Artigo de método

Usando o método de transferência de gotículas para preparar de forma confiável vesículas unilamelares gigantes

DOI:

10.3791/68340

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19 de setembro de 2025

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

Neste artigo

Resumo

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Este guia para iniciantes apresenta um protocolo geral para a preparação de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) por meio do método de transferência de gotículas, discutindo as etapas críticas e fornecendo insights para ajudar a possíveis ajustes necessários para diferentes aplicações, incluindo biologia sintética e microrrobótica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nas últimas duas décadas, o método de transferência de gotículas, também conhecido como emulsão invertida, emulsão dupla, transferência de fase ou transferência de emulsão, provou ser vantajoso para a preparação de Vesículas Unilamelares Gigantes (GUVs) e, particularmente, para carregá-las com diferentes cargas, desempenhando assim um papel crucial na biologia sintética. Devido à eficiência do encapsulamento e à simplicidade de execução, tem sido amplamente utilizado para o desenvolvimento de células artificiais. Observa-se na literatura uma grande variabilidade em vários parâmetros, o que leva a desfechos extremamente variáveis. Isso se deve em parte aos ajustes necessários para diferentes necessidades e aplicações desse método versátil, mas pode ser desorientador para os pesquisadores que abordam essa técnica pela primeira vez.

Para fornecer aos iniciantes uma compreensão básica do método e do papel dos parâmetros críticos, um protocolo é apresentado juntamente com dicas sobre os princípios físico-químicos fundamentais subjacentes à formação de GUV por meio da transferência de gotículas. Este guia passo a passo para a preparação de GUVs inclui, portanto, considerações e sugestões práticas baseadas na literatura e na experiência direta.

Considerando possíveis fontes de variabilidade, alguns aspectos são identificados como críticos: a sensibilidade dos fosfolipídios à luz, oxidação e hidrólise; a escolha do óleo para dissolver os fosfolipídios (a solução lipídica ou LS); e a recuperação de GUVs após centrifugação. Medidas econômicas são propostas para minimizar a interferência do oxigênio e da umidade atmosférica. Para ajudar a identificar combinações adequadas de óleo e fosfolipídios, o protocolo geral é complementado com uma discussão sobre as propriedades físico-químicas relevantes do LS. Finalmente, para evitar procedimentos impraticáveis, um método simples e seguro é proposto para remover completamente a fase oleosa de uma só vez e recuperar uma dispersão GUV limpa. Essas medidas aceleram a implementação de ajustes nas novas composições de GUV, potencialmente ampliando sua adoção em biologia sintética e campos vizinhos, incluindo microrrobótica.

Introdução

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Implementando uma técnica previamente descrita para a produção de lipossomas1, Pautot et al. estabeleceram um protocolo para a produção de vesículas lipídicas com diâmetros variando de 0,1 a 1 μm de diâmetro2. O método de transferência de gotículas tem se mostrado rapidamente eficaz na produção de vesículas ainda maiores (diâmetros superiores a 1 μm)3, ganhando cada vez mais popularidade pela simplicidade de execução e pela alta eficiência de encapsulamento. De fato, em comparação com os métodos de inchaço (como inchaço em gel ou eletroformação), este protocolo reduz o volume de solução de carga necessária para formar um número comparável de vesículas e os resíduos associados4. Os GUVs podem ser montados a partir de interfaces de fluidos por meio de métodos alternativos com eficiência de encapsulamento comparável. No entanto, quando comparada àquelas baseadas em chips microfluídicos 5,6 ou encapsulamento contínuo de cruzamento de interface de gotículas (cDICE)7, a transferência de gotículas oferece a configuração mais simples acessível em qualquer laboratório com equipamento básico. Além disso, os métodos microfluídicos podem levar a GUVs com inclusões de óleo indesejadas na membrana. Por essas razões, a transferência de gotículas tem sido o método de escolha para carregar GUVs com cargas valiosas nos campos de células artificiais 3,8,9,10 e, recentemente, microrrobótica 11,12.

O método baseia-se na formação de folíolos de membranas através da estabilização de interfaces água/óleo mediadas por fosfolipídios. Primeiro, os fosfolipídios são dissolvidos em um óleo (solução lipídica, LS), depois uma emulsão de água em óleo é preparada com a solução aquosa contendo a carga GUV desejada (solução interna, IS) no LS oleoso. A emulsão é então transferida para um tubo onde outra solução aquosa (chamada solução externa, OS) foi previamente equilibrada com LS para formar uma interface água-óleo. Os GUVs são formados quando as gotículas de água são forçadas a atravessar essa interface OS / LS por centrifugação: o folheto interno dos GUVs é formado na superfície das gotículas IS, enquanto o folheto externo é formado entre OS e LS (Figura 1).

Muitas variantes de protocolo foram descritas com parâmetros ajustados de acordo com as necessidades experimentais contingentes. Uma primeira tentativa extensa de otimizar o processo foi descrita por Moga et al.13, enquanto Zhang et al. reuniram a maioria dos exemplos relevantes em uma revisãorecente14. Apesar dos muitos parâmetros descritos que influenciam o protocolo, não há indicação de como um processo de otimização poderia ser conduzido para uma nova formulação de GUV, nem as melhores práticas para recuperação e manipulação de GUV após a produção. Com base na literatura científica disponível e em nossa experiência direta, fornecemos aqui um protocolo geral para produzir GUVs enquanto discutimos os princípios básicos. Ao fazer isso, fornecemos indicações úteis para a otimização de novas formulações de GUV e duas precauções sempre aplicáveis ao protocolo: a preparação de LS em um ambiente controlado e um método para remover facilmente a fase oleosa superior para a recuperação de uma amostra GUV limpa. Escolhemos dois exemplos: um com sacarose 240 mM como IS e DOPC 0,2 mM em óleo de silicone AR20 como LS (condição E [vazio], ver Tabela 1) e outro composto por micropartículas de poliestireno a 0,2% de 1,1 μm em sacarose 240 mM como IS e DOPC de 3,18 mM em óleo mineral como LS (condição P [com partículas], ver Tabela 1). Ambas as amostras foram produzidas com 240 mM de glicose como OS. Escolhemos essa osmolaridade para obter GUVs que, em condições fisiológicas, possuem uma membrana lipídica relaxada (baixa tensão de membrana).

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Figura 1: Representação esquemática do método de transferência de gotículas. (A) Três soluções são preparadas em frascos separados: fosfolipídios em óleo (fase amarela) para formar uma solução lipídica, uma solução contendo sacarose (em ciano) como solução interna e uma solução de glicose equiosmolar (branca) como solução externa. (B) LS é então misturado com o IS para formar uma emulsão estável, então (C) uma interface entre OS e LS é permitida para equilibrar antes (D) a emulsão é derramada em cima dela. (E) As gotículas de água são forçadas a atravessar a interface LS / OS por força centrífuga para (F) permitir a formação de GUVs. A figura não está em escala e destina-se a fornecer apenas um esquema do método. Abreviaturas: LS = solução lipídica; IS = solução interna; OS = solução externa; GUV = vesícula unilamelar gigante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

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NOTA: Salvo indicação em contrário, os processos são realizados à temperatura ambiente.

1. Preparação das soluções

  1. Preparação de soluções aquosas (IS e OS)
    1. Em dois barcos de pesagem diferentes, pesar 2,16 g de glicose e a quantidade de sacarose especificada na Tabela 1. Adicione os pós a dois copos de 150 mL, adicione 40 mL de água ultrapura e misture mexendo.
    2. Transfira as soluções para dois cilindros de 50 mL e adicione água ultrapura até 50 mL para obter soluções de glicose 240 mM e soluções de sacarose com concentrações indicadas na Tabela 1. Cubra os cilindros com um pedaço de parafilme e misture as soluções invertendo os cilindros algumas vezes.
    3. Filtre as soluções com seringas de 50 mL e filtros de 0,22 μm para evitar a contaminação por microrganismos.
    4. Para a condição P, prepare a seguinte mistura: 2 μL de dispersão de partículas de poliestireno a 100 mg / mL a 1,1 μm, 24 μL de solução de sacarose preparada na etapa 1.1.1 e água ultrapura até 100 μL (suspensão final: micropartículas a 0,2% em solução de sacarose a 240 mM). Armazene as soluções a +4 °C por até 1 semana ou prepare alíquotas de 1 mL em tubos de 1,5 mL e armazene a -20 °C para armazenamento de longo prazo.
  2. Configurando uma câmara de luva para preparar LS em um ambiente controlado
    1. Corte cinco pedaços de tubo de silício com diâmetro interno de 7 mm, diâmetro externo de 13 mm e os comprimentos indicados na Tabela 2 (tubos 1 a 5).
    2. Corte quatro pedaços de tubo de silício com diâmetro interno de 3 mm, diâmetro externo de 7 mm e os comprimentos indicados na Tabela 2 (tubos 6 a 9).
    3. Conecte uma extremidade do tubo 1 a uma válvula de duas vias e a outra extremidade a uma junção de três vias (Figura 2A).
    4. Conecte o tubo 2 às outras extremidades da válvula de duas vias e, em seguida, conecte o tubo 3 e o tubo 4 à junção de três vias, com o tubo 3 conectado à extremidade oposta ao tubo 1 (Figura 2A).
    5. Conecte a extremidade livre do tubo 4 à entrada da câmara das luvas (tubo de entrada, Figura 2B).
    6. Conecte a válvula de três vias fornecida com a câmara da luva à saída e, em seguida, conecte a válvula ao tubo 5 (tubo de saída, Figura 2C).
    7. Conecte uma extremidade do tubo 6 a uma agulha de 18 G e a outra extremidade a uma junção bidirecional. Repita isso com o tubo 7 e a agulha 21 G (Figura 2D).
    8. Insira as duas agulhas em uma tampa de frasco com septo: esta tampa com agulhas permitirá a entrada controlada de nitrogênio e saída de nitrogênio e clorofórmio. Guarde a tampa em um tubo vazio de 50 mL sem tampa para evitar o contato com as agulhas (Figura 2D).
    9. Aperte e insira os tubos 8 e 9, respectivamente, nas aberturas de entrada e saída do lado interno da câmara das luvas (Figura 2E).
  3. Preparação de LS
    1. Mova o compartimento da luva dentro ou ao lado de uma capa química. Abra a câmara da luva e insira um cristalizador cheio de partículas de sílica na parte inferior da câmara (Figura 2F). Cubra o cristalizador com a superfície de suporte branca e cubra-o com papel toalha.
    2. Insira todos os materiais necessários na câmara das luvas (Figura 2G): um higrômetro, a 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) em solução de clorofórmio, o(s) óleo(s) (Tabela 1), frascos de vidro escuro limpos de 20 mL (abertos e com as respectivas tampas), uma seringa Hamilton (Tabela 1), uma micropipeta P10000 e pontas. Coloque o frasco de vidro contendo a solução de clorofórmio em um suporte de anel de cortiça, um copo de 150 mL ou qualquer outro suporte adequado o mais próximo possível do lado do operador.
      NOTA: Esta precaução evitará que as garrafas se inclinem devido à inflação e deflação das luvas durante os ciclos de vácuo e fluxo de nitrogênio.
    3. Feche o porta-luvas, certificando-se de que as duas metades não possam deslizar, e sele-as com os parafusos de plástico fornecidos com o porta-luvas.
    4. Feche a válvula de saída e mergulhe o tubo 5 em um béquer de 500 mL cheio até a metade com água (Figura 2H).
    5. Conecte a extremidade regulada por válvula do tubo de entrada (tubo 2) à linha de vácuo e a outra extremidade ao nitrogênio (tubo 3, Figura 2A). A câmara da luva agora está completamente ajustada conforme mostrado na Figura 2J.
    6. Abra a válvula e a linha de vácuo até que a despressurização infle as luvas a ponto de ficarem rígidas demais para dobrar. Feche a linha de vácuo e a válvula.
    7. Abra o nitrogênio até que a pressão esvazie as luvas a ponto de saírem do porta-luvas. Feche a linha de nitrogênio.
    8. Repita as etapas 1.3.6 a 1.3.7 pelo menos 10x, certificando-se de que a umidade interna caia abaixo de 40%.
    9. Controle a pressão interna com vácuo e nitrogênio para facilitar o uso de luvas pelo operador.
    10. Usando a seringa Hamilton, transfira o volume de DOPC na solução de clorofórmio indicado na Tabela 1 para um frasco de vidro escuro. Feche o frasco para injetáveis com a tampa com agulhas preparada no passo 1.2.9.
    11. Conecte o tubo 6 ao tubo 8 e o tubo 7 ao tubo 9 através das junções bidirecionais (Figura 2I).
    12. Remova as luvas e abra a válvula de saída.
      NOTA: Um segundo operador pode ajudar nas etapas 1.3.13 a 1.3.15 para acelerar o processo.
    13. Abrir o fluxo de azoto muito lentamente e verificar o fluxo de gás observando bolhas no copo onde o tubo 5 foi colocado anteriormente (passo 1.3.4). Ajuste gradualmente o fluxo de nitrogênio até atingir uma taxa relativamente alta na qual as bolhas individuais permanecem observáveis. Deixe o nitrogênio fluir por 3 min e, em seguida, feche a linha de nitrogênio.
      NOTA: A pressão excessiva de nitrogênio pode fazer com que a solução DOPC em clorofórmio se disperse por todo o frasco, diminuindo a quantidade de fosfolipídio disponível para a solução lipídica subsequente (LS). Além disso, a alta pressão aumenta o risco de as agulhas serem expelidas do frasco. Portanto, é essencial ajustar cuidadosamente o fluxo de nitrogênio para um nível ideal que agite suavemente o clorofórmio sem causar respingos descontrolados.
    14. Enquanto isso, prepare um banho-maria em um cristalizador e aqueça-o a 80 ° C em uma placa quente.
    15. Aguarde até que a última bolha esteja no béquer e feche a válvula de saída. Use as luvas novamente e desconecte os tubos 8 e 9 das junções bidirecionais.
    16. Verifique se todo o clorofórmio evaporou do frasco escuro, abra-o e mova a tampa de volta para o tubo de 50 mL. Abra o frasco de óleo, transfira o volume necessário de óleo (Tabela 1) para o frasco escuro e feche-o com a tampa. Retire as luvas e abra o compartimento das luvas.
    17. Sele o LS com parafilme. Vortex o frasco vigorosamente por pelo menos 30 s. Incubar a 80 °C durante 30 min no banho-maria preparado no passo 1.3.14. Vortex o frasco vigorosamente por pelo menos 30 s. Incube em temperatura ambiente durante a noite.
    18. Prossiga com a preparação de GUVs ou armazene-os a +4 °C por até 1 semana.
      NOTA: Em preparações GUV assimétricas, dois LS diferentes podem ser usados para a interface e emulsão para obter dois folhetos de membrana diferentes15.

2. Produção GUV

  1. Configurando um recipiente para facilitar a remoção de óleo
    1. Com uma tesoura, corte a tampa de um tubo de 5 mL. Faça um furo de ~8 mm no centro da tampa e verifique se o orifício é largo o suficiente para permitir que uma ponta P1000 se encaixe e trave (Figura 3A). Se o furo for muito estreito, repita as duas etapas anteriores; Se for muito largo, descarte a tampa e reinicie com uma nova a partir da etapa 2.1.1.
    2. Corte um pedaço de lixa de 2 x 5 cm e lixe o buraco. Coloque a tampa furada de volta no topo do tubo de 5 mL e centrifugue a 3.000 × g por 5 min para remover todos os detritos plásticos residuais do orifício. Remova a tampa e descarte o tubo.
    3. Corte a tampa de um novo tubo de 5 mL e substitua-o pela tampa furada. Coloque um O-ring na parte superior da tampa e insira uma ponta P1000 através do orifício. Trave o O-ring entre a ponta e a tampa e verifique se a ponta não pode ser empurrada mais para baixo no tubo (Figura 3B). Encha o tubo de 5 mL com 5,5 mL de OS através da ponta.
  2. Formação da interface OS/LS
    1. Preparar um banho-maria num cristalizador e aquecê-lo a 50 °C numa placa quente.
    2. Vortex o frasco para injetáveis LS preparado na secção 1.3, vigorosamente durante pelo menos 30 s. Aqueça o LS a 50 °C em banho-maria por 30 min.
    3. Equilibre as soluções aquosas preparadas na seção 1.1 à temperatura ambiente por pelo menos 10 min.
    4. Pipetar 300 μL de OS em um tubo de 1,5 mL ou um tubo de 5 mL modificado conforme a etapa 2.1. Pipetar lentamente 100 μL de LS sobre o OS, certificando-se de que duas fases distintas e contínuas são formadas no tubo. Deixe a interface se equilibrar por 10 min.
      NOTA: Para permitir a formação de uma monocamada homogênea de fosfolipídios, o LS deve ser distribuído homogeneamente no topo do OS ( Figura 4A ). Se a camada de LS não for contínua, redistribua o volume de LS com uma micropipeta ou aumente o volume de LS (isso pode ser muito útil com óleos altamente viscosos como a parafina).
  3. Formação de emulsão de água em óleo
    1. Em um tubo de 2 mL, pipete, nesta ordem, 250 μL de LS e 6,25 μL de IS para uma emulsão de 2,5% de água em óleo.
      NOTA: Em nossa experiência, essa proporção de água em óleo provavelmente fornece uma emulsão estável, aumentando assim a taxa de sucesso do protocolo (Figura 5). Para aumentar o rendimento do GUV, recomendamos aumentar o volume da emulsão em vez da relação IS/LS.
    2. Misture as duas fases usando um ou mais dos seguintes métodos até que a mistura pareça homogênea e estável: vórtice, agitação mecânica sobre um rack de microtubos padrão ou batida no tubo com um dedo (verifique a Figura 5 para exemplos de emulsão homogênea).
    3. Transferir 200 μL da emulsão para cima da interface OS/LS preparada no ponto 2.2.
    4. Se estiver usando um tubo de 1,5 mL, basta fechar o tubo; se estiver usando o tubo modificado de 5 mL da seção 2.1, coloque uma tampa de borracha no topo da ponta e transfira cuidadosamente o tubo para um tubo cônico de 50 mL.
  4. Transferência de gotículas por centrifugação
    1. Centrifugue os tubos à temperatura ambiente seguindo as indicações da Tabela 1. No final da centrifugação, verifique a presença de um pellet opaco no fundo do tubo e uma fase oleosa clara na parte superior.

3. Recuperação GUV

  1. Remoção de óleo
    NOTA: De acordo com as necessidades experimentais, o óleo pode ser removido em três etapas alternativas diferentes.
    1. Se os GUVs foram preparados em tubos padrão de 1,5 mL, remova lentamente o óleo com a ajuda de uma pipeta P1000 e um P200 para as últimas gotas, certificando-se de que o pellet não seja perturbado.
      NOTA: Pontas mais estreitas ajudam na remoção do óleo, portanto, inserir uma ponta para volumes menores (10-200 μL) em uma ponta P1000 melhorará a precisão desta etapa.
    2. Se estiver lidando com várias preparações de GUV em diferentes tubos de 1,5 mL, remova o óleo com a ajuda de um frasco Büchner. Conecte um pedaço de um tubo de silicone grosso (diâmetro interno de 7 mm, externo de 13 mm) à linha de vácuo e insira outro tubo na abertura do frasco, selando-o com uma junta de borracha. Na outra extremidade deste tubo, insira uma ponta P1000, envolva-a com parafilme, corte cerca de 3 mm da ponta e insira-a em uma ponta P200. Abra o vácuo e aspire o óleo com a ponta P200, depois feche o vácuo e remova as últimas gotas através de uma pipeta P200.
    3. Se os GUVs foram preparados no recipiente detalhado na etapa 2.1, remova a ponta do tubo, garantindo que a tampa de borracha não se solte (Figura 3D). Em seguida, descarte a ponta e guarde a tampa de borracha, o O-ring e a tampa furada para reutilização.
    4. Com o auxílio de uma micropipeta P1000, retirar o OS do tubo (Figura 3E), deixando cerca de 50 μL do volume, certificando-se de que o pellet não seja perturbado.
    5. Troque a ponta, ressuspenda o pellet no volume restante e transfira-o para um tubo limpo de 2 mL.
  2. Lavagens GUV
    NOTA: O objetivo dessas etapas é remover vestígios da fase oleosa que não foram removidos na etapa 3.1. Se necessário, os passos 3.2.1 e 3.2.2 devem ser repetidos até que nenhuma gota de óleo seja observada no tubo.
    1. Encha o tubo com 2 mL de OS e centrifugue a 1.500 × g por 5 min em temperatura ambiente.
    2. Remova o OS, deixando cerca de 50 μL do volume, certificando-se de que o pellet não seja perturbado.
    3. Repita as duas últimas etapas.
  3. Equilíbrio de volume
    NOTA: Incluímos esta seção para permitir uma comparação dos rendimentos entre diferentes preparações GUV.
    1. Com uma micropipeta P200, ressuspenda o pellet nos 50 μl do volume restante da última repetição da etapa 3.2.2.
    2. Meça esse volume ajustando a pipeta para 20 e aumentando o volume com a ponteira mergulhada na dispersão GUV sem tocar na parede do tubo para permitir que o líquido flua dentro da ponteira.
    3. Adicione OS para atingir o volume final de 100 μL.

4. Observação e análise dimensional

  1. Aquisição de imagens microscópicas
    1. Misture a dispersão GUV suavemente batendo no tubo com um dedo.
    2. Carregue uma câmara de Burker com 10 μL da amostra GUV e aguarde pelo menos 5 minutos para permitir que os GUVs sedimentem no fundo da câmara.
    3. Observar a amostra ao microscópio de contraste de fase. Usando as linhas de Burker como referências, mova-se pela amostra e adquira pelo menos 20 imagens, certificando-se de que as áreas de observação não estejam sobrepostas.
  2. Análise dimensional
    1. Carregue as imagens no ImageJ.
    2. Para calcular o fator de conversão pixel/μm, escolha uma imagem mostrando um quadrado de 50 x 50 μm da câmara de Burker (consulte a folha de dados do fabricante para a identificação correta), selecione a ferramenta de seleção de linha reta , desenhe uma linha entre dois cantos consecutivos do quadrado e meça a linha clicando em Analisar | Medir. Repita 3x e calcule o valor médio.
    3. Defina o fator de conversão clicando em Analisar | Defina a escala. Insira o valor da etapa 4.2.2 na caixa Distância em pixels, em seguida, insira o valor 50 em Distância conhecida e μm em Unidade de comprimento.
    4. Clique em Analisar | Defina as medidas e selecione a caixa Área . Selecione a ferramenta de seleção oval , clique com o botão esquerdo do mouse e segure a tecla shift para sobrepor o círculo resultante ao redor de um GUV. Meça o diâmetro clicando em Analisar | Medir. Repita isso para cada GUV em todas as imagens.
    5. Na janela Resultados, clique em Arquivo | Salvar como... para exportar o arquivo csv da área do GUV e, em seguida, analise a distribuição de tamanho com o script disponível no GitHub16.
      NOTA: É possível pular a etapa 4.2.3 e executar o script especificando o fator de conversão de pixel/μm. Para calcular esse valor, divida o valor obtido na etapa 4.2.2 por 50.

Resultados

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Uma preparação ideal de GUV é caracterizada pela formação de uma fase oleosa clara e um pellet distinto ( Figura 4A ). Nos casos em que as gotículas de água não se convertem em GUVs, elas normalmente colapsam e deixam detritos fosfolipídicos na interface OS / LS ( Figura 4C ). Este efeito é provavelmente causado pela agregação de fosfolipídios e outras moléculas da fase oleosa, resultante do equilíbrio insuficiente de fosfolipídios na interface água/óleo. No entanto, apesar da ausência de um pellet visível ou da presença de detritos na interface, os GUVs ainda podem se formar, permitindo que o processo continue. Embora as etapas de lavagem não sejam totalmente eficazes na remoção de todos os detritos fosfolipídicos, elas ajudam significativamente na eliminação de gotículas de óleo, melhorando a qualidade geral da amostra (compare a Figura 6A e a Figura 6B).

O uso de LS antigo ou LS preparado em condições de alta umidade geralmente resulta em dispersões GUV reduzidas com menor rendimento e maior teor de agregados desordenados que são provavelmente formados por fosfolipídios e outras moléculas da fase oleosa (Figura 6C). Para LS preparado em condições de alta umidade, observamos coeficientes de variação acima de 0,8 na produção de GUV (com amostras contendo muito poucos GUVs), enquanto para LS preparado na câmara de luva modificada, o coeficiente de variação foi inferior a 0,5.

Diferentes condições de centrifugação podem afetar o rendimento e a qualidade do GUV. A partir de uma análise qualitativa, 20 min a 3.300 × g foi identificado como uma boa condição para GUVs carregados com sacarose (amostra E). A redução da velocidade (45 min a 500 × g) resultou em uma redução do rendimento, enquanto um aumento (5 min a 16.600 × g) levou a uma maior formação de agregados fosfolipídicos desordenados. Uma força centrífuga fraca pode impedir que muitas gotículas cruzem a interface OS / LS, daí o rendimento reduzido, enquanto uma força forte pode não fornecer tempo suficiente para a organização dos fosfolipídios no folheto externo durante o cruzamento da interface (Figura 7). O encapsulamento de micropartículas também pode ser otimizado com ajustes nos parâmetros de centrifugação, desde que a densidade de massa das micropartículas corresponda aproximadamente à do IS. Para isso, diminuir a aceleração de centrifugação (e, por sua vez, aumentar o tempo de centrifugação) permite uma encapsulação mais homogênea das partículas, evitando a quebra da membrana fosfolipídica devido à força exercida pelas partículas sólidas (um exemplo de boa encapsulação é mostrado na Figura 6D enquanto a investigação dos parâmetros ideais de centrifugação ainda está em andamento17).

Como a difusão de fosfolipídios pode ser afetada pela fase oleosa, um teste qualitativo simples pode ser executado para avaliar a estabilidade da emulsão (Figura 5). Com a ajuda de um corante corante (Brilliant Blue FCF) dissolvido no IS para melhorar a visualização, emulsões com diferentes proporções de água/óleo podem ser preparadas e observadas ao longo do tempo. A perda de estabilidade pode ser visualizada pela agregação de gotículas de água e a consequente separação da fase oleosa. Como gotículas grandes (visíveis a olho nu) têm menos probabilidade de serem convertidas em GUVs, recomendamos o uso da condição de emulsão que fornece a menor separação de fases.

O efeito das variações no protocolo pode ser verificado por meio de uma análise de distribuição de tamanho, conforme descrito na seção 4 do protocolo: os diâmetros dos GUVs podem ser medidos usando ImageJ a partir de imagens de microscópio de contraste de fase e a distribuição de tamanho pode ser analisada com um script disponível no GitHub16. Seguindo esse protocolo, foi possível, por exemplo, observar um aumento de GUVs com diâmetros maiores quando o óleo mineral é escolhido em vez do óleo de silicone AR20 (Figura 8).

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Figura 2: Configuração da câmara da luva. Esta figura mostra as principais modificações na câmara de luvas para a preparação da solução lipídica. (A) Conexão de entrada com nitrogênio e vácuo; (B) conexão de entrada com a câmara de luvas; (C) válvula de saída; (D) tampa com agulhas para evaporação do solvente; (E) tubos finos para evaporação de solventes; (F) partículas de sílica para absorver umidade; (G) itens a serem colocados na câmara das luvas: termo-higrômetro digital (1), solução lipídica em solvente orgânico (2), porta-anel de cortiça (3), seringa de vidro (4), tampa aberta com septo e agulhas (5), solução de óleo (6), frasco escuro aberto com tampa (7), ponteiras de 10 mL (8), pipeta P10000 (9); (H) extremidade do tubo de saída mergulhada em água; (I) frasco fechado com tampa com agulhas conectada à entrada e saída; (J) esquemas da câmara de luvas modificada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Recipiente para fácil remoção de óleo. Principais etapas na preparação de GUVs em um recipiente para facilitar a remoção do óleo de acordo com a seção 2.1 do protocolo. (A) Um orifício é feito em uma tampa de tubo de 5 mL para permitir que uma ponta P1000 se encaixe; então (B) a tampa é colocada em um tubo vazio de 5 mL com a ponta inserida no orifício através de um O-ring. (C) As soluções são colocadas no tubo de acordo com as seções 2.2 e 2.3 do protocolo, a ponta é tampada e o tubo é colocado dentro de um tubo de 50 mL. GUVs preparados a partir de DOPC 0,2 mM em óleo de silicone foram carregados com sacarose 230,7 mM e 3,1 mM Brilliant Blue FCF para melhorar a visualização. (D) Após a centrifugação, a fase oleosa superior fica presa dentro da ponta junto com uma parte do tampão GUV (que aparece ciano devido a parte das gotículas não se converter em GUVs e liberar o corante no OS). Graças à tampa de borracha, a ponta pode ser facilmente removida do tubo de 5 mL junto com o conteúdo líquido, permitindo assim uma remoção rápida e fácil de toda a fase oleosa. (E) O pellet GUV pode ser facilmente coletado do fundo de um tubo em uma dispersão clara, sem contaminação aparente por óleo, conforme verificado (F) por microscopia de contraste de fase. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: LS = solução lipídica; IS = solução interna; OS = solução externa; GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Formação de GUV. Exemplos de (A) interface OS/LS, (B) um pellet GUV limpo com uma fase oleosa clara e (C) um pellet GUV com detritos na interface OS/LS (os detritos e o pellet parecem avermelhados porque o IS desta população GUV foi suplementado com 1,65 mM de corante New Coccine para melhorar a visualização). Abreviaturas: LS = solução lipídica; IS = solução interna; OS = solução externa; GUV = vesícula unilamelar gigante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Estabilidade da emulsão com diferentes proporções de óleo e água em óleo. A figura mostra a estabilidade das emulsões ao longo do tempo, dependendo do tipo de óleo e da relação água/óleo (a/o) utilizada. O IS foi composto por 230,7 mM de sacarose e 3,1 mM de Bright Blue FCF para melhorar a visualização das emulsões. As emulsões preparadas com óleo mineral são menos estáveis do que suas contrapartes feitas com óleo de silicone AR20. Este efeito é ainda mais amplificado com o aumento das proporções sem fio. Embora as emulsões no óleo de silicone AR20 sejam significativamente mais estáveis, sua estabilidade também diminui à medida que a relação a/o aumenta, com separação de fases visível imediatamente após a emulsificação (óleo de silicone AR20 a 10%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Observação de GUVs com um microscópio de contraste de fase. Uma ampliação de 20x de GUVs carregados com sacarose preparados a partir de um LS composto de 3,18 mM DOPC em óleo mineral. (A) Amostra recuperada após a remoção do óleo; (B) amostra recuperada após as etapas de lavagem; (C) baixo rendimento de GUV obtido de um LS preparado em ambientes com oxigênio e umidade não regulados; (D) GUVs carregados com micropartículas. Barra de escala = 10 μm; gotas de óleo são circuladas e exemplos de agregados desordenados de fosfolipídios e moléculas de óleo são indicados por uma seta. Abreviaturas: LS = solução lipídica; GUVs = vesículas unilamelares gigantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Efeito de diferentes condições de centrifugação na formação de GUV. Imagens de contraste de fase de GUVs carregados com sacarose preparados com um LS composto de 0,2 mM DOPC em óleo de silicone AR20. A figura mostra uma comparação qualitativa de GUVs em (A) 16.600 × g por 5 min, (B) 3.300 × g por 20 min e (C) 500 × g por 45 min. Enquanto a alta velocidade de centrifugação resulta em uma maior presença de agregados de fosfolipídios, a baixa velocidade de centrifugação leva à redução do rendimento. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: LS = solução lipídica; GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Análise da distribuição de tamanhos. Comparação de duas amostras de GUV carregadas com sacarose obtidas de (A) 0,2 mM DOPC em óleo mineral e (B) 0,2 mM DOPC em óleo de silicone AR20 (* a amostra foi diluída 10x para permitir uma distinção clara de GUVs sob um microscópio de contraste de fase). A análise realizada após a seção 4 do protocolo mostra uma distribuição de tamanho deslocada para diâmetros mais altos para a amostra de óleo mineral em relação às amostras de óleo de silicone AR20. No entanto, o rendimento da amostra de silicone é quase 20x maior. Abreviaturas: GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

PassoCondição ECondição PDescrição
1.1.14,11 gramas17.11 gramasMassa de sacarose
1.1.12,16 gramas2,16 gramasMassa de glicose
1.1.2240 mM1000 mMConcentração de sacarose
1.1.2240 mM240 mMConcentração de glicose
1.3.2Óleo de siliconeÓleo mineralFase oleosa para LS
1.3.2Seringa de vidro de 0,1 mLSeringa de vidro de 0,5 mLSeringa de vidro para transferência de DOPC em soluções de clorofórmio
1.3.1063 μL500 μLVolume de DOPC em solução de clorofórmio
1.3.1610 mL5 mlVolume de óleo
2.4.13300 g 20 minutos500 g 45 minutosCondição de centrifugação

Tabela 1: Variações no protocolo. A tabela relata variações para várias etapas do protocolo (indicadas na primeira coluna) para preparar duas populações GUV diferentes: GUVs carregadas com sacarose (condição E) e GUVs carregadas com micropartículas (condição P).

IDEtapas envolvidasDiâmetro interno (mm)Diâmetro externo (mm)Comprimento (mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Tabela 2: Tubos para conexões de gás e vácuo na câmara de luvas. A tabela lista as dimensões dos tubos de silicone usados para conectar a câmara das luvas às linhas de nitrogênio e vácuo. IDs de referência são fornecidas para facilitar o processo de montagem.

Discussão

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Os métodos para a produção de GUVs podem ser divididos em dois grupos principais: métodos baseados no inchamento de substratos por meio de hidratação e aqueles baseados na montagem de interfaces de fluidos. Os métodos do primeiro grupo são muito eficientes em fornecer grandes populações de GUV para caracterizações biofísicas de membranas lipídicas ou proteínas transmembranares. Em contraste, métodos como a transferência de gotículas são escolhidos principalmente para encapsulamento de carga devido ao consumo reduzido de cargas e maior eficiência de encapsulamento18.

Por esse motivo, uma infinidade de cargas diferentes foi encapsulada em GUVs, tornando a transferência de gotículas um processo de referência para células artificiais 3,8,9,10 e uma possível solução para a construção de novos microrrobôs biomiméticos 11,12. Para modular as propriedades físico-químicas das membranas GUV, diferentes moléculas podem ser incluídas, como fosfolipídios iônicos10, ácidos graxos19, polímeros como PEG20 ou colesterol21 (embora moléculas hidrofóbicas como o colesterol tenham alta afinidade pelo óleo, resultando em um menor controle da composição da membrana em relação aos métodos de inchaço22). O protocolo é versátil o suficiente para permitir essas modificações, mas algumas etapas têm um impacto maior do que outras.

Para discutir as criticidades do método, descrevemos aqui um protocolo para a preparação de duas populações diferentes de GUVs: uma preparação de GUVs contendo uma solução de sacarose e uma preparação de GUVs encapsulando micropartículas. As diferenças no protocolo estão detalhadas na Tabela 1 como condição E (vazia) e condição P (com partículas). Este método permite a formação de GUVs transferindo gotículas de água de uma fase oleosa para uma fase aquosa em um processo biestável impulsionado por fosfolipídios23 e influenciado pelas propriedades físico-químicas de todas as três fases envolvidas: IS, OS e LS.

Dentre os três, o LS é o mais sensível devido à suscetibilidade dos fosfolipídios à luz, oxidação e hidrólise 24,25,26. Por esse motivo, a etapa inicial de evaporação do solvente orgânico usado para armazenamento de longo prazo de fosfolipídios a -20 ° C (normalmente clorofórmio ou metanol) deve ser realizada em frascos âmbar sob fluxo de nitrogênio ou argônio. Se baixos níveis de umidade não forem garantidos no ambiente de laboratório, os fosfolipídios podem ser danificados13, 14, 27. Portanto, o LS deve ser preparado em um ambiente confinado, como um porta-luvas ou a câmara de luvas modificada de baixo custo descrita neste protocolo. Uma vez que o óleo é adicionado ao filme lipídico, o LS pode ser removido da câmara das luvas, e a dissolução completa dos fosfolipídios é realizada por vórtice e aquecimento da solução.

Embora alguns protocolos incluam sonicação nesta etapa13, aumentos localizados na temperatura podem levar a danos ainda não descritos para algumas formulações de LS. Por esse motivo, o aquecimento da solução em banho-maria pode proporcionar um processo mais bem controlado e homogêneo. Para reduzir ainda mais as chances de danificar o LS, este protocolo sugere o uso de duas temperaturas diferentes: uma vez que a dissolução de um LS recém-preparado requer maior energia do que um LS previamente dissolvido (devido a um empacotamento mais denso de moléculas de fosfolipídios no filme espalhado na superfície do frasco de vidro), 80 ° C é adotado para a primeira dissolução do filme lipídico e 50 ° C para simplesmente dissolver os fosfolipídios antes de seu uso. Como geralmente é observado um aumento na variabilidade de desempenho ao longo do tempo para 3,18 mM DOPC em óleo mineral (Figura 4C), o uso de LS dentro de uma semana é uma prática geralmente recomendada. No entanto, algumas combinações de óleo e fosfolipídios podem ter vida útil prolongada, e o uso de uma câmara de luvas também parece melhorar a estabilidade do LS ao longo do tempo.

A personalização das membranas GUV com combinações específicas de fosfolipídios pode exigir implementações personalizadas do protocolo. Para navegar entre todas as variações possíveis, pode-se obter orientação das propriedades físico-químicas do LS. As concentrações micelares críticas (CMC) e a difusividade dos fosfolipídios no LS são influenciadas pelas interações químicas com as moléculas em solução28. A formação de gotículas de água na emulsão IS/LS é, portanto, influenciada pela rapidez com que os fosfolipídios podem se difundir na fase oleosa e atingir as interfaces água/óleo para formar uma monocamada estável (o folheto interno da membrana). Diferenças na difusividade foram observadas para os dois óleos explorados neste protocolo, com o óleo de silicone AR20 proporcionando maior estabilidade da emulsão IS/LS (Figura 6). Como a emulsão mais estável para ambos os óleos foi observada quando a água foi dispersa em uma proporção de 2,5% (de acordo com observações anteriores no óleo mineral13), fixamos isso como uma proporção geralmente válida.

No entanto, como proporções mais altas podem fornecer recursos úteis (por exemplo, POPC em óleo mineral mostrou uma mudança para GUVsmaiores 13), recomendamos a execução de um teste qualitativo preliminar como o relatado na Figura 6 para obter informações sobre a estabilidade da emulsão e, portanto, a eficiência esperada do encapsulamento. Aqui, aconselhamos os leitores a não confiar em tempos precisos ou iterações de procedimentos para a formação da emulsão, pois a eficácia depende estritamente do operador ou do instrumento adotado. Em vez disso, fornecemos um ponto de verificação para ajudar o operador a entender quando a qualidade da emulsão é boa o suficiente para - pelo menos teoricamente - maximizar as chances de converter gotículas em GUVs. A difusividade dos fosfolipídios no óleo também influencia sua capacidade de se reorganizar durante a transferência de gotículas e formar o folheto externo da membrana GUV 2,7,18,29. Esta etapa é favorecida por um equilíbrio adequado da interface LS/OS. Embora o tempo de incubação adotado por este protocolo esteja de acordo com as recomendações gerais18, com medições de tensão interfacial de relatórios anteriores7 e nossos experimentos preliminares, GUVs preparados com diferentes LS podem se beneficiar de um tempo de incubação mais longo.

A formação do folheto externo também é influenciada pela velocidade das gotículas de água que atravessam a interface LS/OS, etapa ligada à densidade e viscosidade das três fases30. As diferenças de densidade devem sempre seguir a ordem: IS > OS > LS. Isso é essencial para permitir primeiro a sedimentação de gotículas de IS em direção à interface LS/OS, depois o cruzamento da interface para conversão em GUVs e sua sedimentação em direção ao fundo do tubo. Embora o processo possa ocorrer espontaneamente mesmo quando a água deionizada é usada como IS e OS23, uma diferença de densidade entre IS e OS foi introduzida para favorecer a formação de GUV31. O par mais comum para esse fim é a sacarose no IS e a glicose no OS: em concentrações equiosmolares necessárias para evitar danos aos GUVs formadores devido ao estresse osmótico, a sacarose fornece uma solução mais densa do que a glicose. Como a diferença de densidade aumenta com a osmolaridade dessas soluções, o rendimento dos GUVs varia de acordo, sem nenhuma melhoria adicional observada além de 600 mOsm13.

As condições ideais de centrifugação estão intimamente ligadas à densidade e viscosidade das três fases e à difusividade dos fosfolipídios. Na ausência de uma caracterização completa das três fases, várias condições devem ser rastreadas. A partir de testes qualitativos (Figura 4E e Figura 5) e análise sistemática preliminar17, foi possível definir boas condições de centrifugação para as duas amostras descritas neste protocolo; No entanto, a qualidade das amostras está aberta a melhorias se mais condições forem examinadas. Quando o equilíbrio entre a difusividade dos fosfolipídios no LS e a densidade e viscosidade das três fases não é mantido adequadamente, os fosfolipídios não têm tempo suficiente para se equilibrar na interface LS / OS e se reorganizar corretamente à medida que as gotículas de água se movem em direção ao OS. Isso geralmente leva à formação de um precipitado esbranquiçado na interface ou logo abaixo dela, provavelmente consistindo de fosfolipídios e outras moléculas da fase oleosa arrastadas por gotículas que não se reúnem em GUVs durante a centrifugação.

O encapsulamento de uma solução homogênea pode ser impulsionado pelo aumento da densidade do IS, preservando um equilíbrio osmótico com o OS (como para o par sacarose-glicose), mas o encapsulamento de uma dispersão de micropartículas requer que a densidade da fase aquosa corresponda à das micropartículas32. A eficiência do encapsulamento da carga também é afetada pela composição química da solução/dispersão da carga. Relatórios anteriores mostraram um efeito negativo no rendimento de GUV causado por muitos haletos de metais alcalinos33 ou variações de pH13, provavelmente devido a interações ou mudanças na carga líquida de cabeças hidrofílicas zwitteriônicas de fosfolipídios. Portanto, o encapsulamento de reações biológicas (como síntese enzimática ou de proteínas livres de células) geralmente requer um compromisso, pois as concentrações de pH e sal (como KCl ou NaCl) devem ser ajustadas a níveis abaixo do ideal para a própria reação. No entanto, mesmo misturas de reações complexas, como a síntese de proteínas livres de células, podem ser modificadas para fornecer células artificiais funcionais baseadas em GUV34.

Do ponto de vista prático, embora o método de transferência de gotículas ofereça um processo muito simples, a recuperação de GUVs do sistema operacional pode apresentar algumas limitações. Para ajudar a remover o óleo da fase superior após a etapa de centrifugação, é possível explorar duas pontas de pipeta para uma remoção mais fina (etapa do protocolo 3.1.1) ou um frasco de Buchner para remoção mais rápida quando várias amostras são preparadas (etapa do protocolo 3.1.2). No entanto, como o óleo não é completamente removido, é necessário realizar uma etapa de lavagem para obter uma dispersão GUV limpa (etapa 3.2 do protocolo). Embora as etapas de lavagem resultem na remoção efetiva de gotículas de óleo residual sem perda apreciável de GUVs (Figura 4A, B), essa passagem pode ser menos simples com óleo altamente viscoso e pode ser muito demorada quando várias formulações de GUV estão sendo preparadas. Um método alternativo foi descrito para contornar a remoção do óleo e recuperar o GUV do fundo do tubo através de um orifício perfurado com o auxílio de uma agulha35. Este processo, no entanto, pode não permitir uma recuperação completa do pellet GUV se o tubo não for perfurado na posição adequada e, além disso, for potencialmente prejudicial ao operador.

Para ajudar na recuperação do GUV, apresentamos aqui uma abordagem nova e simples para remover rapidamente a fase oleosa. Isso se baseia em prender a fase oleosa superior e menos densa em uma ponteira de pipeta tampada para que, após a centrifugação, a ponteira possa ser removida de forma que nenhum fluido escorra. Essa estratégia simples permite uma remoção rápida e fácil de toda a fase oleosa de uma só vez, simplificando consistentemente essa etapa demorada.

Para avaliar a eficiência do protocolo, alguns métodos foram implementados para a detecção automática de GUVs para acelerar a contagem e a análise da distribuição de tamanho. A marcação de GUVs com sondas fluorescentes fornece uma estratégia simples e eficaz aplicada à citometria de fluxo36,37 e à imagem microscópica combinada com algoritmos de detecção de círculo 13,37,38,39. Mais recentemente, ferramentas baseadas em IA para detecção de objetos estão sendo exploradas para melhorar esse processo40,41. No entanto, os corantes fluorescentes podem afetar potencialmente as propriedades do GUV, introduzindo artefatos na análise. Se excluir o sinal fluorescente detectável, a microscopia continua sendo a opção mais confiável, sendo a microscopia de contraste de fase o método preferido para visualização ideal18 e aplicação de algoritmos de detecção de círculo38.

Alternativamente, é possível explorar propriedades peculiares de formulações específicas para estratégias de detecção exclusivas. Hadorn et al., por exemplo, aproveitaram a presença de eletrólitos no SI para detectar GUVs com um contador de células baseado em impedância33. Quando nenhum desses métodos automatizados ou específicos da formulação é viável, a anotação manual do círculo continua sendo um fallback universalmente aplicável. Nesses casos, o ImageJ oferece uma ferramenta prática para acelerar o processo e extrair facilmente as medições do diâmetro bruto, conforme descrito neste protocolo.

Apesar da ampla adoção do método de transferência de gotículas, pouca atenção é dedicada aos processos de otimização necessários para novas formulações de GUV. Neste trabalho, reunimos as informações disponíveis na literatura para implementar um protocolo sistemático para orientar e simplificar essa otimização. Este guia prático considera os princípios subjacentes envolvidos na produção de novas formulações de GUV e na recuperação de uma amostra minimamente contaminada com óleo, um aspecto frequentemente negligenciado do protocolo13,14. Embora não seja possível prever a otimização que qualquer formulação de GUV exige, este guia fornece dicas e insights úteis para acelerar a implementação de novos GUVs, potencialmente levando a aplicações que incluem células artificiais e microrrobôs.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estes resultados fazem parte do projeto CELLOIDS (Cell-inspired particle-based intelligent microrobots) que recebeu financiamento do Conselho Europeu de Investigação (ERC) no âmbito do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (Grant agreement No. 948590). Este trabalho foi apoiado em parte pela Comissão Europeia através do projeto BRIEF NextGenerationEU. Agradecemos a Michele Ibrahimi pelo suporte técnico na montagem da câmara das luvas e pela discussão útil sobre a implementação do recipiente para a fácil remoção de óleo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ membrana de ésteres de celulose mista m filtros de seringaMerckSLGSVR255F
Tubos de 1,5 mLBioclasse06.0279.00
100 μ L seringa de vidroMerck20737
Copo de 150 mLAvantor 213-1123Pelo menos 3
Frascos de vidro escuro de 20 mL ND24Avantor 548-9001A
Tubos de 2 mLBioclasse07.3534.99
Cilindro de 50 mLAvantor 612-3843
500 μ L seringa de vidroHamilton549-1166
Tubo Falcon de 50 mLMerckCLS352070
Seringa de 50 mL Fisher Científico8SS50L1
Tubos de 5 mLGreiner bio-one622201
Copo de 600 mLAvantor 213-1126
Bü Chner FrascoMerckZ740682
Anéis de cortiça para frascos de fundo redondoAvantor 217-1000
CristalizadorDutscher080474A
D-(+)-GlicoseSigma-AldrichG8270
D-(+)-sacaroseSigma-AldrichS9378
Termo-higrômetro digitalBohlenderV1863-07
DOPCPesquisa Avanti850375C
BrocaDremel4000
Sal dissódico de erioglaucina (Azul Brilhante FCF)Sigma-Aldrich861146
Agulha de seringa G18TerumoAN1838R1
Agulha de seringa G21TerumoAN2138R1
Câmara de luvasBel-ArtRolamento F50030-0000Se disponível, um porta-luvas pode ser usado, mas em laboratórios com baixos níveis de umidade pode não ser necessário
Agitador magnético de placa quenteMaterial de laboratório LLG6.263 448
Óleo mineral leveSigma-Aldrich330779
Nova coccinaSigma-Aldrich199737
O-Ring de borracha nitrílica O-Ring O-Ring, furo de 8 mm, diâmetro externo de 12 mmRS196-4863
Tampas de rosca abertas com septo ND24Avantor 548-0031A
Micropipeta P1000Fisher Científico12346132
Micropipeta P10000Avantor 89079-978
Micropipeta P200Fisher Científico12326132
Toalhas de papelAvantor KIMB6657
ParafilmeAvantor 291-1214
Ponteiras de pipeta (1000)Eppendorf0030000919
Ponteiras de pipeta (10000)Eppendorf0030000765
Ponteiras de pipeta (200)Eppendorf0030000870
Partículas de poliestireno, 1,1 µ mSigma-AldrichLB11-1ML
Tampa de borrachaBioclasse S.r.l.12.2300.05
Junta cônica de borrachaAvantor 217-0211
Tampas de parafuso  ND24Avantor 548-0161A
Óleo de silicone AR20Sigma-Aldrich10836
Tubo de silicone (diâmetro interno 1,6 mm, diâmetro externo 3 mm)RS667-8441
Tubo de silicone (diâmetro interno 6 mm, diâmetro externo 12 mm)RS273-2541Pelo menos 6 m
Junção de três viasRS795-405
Junção bidirecionalRS419-7287
Válvula de duas viasClaber91280
Água ultrapuraThermo Fisher Scientific 22934Quando disponível, este produto pode ser substituído por água purificada através de sistemas Milli-Q
Tesoura UniversalBochem4154

Referências

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