A reconstrução tridimensional (3D) do dano cardíaco no infarto agudo do miocárdio reperfundido (repIAM) permite a quantificação fiel e a co-localização dos padrões associados que afetam a doença. Aqui, uma abordagem de imagem guiada por folha de luz automatizável é fornecida para medição contemporânea de danos cardíacos, área de risco e resposta de células imunes.
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Artigo de método
Análise 3D Simultânea de Dano Cardíaco e Resposta Imune em Infarto Agudo do Miocárdio Reperfundido Usando Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Interações celulares complexas determinam a remodelação funcional e estrutural do tecido durante o infarto agudo do miocárdio reperfundido (repAMI). Esses processos mostram distribuição espacial distinta à medida que o músculo cardíaco lesionado é segmentado em diferentes áreas (área de dano, área de risco (AAR) e área remota). A visualização tridimensional (3D) dessas áreas é essencial para a análise de várias interações entre as células cardíacas residentes e as células imunes infiltrantes, permitindo a identificação de possíveis alvos de tratamento. Aqui, um protocolo é descrito para visualização e quantificação 3D simultânea e automatizável da área de dano cardíaco, AAR e células imunes infiltrantes (por exemplo, neutrófilos) após repAMI. Isso inclui coloração mediada por anticorpos intravitais da área de dano cardíaco (CD31neg) e infiltração de neutrófilos (Ly6G+) após visualização ex vivo de AAR por perfusão retrógrada de anticorpos e limpeza adicional de tecido não tóxico para imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM). Essa técnica permite a análise espacial de células-alvo, por exemplo, infiltrando células imunes e áreas danificadas em um coração de camundongo intacto após repAMI. A histologia e a imuno-histoquímica tradicionais podem ser realizadas após a limpeza do tecido não tóxico e a aquisição de imagens com pós-processamento assistido por computador. Isso permite o ganho de informações de multiplexação dentro do mesmo coração de camundongo, fortalecendo a robustez dos dados e sendo especialmente significativo em uma lesão altamente complexa como o repAMI.
Introdução
A lesão tecidual no infarto agudo do miocárdio reperfundido (IAMrep) é o principal fator determinante para o remodelamento cardíaco e desenvolvimento de insuficiência cardíaca1. Múltiplos mediadores locais e células cardíacas residentes, mas também células imunes infiltrantes, afetam sua expansão em uma interaçãocomplexa 2,3. Compreender a organização espacial desses processos é essencial para obter conhecimento profundo para a identificação de novos alvos terapêuticos para limitar a lesão tecidual após o IAM repIAM e melhorar a função cardíaca.
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pela agência governamental local responsável (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) e cumpriram todos os regulamentos éticos relevantes para testes e pesquisas em animais. Os experimentos foram realizados com camundongos C57BL/6J machos (9-30 semanas de idade). Os animais foram alojados e utilizados em condições específicas livres de patógenos (FPS) no biotério local no ciclo diurno e noturno de 12 h/12 h.
NOTA: Todas as intervenções cirúrgicas foram realizadas sob indução intraperitoneal de aneste....
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Resultados
A abordagem apresentada usando microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) permite a análise simultânea de AAR, lesão endotelial e infiltração de neutrófilos após repAMI. A Figura 1A ilustra a coloração intravital e ex vivo de camundongos C57BL / 6J 24 h após a indução de repAMI. Anticorpos para coloração de lesão endotelial cardíaca (anti-CD31 marcado com AlexaFluor 790) e infiltração de neutrófilos (anti-Ly6G marcado com AlexaFluor 647) foram injetados por via intravenosa .......
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Discussão
Existem várias entidades de imagem para detectar lesão tecidual cardíaca durante o repIAM em camundongos. Essas técnicas oferecem vantagens diferentes, mas também apresentam limitações. A coloração da diminuição da atividade metabólica das células cardíacas usando TTC é o método mais comumente usado para quantificação da lesão cardíaca de I/R e pode ser combinada com a coloração azul de Evan para a distinção de AAR 13,14,15........
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Divulgações
Elias Haj-Yehia relata honorários pessoais e outros da AstraZeneca, que estão fora do trabalho submetido. Simon F. Merz e Lea Bornemann são atualmente empregados pela Miltenyi Biotec BV & Co. KG. Matthias Totzeck e Tienush Rassaf relatam honorários pessoais, e outros da Edwards e Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo e Astra Zeneca, que estão fora do trabalho submetido. Tienush Rassaf e Ulrike B. Hendgen-Cotta cofundaram a Bimyo, uma empresa com foco no desenvolvimento de peptídeos cardioprotetores. Matthias Gunzer recebeu financiamento geral de pesquisa da Miltenyi BioTec BV & Co. KG. Todos os demais autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: Fundação Alemã de Pesquisa (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) e Sociedade Cardíaca Alemã (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Parte desse trabalho foi realizado no Imaging Center Essen (IMCES), uma instalação central de serviços da Faculdade de Medicina da Universidade de Duisburg-Essen, Alemanha. Agradecemos à equipe do IMCES por seu suporte técnico contínuo e pelo uso de seus instrumentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulha de 27 g | Becton Dickinson | 305889 | BD Eclipse |
| Processamento de imagem 3D e software de análise | Plano de bits | Vers. 10.1.0 | Imaris |
| Sutura 5-0 | Serag-Wiessner | IC108000 | Seda |
| 6-0 sutura | Ética | EH7814 | Prolene |
| Kit de rotulagem de anticorpos AlexaFluor 546 | Invitrogen | A20183 | |
| Kit de rotulagem de anticorpos AlexaFluor 790 | Invitrogen | A20189 | |
| Anticorpo Ly6G anti-camundongo (AlexaFluor 647) | Biolenda | 127610 | Clone: 1A8 |
| Filtro de células (100 µ m) | Corning | 431752 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Carl Roth | 7029.1 | |
| Etanol | Carl Roth | 0911.4 | |
| Cinemato de etilo (ECi) | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Software conversor de arquivos | Plano de bits | Vers. 10.1.0 | Imaris |
| Gaze | Fuhrmann | 10021 | |
| Goma gelana em pó | Sigma-Aldrich | Pág. 8169 | Fitagel |
| Heparina (25.000 IE/5 mL) | LEO Pharma | 15261203 | |
| Peróxido de hidrogênio (H2O2, 30%) | Carl Roth | 8070.2 | |
| Seringa para injeção | B Braun | Rolamento 9161502S | Omnican F |
| Cetamina (100 mg/mL) | Bela-Pharma | 402581.00.00 | |
| Sistema de microscópio de folha de luz | Miltenyi Biotec | - | UltraMicroscope Blaze |
| Seringa Luer lock | Becton Dickinson | 303172 | BD Plastipak |
| Agitador magnético | VWR | 444-0572 | |
| Câmera Neo sCMOS (4.2 MP) | Tecnologia Andor | ZL41 Célula 4.2 | |
| Objetivo | Miltenyi Biotec | 130-133-625 | Plano MI 1,1x NA 0,1, WD 17,6 mm |
| Paraformaldeído (PFA, 4%) | Sigma-Aldrich | 1.00496 | 10% de formalina, tamponado neutro |
| Placa de Petri | Greiner Bio-One | 632181 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Gibco | 14190-094 | Sem MgCl2/CaCl2 |
| Tubo de polipropileno (15 mL) | Greiner Bio-One | 188261 | |
| Tubo de polipropileno (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Preto |
| Tubo de polipropileno (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Prato de preparação para canulação de coração de camundongo | Hugo Sachs Elektronik | 73-4327 | Cânula incluída |
| Anticorpo anti-camundongo CD31 purificado | Becton Dickinson | 53369 | Clone: MEC13.3 |
| Bomba de rolos | Ismatec | ISM597-230 | |
| Filme de vedação | Bemis | PM-996 | Parafilme |
| Microscópio estéreo | Leica | S6D | |
| Rotador de tubo | Heidolph | Polymax 1040 | |
| Laser de luz branca | Fotônica NKT | SuperK extremo | 200 mW, 480-ndash; 2400 nanômetro |
| WT cepa de camundongo | Laboratórios Janvier | - | C57BL/6JRj |
| Xilazina (2%) | Ceva Tiergesundheit | 6324464.00.00 |
Referências
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
- Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol.
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Reimpressões e permissões
