfusão.
3. Cultivar as células durante a noite na câmara de cultura sob perfusão contínua com meio seletivo SC-Ura a 28 °C e uma pressão de 10-17 kPa.

4. Imagem de fluorescência raciométrica (Figura 3, Figura 4 e Vídeo 1)

1. Avalie o crescimento celular e a fluorescência por meio de uma visualização microscópica rápida.
   1. Coloque a placa microfluídica no palco de um microscópio invertido. Concentre-se no centro da área de visualização para localizar as células.
   2. Use microscopia de campo claro e/ou fluorescência para avaliar a morfologia celular, a viabilidade e a expressão do biossensor.
2. Investigue a dinâmica do estado estacionário do cálcio sob condições controladas com precisão usando o sistema microfluídico e placas microfluídicas compatíveis 4,12,13,14.
3. Realize imagens de células vivas usando um microscópio confocal de varredura a laser invertido com ampliação de 100x e uma abertura numérica (NA) de 1,40. Monitore os biossensores de fluoróforo duplo excitando GFP e LSSmApple a 488 nm usando um laser de argônio. Colete sinais de emissão a 520 nm para GFP e 610 nm para LSSmApple (Figura 5) e conduza experimentos de imagem de fluorescência raciométrica para quantificar as respostas dinâmicas do biossensor. Meça a proporção de intensidades de emissão (GFP/LSSmApple) ao longo do tempo para monitorar as alterações induzidas pelo analito.

5. Análise de imagem usando software de código aberto (Figura 6)

1. Obtenha o CellProfiler ou qualquer outro software semelhante do repositório oficial e instale-o em uma estação de trabalho local.
2. Organize as imagens de microscopia de fluorescência de lapso de tempo em ordem sequencial (por exemplo, img_001.tif, img_002.tif, etc.) para garantir a compatibilidade com o processamento automatizado em lote.
3. Inicie o software e inicialize um novo pipeline de análise selecionando Novo Projeto. Importe a sequência de imagens de lapso de tempo para o workspace do pipeline.
4. Incorpore o módulo IdentifyPrimaryObjects para detectar células individuais dentro de cada quadro com base no sinal de fluorescência ou em critérios morfológicos.
5. Adicione o módulo TrackObjects para estabelecer correspondências temporais entre células entre quadros, permitindo o rastreamento de uma única célula ao longo do tempo.
6. Inclua o módulo MeasureObjectIntensity para quantificar os parâmetros de intensidade de fluorescência (por exemplo, média, mediana e intensidade integrada) para cada célula rastreada.
7. Use o módulo ExportToSpreadsheet para compilar e exportar dados quantitativos em um formato tabular (por exemplo, CSV) para análise downstream.
8. Analise os dados exportados usando ferramentas estatísticas ou de visualização de dados, como software de planilha.

Resultados

Para obter imagens raciométricas bem-sucedidas de biossensores em sistemas microbianos, vários desafios técnicos devem ser abordados.

Sistema de expressão: O primeiro desafio está na seleção do sistema de expressão; seja baseado em plasmídeo, cromossomicamente integrado, impulsionado por promotores constitutivos ou induzíveis e com ou sem tags de direcionamento subcelular. Esses fatores podem afetar significativamente a estabilidade, toxicidade e localização do biossensor dentro das células (<...

Discussão

Biossensores baseados em fluoróforos geneticamente codificados permitem o monitoramento em tempo real das concentrações de analitos intracelulares em células vivas¹. Esses biossensores normalmente funcionam convertendo mudanças conformacionais em sinais ópticos, que podem ser detectados raciometricamente ou intensiometricamente. Os biossensores intensiométricos dependem de mudanças de intensidade de fluorescência de um único FP, tornando-os sensíveis a variações n...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agar	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
CellASIC ONIX placa para células de levedura haplóides	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-glicose	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	Para a expressão do GA-MatryoshCaMP6s em levedura
TCS SP8 STED	Leica	NA
Levedura cepa K601 / W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-Fator de acasalamento sal de acetato	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG