Artigo de método

Análise 3D Simultânea de Dano Cardíaco e Resposta Imune em Infarto Agudo do Miocárdio Reperfundido Usando Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

DOI:

10.3791/68347

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26 de setembro de 2025

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1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A reconstrução tridimensional (3D) do dano cardíaco no infarto agudo do miocárdio reperfundido (repIAM) permite a quantificação fiel e a co-localização dos padrões associados que afetam a doença. Aqui, uma abordagem de imagem guiada por folha de luz automatizável é fornecida para medição contemporânea de danos cardíacos, área de risco e resposta de células imunes.

Resumo

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Interações celulares complexas determinam a remodelação funcional e estrutural do tecido durante o infarto agudo do miocárdio reperfundido (repAMI). Esses processos mostram distribuição espacial distinta à medida que o músculo cardíaco lesionado é segmentado em diferentes áreas (área de dano, área de risco (AAR) e área remota). A visualização tridimensional (3D) dessas áreas é essencial para a análise de várias interações entre as células cardíacas residentes e as células imunes infiltrantes, permitindo a identificação de possíveis alvos de tratamento. Aqui, um protocolo é descrito para visualização e quantificação 3D simultânea e automatizável da área de dano cardíaco, AAR e células imunes infiltrantes (por exemplo, neutrófilos) após repAMI. Isso inclui coloração mediada por anticorpos intravitais da área de dano cardíaco (CD31neg) e infiltração de neutrófilos (Ly6G+) após visualização ex vivo de AAR por perfusão retrógrada de anticorpos e limpeza adicional de tecido não tóxico para imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM). Essa técnica permite a análise espacial de células-alvo, por exemplo, infiltrando células imunes e áreas danificadas em um coração de camundongo intacto após repAMI. A histologia e a imuno-histoquímica tradicionais podem ser realizadas após a limpeza do tecido não tóxico e a aquisição de imagens com pós-processamento assistido por computador. Isso permite o ganho de informações de multiplexação dentro do mesmo coração de camundongo, fortalecendo a robustez dos dados e sendo especialmente significativo em uma lesão altamente complexa como o repAMI.

Introdução

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A lesão tecidual no infarto agudo do miocárdio reperfundido (IAMrep) é o principal fator determinante para o remodelamento cardíaco e desenvolvimento de insuficiência cardíaca1. Múltiplos mediadores locais e células cardíacas residentes, mas também células imunes infiltrantes, afetam sua expansão em uma interaçãocomplexa 2,3. Compreender a organização espacial desses processos é essencial para obter conhecimento profundo para a identificação de novos alvos terapêuticos para limitar a lesão tecidual após o IAM repIAM e melhorar a função cardíaca.

Como o próprio músculo cardíaco é composto por diferentes tipos de células, a análise detalhada do dano cardíaco é desafiadora, pois cada tipo de célula mostra sua própria capacidade de resistência específica durante a lesão de isquemia e reperfusão 4,5. Uma característica importante no contexto da repIAM é uma grande perda de vasculatura acompanhada de deterioração da função das células endoteliais6. O marcador mais estabelecido utilizado para a representação da estrutura vascular e análise da disfunção endotelial em camundongos e humanos é o CD31 (também conhecido como PECAM-1), uma molécula de adesão expressa na superfície da célula endotelial7. Em diferentes modelos de isquemia/reperfusão, a perda de CD31 mostrou-se um bom marcador substituto para a distinção de dano tecidual endotelial 8,9,10. Além disso, três compartimentos principais de lesão são distinguidos em todo o coração durante o IAM. O tecido cardíaco não afetado pela lesão de isquemia/reperfusão (I/R) representa a área remota. O miocárdio a jusante da oclusão de um vaso é definido como uma área de risco (RAA)11,12. Após o início da reperfusão, uma área distinta do tecido cardíaco pode ser diferenciada dentro da RAA, que foi danificada pela isquemia anterior (área de dano)13. A avaliação convencional da lesão cardíaca I/R em camundongos usa cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) em cortes espessos seriados exibindo diminuição da atividade metabólica das células cardíacas danificadas13,14. Simultaneamente, a coloração ex vivo com azul de Evan pode ser adicionada para a determinação de AAR15. No entanto, esses métodos estabelecidos apresentam várias limitações, incluindo a possibilidade reduzida de coavaliação da infiltração de células imunes, distinção de lesão específica do tipo de célula e reconstrução precisa do tecido 3D.

A microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) permite a possibilidade de visualizar órgãos inteiros de camundongos limpos intactos com resolução de sinal de fluorescência até o nível celular. Recentemente, um método aprimorado de limpeza de tecidos não tóxicos foi introduzido usando cinamato de etila (ECi) para visualização 3D de corações de camundongos intactos8. Para abordar as limitações da coloração azul de TTC/Evan, foi usada a coloração de fluorescência CD31 baseada em anticorpos intravitais, revelando lesão endotelial cardíaca como áreas sem coloração CD31 (CD31neg) durante o repIAM8. A administração adicional de injeção aórtica retrógrada ex vivo com um anticorpo anti-CD31 conjugado com fluoróforo com outro espectro de fluorescência quanto à coloração intravital é responsável pela representação 3D contemporânea de AAR. Além disso, este método pode ser estendido adicionando coloração de neutrófilos, permitindo a análise da distribuição celular separada por área remota, AAR e volume de lesão endotelial cardíaca para melhorar a compreensão da função dos neutrófilos durante o repAMI.

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Protocolo

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Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pela agência governamental local responsável (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) e cumpriram todos os regulamentos éticos relevantes para testes e pesquisas em animais. Os experimentos foram realizados com camundongos C57BL/6J machos (9-30 semanas de idade). Os animais foram alojados e utilizados em condições específicas livres de patógenos (FPS) no biotério local no ciclo diurno e noturno de 12 h/12 h.

NOTA: Todas as intervenções cirúrgicas foram realizadas sob indução intraperitoneal de anestesia com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) com manutenção com isoflurano (1,5 Vol%). Para diminuir o sofrimento dos animais, todos os animais receberam injeções subcutâneas de 0,1 mg / kg de buprenorfina pré e pós-anestesia durante o dia em combinação com buprenorfina contendo água potável durante a noite. O protocolo cirúrgico para indução de IAM repIAM foi descrito anteriormente em outro artigo16,17. Antes de iniciar a injeção de anticorpos intravitais, prepare duas placas de Petri de 6 cm que são usadas para injeção de anticorpos retrógrados ex vivo nas etapas posteriores descritas abaixo. Uma placa de Petri rasa com PBS no gelo é necessária para a remoção bruta do tecido circundante excessivo do coração (recomenda-se o uso de pedaços de gaze cortados no tamanho certo dentro do prato para facilitar o processo de manuseio posterior). Outra placa é necessária para a canulação da aorta com uma agulha de cânula de aço romba de 20 G submersa em PBS em gelo com um nó solto de sutura 5-0 sobre o entalhe da cânula. Evite ou remova bolhas de ar dentro da cânula, pois elas podem bloquear os vasos coronários e impedir a perfusão total.

1. Injeção intravital de anticorpos

  1. Anestesiar o camundongo com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
  2. Injete 10 μg de anticorpos anti-CD31 de camundongo diretamente marcados (clone: MEC13.3; fluoróforo: AlexaFluor 790) e anti-Ly6G de camundongo (clone: 1A8; fluoróforo: AlexaFluor 647) em PBS com um volume total de 5 μL por g de peso corporal (100 μL para um camundongo de 20 g) por meio de injeção intravenosa na veia da cauda.
    NOTA: Esta injeção de anticorpos marcará todo o endotélio dentro do coração e destina-se a quantificar o tamanho da lesão repAMI.
  3. Deixe os anticorpos injetados circularem por 10 minutos antes de continuar o procedimento.

2. Colheita do coração

NOTA: As seções 2 e 3 são críticas em termos de tempo e precisam ser concluídas em menos de 6 minutos.

  1. Sacrifique o animal por luxação cervical 10 min após a injeção de anticorpos. Verifique a morte avaliando os reflexos.
    NOTA: Se forem necessárias amostras de sangue, colete-as antes de prosseguir para a próxima etapa.
  2. Coloque o mouse sob um microscópio estéreo.
  3. Abra a cavidade torácica e faça uma incisão na veia cava superior exposta perto da saída do vaso da caixa torácica até o pescoço.
    NOTA: Mantenha a aorta intacta, pois é necessária para a injeção de anticorpos retrógrados ex vivo .
  4. Perfundir corações in situ via aurícula atrial direita e esquerda com PBS contendo heparina (20 IE/mL) usando uma agulha de 27 G com uma bomba de rolo (70 μL/s) por um total de 3 min. A remoção suficiente de sangue cardíaco torna-se perceptível pelo desbotamento da tração vascular superficial do coração e clareamento do pulmão e do fígado.
    NOTA: Evite a perfusão cardíaca através do ventrículo direito ou esquerdo, pois pode causar artefatos de imagem durante a microscopia de fluorescência da folha de luz.
  5. Extirpar o coração e pelo menos 5 mm da aorta restante junto com o tecido pulmonar circundante.
    NOTA: Não segure o músculo cardíaco diretamente durante a excisão para evitar danos aos tecidos e artefatos de imagem durante a microscopia de fluorescência da folha de luz.

3. Injeção retrógrada de anticorpos ex vivo

  1. Transfira o coração para uma placa de Petri de 6 cm com PBS gelado e gaze preparada anteriormente.
  2. Corte o restante do tecido pulmonar, adiposo e dos vasos circundantes até que apenas o coração com aproximadamente 5 mm de aorta permaneça.
  3. Transfira o coração para o prato preparado para canulação da aorta.
  4. Puxe a aorta restante sobre a cânula de aço rombo de 20 G e ligue-a com a sutura pré-nó 50 ao entalhe da cânula.
    NOTA: A ponta da cânula deve ser empurrada para perto da válvula aórtica para garantir que não haja vazamento de fluido de perfusão.
  5. Religar a artéria descendente anterior esquerda (DA) permanentemente com uma sutura 6-0 no local exato usado para indução de IAM repIAM anteriormente.
  6. Injete 400 μL de PBS contendo 20 μg de anticorpo anti-CD31 (clone: MEC13.3) de camundongo, marcado com AlexaFluor 546, retrogradamente por meio de cânula inserida.
    NOTA: Feche a junção entre a seringa de injeção e a cânula inserida com filme de vedação para garantir a perfusão completa do anticorpo através das artérias coronárias. Esta injeção de anticorpos só corará o endotélio fora do AAR e, portanto, pode ser usada para quantificação de AAR.
  7. Retire a cânula inserida da aorta.
  8. Transfira o coração para um tubo de reação de polipropileno de 15 mL contendo 10 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) e incube sem agitação durante a noite a 4 ° C no escuro.

4. Processamento e limpeza de amostras

  1. Lavar o coração fixado em três trocas de 5 mL de PBS por 10 min cada em temperatura ambiente (TR) no escuro, sempre agitando com rotação próxima à cabeça em tubos de reação de polipropileno de 5 mL.
  2. Coração fixado desidratado em séries ascendentes de etanol de 5 mL a 50%, 70% e 100% em água deionizada, cada um por pelo menos 2 h em RT no escuro, sempre agitando com rotação próxima acima da cabeça em tubos de reação de polipropileno de 5 mL.
    NOTA: A incubação em etanol 50% e 70% pode ser prolongada até o dia seguinte, enquanto a incubação em etanol 100% pode ser prolongada até 3 dias.
  3. Alvejar o coração desidratado em tubos de reação de polipropileno de 15 mL contendo 10 mL de etanol 100% com 5% de DMSO e 5% de H2O2 sem agitação por 4 h a 4 °C no escuro.
    NOTA: A pressão pode estar se acumulando dentro do tubo durante o processo de branqueamento; Tome cuidado ao abrir o tubo depois.
  4. Lave o coração branqueado em 5 mL de etanol 100% três vezes por 12 h cada em RT no escuro, sempre agitando com rotação próxima acima da cabeça em tubos de reação de polipropileno de 5 mL.
    NOTA: Cada etapa de incubação pode ser prolongada por até 3 dias.
  5. Transfira o coração para um tubo de reação de polipropileno de 5 mL contendo 4 mL de cinemato de etila (ECi) para limpeza do tecido e incube sem agitação por 3 dias em RT no escuro.
    NOTA: O coração limpo pode permanecer em ECi por pelo menos 3 meses sem diminuição na intensidade de fluorescência sob armazenamento correto no escuro em RT. Não armazene ECi ou amostras armazenadas em ECi abaixo de 6 °C, pois ECi congela a esta temperatura, prejudicando a amostra no processo.

5. Preparação de blocos de goma gelana

  1. Misture 1 g de goma gelana em pó em 100 mL de água da torneira aquecida (50-60 °C).
  2. Deixe misturar até resolver completamente usando um agitador magnético.
    NOTA: Se o pó não estiver resolvendo corretamente, aqueça a solução até ferver no micro-ondas.
  3. Filtrar a solução de goma gelana através de um filtro de células de 100 μm.
  4. Placa filtrada em uma placa de Petri de 10 cm.
  5. Deixe esfriar até que o gel esteja endurecido.
  6. Corte o gel em blocos de 15 mm 15 mm 5 mm.
  7. Desidratar blocos em 50 mL de séries ascendentes de etanol a 50% e 70% em água deionizada, cada um por pelo menos 2 h em RT sempre agitando com rotação quase aérea em um tubo de reação de polipropileno de 50 mL.
    NOTA: Encha o tubo de reação com etanol após adicionar blocos de gel. Encha o tubo de reação apenas até a metade com blocos de gel.
  8. Incubar blocos desidratados em 50 mL de etanol 100% três vezes por 12 h cada em RT, sempre agitando com rotação quase acima da cabeça em um tubo de reação de polipropileno de 50 mL.
    NOTA: Encha o tubo de reação com etanol após adicionar blocos de gel. Encha o tubo de reação apenas até a metade com blocos de gel. Os blocos de gel podem permanecer no último tubo de reação com etanol 100% por longos períodos até serem limpos em ECi.
  9. Transfira os blocos para um tubo de reação de polipropileno de 50 mL contendo 25 mL de ECi e incube sem agitação por 3 dias em RT.
    NOTA: Coloque apenas alguns blocos em um tubo de reação com ECi para evitar a limpeza de artefatos. Os blocos limpos podem permanecer no ECi por pelo menos 6 meses e armazenados no RT.

6. Exames de imagem

  1. Corte os blocos de goma gelana limpos no tamanho necessário para estabilizar o coração limpo no suporte de amostra do microscópio.
    NOTA: Os blocos de goma gelana podem ser reutilizados várias vezes.
  2. Detecte sinais de fluorescência de interesse (autofluorescência, coloração AAR [anticorpo anti-CD31 marcado com AlexaFluor 546], anticorpo anti-Ly6G acoplado a AlexaFluor647 e coloraçãonegativa CD31 [anticorpo anti-CD31 marcado com AlexaFluor 790]) com configurações apropriadas de excitação e filtro de emissão. Para aquisição, use uma lente objetiva de 0.1 NA com uma distância de trabalho de 17.6 mm.
    NOTA: Detecte sinais com um laser de luz branca (200 mW; 480-2400 nm). Para a detecção de autofluorescência derivada do tecido conjuntivo, utilizar um filtro de excitação passa-banda de 470/30 nm e um filtro de emissão passa-banda de 525/50 nm; A coloração de CD31 com um anticorpo acoplado a AlexaFluor 546 é detectada com um filtro de excitação passa-banda de 520/40 nm e um filtro de emissão passa-banda de 585/40 nm; A coloração Ly6G com um anticorpo acoplado a AlexaFluor 647 é detectada com um filtro de excitação passa-banda de 630/30 nm e um filtro de emissão passa-banda de 680/30 nm; A coloração CD31 com um anticorpo acoplado ao AlexaFluor 790 é detectada com um filtro de excitação passa-banda de 740/40 nm e um filtro de emissão passa-banda de 824/55 nm. Os tempos de iluminação e a porcentagem de atenuação do laser devem ser ajustados de acordo com a qualidade do sinal.
  3. Escolha as seguintes configurações para imagens de microscopia de folha de luz:
    1. Escolha a folha NA de 0,079, resultando em uma espessura de folha leve de 5 μm.
    2. Escolha 10 μm como a distância entre dois planos z individuais.
      NOTA: Isso resulta em subamostragem e subsequente perda de precisão para medições de rastreamento e volume. Para evitar isso, uma distância entre dois planos z individuais deve ser igual à metade da espessura da folha leve, portanto, neste caso, 2,5 μm. Este estudo optou por subamostrar os dados, pois os benefícios obtidos com a redução do tempo de imagem e do tamanho da pilha de dados superam a perda mínima de precisão da análise.
    3. Use uma largura de folha de 100% para obter uma iluminação homogênea da amostra.

7. Pós-processamento de imagem

NOTA: Os dados de imagem digital adquiridos foram processados posteriormente usando um software científico de processamento e análise de imagens 3D listado na Tabela de Materiais.

  1. Inicie o software conversor de arquivos Imaris 10.1 e carregue o conjunto de dados brutos no software arrastando e soltando a pasta com os arquivos de imagem na janela do conversor de arquivos Imaris ou clicando em Procurar e navegando até a pasta com os arquivos de imagem.
  2. Selecione a pasta de saída por meio de Selecionar pasta.
  3. Clique em Iniciar tudo e aguarde até que os arquivos sejam convertidos em arquivos .ims Imaris.
  4. Inicie o software e selecione Superar no canto superior esquerdo.
  5. Abra pilhas de imagens escolhendo Abrir e selecione o arquivo de dados .ims correspondente.
  6. Para criar uma superfície gerada automaticamente de todo o coração, selecione Vista 3D e Superfícies.
  7. Escolha Selecionarapenas uma região de interesse, Processar imagem inteira finalmente e Estatísticas de objeto-objeto enquanto desativa Classificar superfícies na seção Configurações do algoritmo .
    NOTA: A ativação das Estatísticas de objeto-objeto permite o cálculo de sobreposição de diferentes superfícies e funções de ponto.
  8. Clique no botão de seta azul no canto inferior direito da planilha Criar para continuar com as próximas etapas.
  9. Determine a região tridimensional de interesse usando os manipuladores que aparecem dentro da visualização da imagem.
  10. Prossiga para a próxima etapa escolhendo o canal de origem (canal de autofluorescência).
  11. Ative Smooth e escolha a configuração padrão de 11.8 μm.
  12. Continue com a próxima etapa e determine o limite necessário para criar uma superfície tridimensional opticamente satisfatória que apareça dentro da visualização da imagem.
  13. Na última etapa, ajuste o filtro de superfície, escolhendo Número de Voxels como o tipo de filtro e determinando 10 como o limite.
  14. Crie uma superfície clicando no botão de seta verde no canto inferior direito da seção Criar . Usando a folha Cor , altere o material e a cor da superfície criada conforme necessário.
  15. Gere duas superfícies adicionais criadas manualmente para AAR (volumenegativo de CD31 no canal AlexaFluor 546) e volume de lesão endotelial cardíaca (volumenegativo de CD31 no canal AlexaFluor 790) escolhendo Visualização 3D e Superfícies mais uma vez.
  16. Escolha Segmentar apenas uma região de interesse, Processar imagem inteira finalmente e Estatísticas de objeto-objeto enquanto desativa Classificar superfícies na seção Configurações do algoritmo e clique em Ignorar criação automática, editar manualmente.
  17. Dentro da folha Quadro , selecione XY para orientação, Nenhum para visibilidade e ajuste manualmente o controlador de resolução para o máximo.
  18. Vá para a folha Modelo , clique no ícone Distância e defina o espaçamento entre vértices para 100 μm.
  19. Ative Desenhe e circunde áreasnegativas CD31 no canal AlexaFluor 546 ou no canal AlexaFluor 790 a cada 10 fatias de imagem.
  20. Depois de terminar de circundar todas as áreas correspondentes, escolha Ajuste automático e Executar ajuste automático.
  21. Clique em Criar superfície e ajuste o material e a cor das superfícies geradas na folha Cor .
  22. Para exibir neutrófilos como pontos Ly6G+ , gere uma função de ponto escolhendo Visualização 3D e Pontos.
  23. Selecione Segmentar apenas uma região de interesse, Processar imagem inteira finalmente e Estatísticas de objeto-objeto enquanto desativa Classificar pontos na seção Configurações do algoritmo .
  24. Prossiga para as próximas etapas usando o botão de seta azul no canto inferior direito da planilha Criar .
  25. Determine a região tridimensional de interesse usando os manipuladores que aparecem dentro da visualização da imagem, conforme mencionado acima.
  26. Continue com a próxima etapa usando o canal de origem (canal AlexaFluor 647).
  27. Defina o diâmetro XY estimado para 10 μm, ative o alongamento PSF do modelo ao longo do eixo Z e defina o diâmetro Z estimado para 20 μm.
  28. Desative a subtração em segundo plano.
  29. Prossiga com a próxima etapa, selecione Intensidade mínima como filtro e defina um limite apropriado.
    NOTA: Para estimar o nível de limite, clique em Slice na área superior da janela do programa e selecione o canal AlexaFluor 647. Mova o cursor sobre diferentes pontos na fatia da imagem bruta que representam uma coloração Ly6G positiva e leia o valor da intensidade no canto inferior esquerdo da janela do programa.
  30. Gere pontos clicando no botão de seta verde no canto inferior direito da planilha Criar .
  31. Defina a Escala de raio como 3,0 na seção Estilo/qualidade de pontos da planilha Criar .
  32. Acessei a folha de cores para ajustar a cor especial conforme desejado.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A abordagem apresentada usando microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) permite a análise simultânea de AAR, lesão endotelial e infiltração de neutrófilos após repAMI. A Figura 1A ilustra a coloração intravital e ex vivo de camundongos C57BL / 6J 24 h após a indução de repAMI. Anticorpos para coloração de lesão endotelial cardíaca (anti-CD31 marcado com AlexaFluor 790) e infiltração de neutrófilos (anti-Ly6G marcado com AlexaFluor 647) foram injetados por via intravenosa ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existem várias entidades de imagem para detectar lesão tecidual cardíaca durante o repIAM em camundongos. Essas técnicas oferecem vantagens diferentes, mas também apresentam limitações. A coloração da diminuição da atividade metabólica das células cardíacas usando TTC é o método mais comumente usado para quantificação da lesão cardíaca de I/R e pode ser combinada com a coloração azul de Evan para a distinção de AAR 13,14,15....

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elias Haj-Yehia relata honorários pessoais e outros da AstraZeneca, que estão fora do trabalho submetido. Simon F. Merz e Lea Bornemann são atualmente empregados pela Miltenyi Biotec BV & Co. KG. Matthias Totzeck e Tienush Rassaf relatam honorários pessoais, e outros da Edwards e Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo e Astra Zeneca, que estão fora do trabalho submetido. Tienush Rassaf e Ulrike B. Hendgen-Cotta cofundaram a Bimyo, uma empresa com foco no desenvolvimento de peptídeos cardioprotetores. Matthias Gunzer recebeu financiamento geral de pesquisa da Miltenyi BioTec BV & Co. KG. Todos os demais autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: Fundação Alemã de Pesquisa (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) e Sociedade Cardíaca Alemã (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Parte desse trabalho foi realizado no Imaging Center Essen (IMCES), uma instalação central de serviços da Faculdade de Medicina da Universidade de Duisburg-Essen, Alemanha. Agradecemos à equipe do IMCES por seu suporte técnico contínuo e pelo uso de seus instrumentos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha de 27 gBecton Dickinson305889BD Eclipse
Processamento de imagem 3D e software de análisePlano de bitsVers. 10.1.0Imaris
Sutura 5-0Serag-WiessnerIC108000Seda
6-0 suturaÉticaEH7814Prolene
Kit de rotulagem de anticorpos AlexaFluor 546InvitrogenA20183
Kit de rotulagem de anticorpos AlexaFluor 790InvitrogenA20189
Anticorpo Ly6G anti-camundongo (AlexaFluor 647)Biolenda127610Clone: 1A8
Filtro de células (100 µ m)Corning431752
Dimetilsulfóxido (DMSO)Carl Roth7029.1
EtanolCarl Roth0911.4
Cinemato de etilo (ECi)Sigma-Aldrich112372
Software conversor de arquivosPlano de bitsVers. 10.1.0Imaris
GazeFuhrmann10021
Goma gelana em póSigma-AldrichPág. 8169Fitagel
Heparina (25.000 IE/5 mL)LEO Pharma15261203
Peróxido de hidrogênio (H2O2, 30%)Carl Roth8070.2
Seringa para injeçãoB BraunRolamento 9161502SOmnican F
Cetamina (100 mg/mL)Bela-Pharma402581.00.00
Sistema de microscópio de folha de luzMiltenyi Biotec-UltraMicroscope Blaze
Seringa Luer lockBecton Dickinson303172BD Plastipak
Agitador magnéticoVWR444-0572
Câmera Neo sCMOS (4.2 MP)Tecnologia AndorZL41 Célula 4.2
ObjetivoMiltenyi Biotec130-133-625Plano MI 1,1x NA 0,1, WD 17,6 mm
Paraformaldeído (PFA, 4%)Sigma-Aldrich1.0049610% de formalina, tamponado neutro
Placa de PetriGreiner Bio-One632181
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco14190-094Sem MgCl2/CaCl2
Tubo de polipropileno (15 mL)Greiner Bio-One188261
Tubo de polipropileno (5 mL)Carl RothEKY9.1Preto
Tubo de polipropileno (50 mL)Greiner Bio-One227261
Prato de preparação para canulação de coração de camundongoHugo Sachs Elektronik73-4327Cânula incluída
Anticorpo anti-camundongo CD31 purificadoBecton Dickinson53369Clone: MEC13.3
Bomba de rolosIsmatecISM597-230
Filme de vedaçãoBemisPM-996Parafilme
Microscópio estéreoLeicaS6D
Rotador de tuboHeidolphPolymax 1040
Laser de luz brancaFotônica NKTSuperK extremo200 mW, 480-ndash; 2400 nanômetro
WT cepa de camundongoLaboratórios Janvier-C57BL/6JRj
Xilazina (2%)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
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