Modelo de camundongo otimizado para induzir câncer de cólon associado à colite usando azoximetano e sulfato de dextrano sódico para estudos de imunologia e terapia tumoral

Resumo

O câncer de cólon associado à colite induzida por azoximetano (AOM)/sulfato de dextrano sódico (DSS) é uma abordagem estabelecida e econômica para modelar tumores autóctones do intestino grosso em camundongos. Apresentamos um protocolo atualizado e discutimos considerações críticas para a otimização da dose de DSS específica para o sexo e a contribuição do microbioma para rigor, robustez e reprodutibilidade.

Resumo

O azoximetano (AOM, um agente que danifica o DNA) e o sulfato de dextrano sódico (DSS, um agente promotor de colite) podem induzir tumores no intestino grosso de camundongos com alta penetrância. O modelo de câncer de cólon associado à colite murina (CAC) induzido por AOM/DSS é um padrão-ouro na investigação do câncer de cólon relacionado à inflamação, dada sua precisão na recapitulação das características clínicas do CAC humano. As vantagens do modelo incluem sua origem e desenvolvimento a partir de tecido endógeno, competência imunológica preservando um repertório completo de interações tumor-imune, adaptabilidade a várias cepas de camundongos, conveniência de uma latência de 3 meses e custos relativamente baixos. Apesar dessas vantagens, vários desafios limitam a eficácia do protocolo. A variabilidade na dosagem de DSS e na penetrância do tumor entre os estudos leva a observações inconsistentes. Além disso, variações na microbiota intestinal contribuem para o aumento da variabilidade experimental, impactando negativamente o poder estatístico. As diferenças entre os sexos em resposta à OMA/DSS complicam ainda mais a interpretação dos resultados. Além disso, a variabilidade lote a lote do DSS dificulta a reprodutibilidade dos achados. Enfrentar esses desafios é crucial para aumentar a confiabilidade e a aplicabilidade desse modelo na pesquisa pré-clínica. Para resolver isso, usando camundongos C57BL/6J como modelo, refinamos o protocolo estabelecido com estratégias de otimização efetiva para melhorar a reprodutibilidade e a harmonização entre os estudos. Isso inclui recomendações para titulação da dose de DSS em camundongos machos e fêmeas, implementação da homogeneização da microbiota antes de cada ciclo de DSS para mitigar a heterogeneidade da flora intestinal de gaiola para gaiola. Essas etapas reduziram significativamente a variabilidade e melhoraram a reprodutibilidade, resultando em indução robusta de CAC. Reconhecendo o papel fundamental da inflamação e dos mecanismos imunológicos celulares no desenvolvimento do CAC, o protocolo também descreve procedimentos de processamento de tecidos adequados para isolamento de RNA ou proteína e para traçar o perfil de citocinas inflamatórias de tumores de cólon e tecido do cólon circundante. Em última análise, o uso desse método garante uma produção de CAC mais rigorosa, robusta e reprodutível.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro câncer mais comum em todo o mundo e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer ^1,2. Comparado ao CCR esporádico, o câncer colorretal associado à colite (CAC) surge como resultado de danos intestinais prolongados e repetidos em pacientes com doença inflamatória intestinal (DII)^3,4, é caracterizado por um grau maligno mais alto e uma tendência à apresentação multifocal em uma idade mais jovem. Devido a esses fatores, a CAC geralmente necessita de tratamento mais agressivo com resultados clínicos menos favoráveis⁵. Embora o CAC seja considerado uma entidade distinta devido, pelo menos em parte, ao momento único de aquisição de mutações e a um papel desproporcional dos mecanismos imunológicos inflamatórios e do microbioma, o CAC e o CCR esporádico compartilham muitas semelhanças em relação às paisagens genômicas gerais e características patogenéticas. Para avançar nossa compreensão do CCR em geral e do CAC em particular, e para melhorar as estratégias terapêuticas, modelos pré-clínicos robustos são essenciais.

Dentre os vários modelos utilizados para estudar o CCR, o modelo CAC induzido por AOM/DSS é o mais amplamente adotado e é considerado o padrão-ouro atual ^6,7. Iniciado com um forte insulto mutagênico entregue pela AOM, este modelo se baseia em repetidos surtos de colite induzidos por DSS que imitam de perto a DII humana, como a doença de Crohn e a colite ulcerativa, que são fatores de risco bem estabelecidos para CAC⁸. O modelo AOM/DSS oferece várias vantagens importantes sobre outras abordagens in vivo. Ao contrário dos métodos que dependem da injeção de material exógeno de iniciação do câncer para estabelecer tumores de flanco ou mesmo ortotópicos, o CAC induzido por AOM/DSS é autóctone, o que significa que a iniciação do tumor ocorre endogenamente e a progressão do câncer se desdobra no microambiente do tecido nativo, refletindo mais de perto sua biologia e história natural. Ao contrário dos xenoenxertos de linhagens de células humanas ou de material derivado de pacientes que só podem ser cultivados em camundongos imunocomprometidos, é imunocompetente, permitindo o estudo das interações câncer-imune. Ao contrário dos modelos geneticamente modificados que produzem tumores com fatores genéticos específicos, é agnóstico em relação a mutações predefinidas, permitindo uma modelagem mais ampla das vias de sinalização do câncer e dos mecanismos de educação imunológica. Finalmente, o modelo AOM/DSS pode ser prontamente adaptado a muitas linhagens diferentes de camundongos, eliminando a necessidade de longos esquemas de reprodução, tornando-o econômico e de tempo. No entanto, fatores como sexo animal, dosagem de DSS e diferenças na microbiota intestinal podem introduzir variabilidade, afetando a reprodutibilidade e complicando sua aplicação na pesquisa translacional.

Nosso objetivo foi refinar este protocolo para mitigar o impacto desses fatores que sustentam as inconsistências na extensão da inflamação do cólon e da tumorigênese do CAC. Há variabilidade significativa nas concentrações de DSS usadas para induzir inflamação aguda, colite ou inflamação crônica e CAC ^9,10. O DSS é um polímero e o peso molecular médio pode variar entre lotes e fabricantes, afetando a variabilidade nos resultados experimentais. Portanto, é essencial testar cada lote de DSS para garantir a consistência entre os estudos. Além disso, a extensão da inflamação induzida por DSS é altamente influenciada pelo microbioma intestinal, que pode diferir significativamente entre as instalações de camundongos em todo o mundo e até mesmo entre diferentes locais de retenção e colônias dentro da mesma instituição^11,12. Essa variabilidade na composição microbiana pode afetar os resultados do modelo e contribuir para resultados inconsistentes¹³. A co-habitação de animais dos diferentes grupos experimentais, sempre que possível, é fundamental para diminuir a variabilidade, mas pode não ser suficiente para lidar com esse fator de confusão, pois as comunidades microbianas sofrem deriva estocástica ao longo do tempo e levam a efeitos de gaiola em modelos de inflamação crônica¹⁴. Como o protocolo AOM/DSS envolve tratamento de longo prazo para manter a inflamação crônica, implementamos a homogeneização da microbiota misturando periodicamente a cama de todas as gaiolas que abrigam animais tratados com AOM/DSS. Essa prática ajuda a homogeneizar o ambiente da microbiota, resultando em redução da variabilidade experimental. Além disso, as observações indicam que os efeitos do DSS podem variar de acordo com o sexo do animal^15,16, potencialmente levando a respostas diferenciais na inflamação e no desenvolvimento do câncer. Refinamos o protocolo existente titulando DSS em camundongos fêmeas e machos separadamente para escolher uma dosagem apropriada de DSS para ambos os sexos, garantindo resultados mais uniformes e fornecendo insumos críticos para cálculos de poder estatístico para determinar tamanhos de amostra ideais em camundongos machos e fêmeas.

No geral, para aumentar a reprodutibilidade do modelo AOM/DSS, descrevemos um conjunto padronizado de diretrizes de protocolo que levam em conta e mitigam esses fatores de confusão. Empregamos técnicas de homogeneização do microbioma, bem como descrevemos o ajuste preciso da dosagem de DSS para obter resultados mais consistentes e reprodutíveis, melhorando assim a utilidade do modelo AOM/DSS e a harmonização entre diferentes estudos. Nosso protocolo se destaca por demonstrar variabilidade reduzida de gaiolas homogeneizadas por microbiota e fornece instruções claras e passo a passo para implementar essas práticas de reprodutibilidade. Como resultado, a menor variabilidade dentro do grupo afetada por esses refinamentos de protocolo leva a uma redução no tamanho das amostras necessárias para atingir o poder estatístico desejado na detecção de diferenças entre os grupos experimentais. Este protocolo otimizado é adaptado para pesquisadores que pretendem adaptar o modelo AOM / DSS a seus próprios modelos de camundongos e projetos experimentais, independentemente da cepa ou origem de gênero, para estudar mecanismos de tumorigênese, alvos terapêuticos ou explorar a dinâmica das células imunes.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais devem ser realizados de acordo com um protocolo aprovado institucionalmente para garantir o manuseio humano e a adesão aos padrões éticos. Os estudos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida (IACUC).

1. Otimização da dosagem de DSS

1. Obtenha camundongos da idade, linhagem e fonte a serem usados no experimento principal, com uma distribuição igual de machos e fêmeas. Rotule cada mouse por punção de orelha, marca de cauda ou outro método aprovado para rastreamento individual. Meça e registre o peso corporal inicial de cada animal.
   NOTA: Os camundongos machos devem ser alojados antes do desmame e não devem ser redistribuídos entre as gaiolas para minimizar as brigas.
2. Se estiver usando rega automática, uma semana antes de iniciar um experimento, troque os animais por garrafas de água e, simultaneamente, bloqueie os bicos da gaiola (tubos de metal na gaiola) com tampões estéreis.
   NOTA: Certifique-se de que quaisquer alterações no fornecimento de água, como bicos de água potável automatizados bloqueados, sejam aprovadas pela IACUC ou pelo órgão regulador apropriado que supervisiona o uso humano de animais. As gaiolas dos animais podem exigir verificações diárias para garantir o acesso ininterrupto à água potável.
3. Prepare a solução de DSS dissolvendo o DSS em água potável estéril autoclavada em concentrações variadas de 1,5% a 5% (p / v), usando uma barra de agitação magnética e uma placa de agitação. Aguarde 30 minutos em temperatura ambiente para que o pó DSS se dissolva completamente em água. Prepare a água DSS fresca todas as semanas e armazene-a a 4 °C por até uma semana.
4. Encha dois tubos cônicos de 50 mL com água DSS em cada concentração (um para homens, outro para mulheres) e conecte com segurança um bico esterilizado autoclavado para evitar vazamentos.
5. Administre água DSS em cada concentração para camundongos fêmeas e machos, com 3 camundongos em cada gaiola recebendo a mesma concentração. Use água potável estéril sem DSS como controle negativo. Substitua a água DSS a cada dois dias.
6. Administre água DSS por 7 dias. Registre o peso corporal de cada camundongo diariamente.
7. No dia 8, mude todos os animais de volta para a água potável normal.
8. No dia 8, avaliar a gravidade da diarreia com base na consistência das fezes utilizando um sistema de pontuação padronizado conforme descrito¹⁷ e registrar as pontuações. Pontue "1" como fezes moles, mas ainda formadas, "2" como fezes muito moles e "3" como diarreia.
9. No dia 8, colete 2-3 bolinhas de fezes frescas e avalie a presença de sangue oculto (ver Tabela de Materiais). Registar a presença ou ausência de sangue na amostra.
10. Avalie o sangramento intestinal com base em uma combinação de dois critérios de pontuação, consistência das fezes (0-3) e presença de sangue nas fezes (0-3), para uma pontuação total variando de 0 a 6.
11. Do dia 9 ao dia 12, registre o peso corporal de cada camundongo diariamente e monitore de perto os animais tratados com DSS quanto à perda significativa de peso corporal e diarreia grave. Eutanasiar prontamente os animais que atingem ou excedem os limites humanos por asfixia com dióxido de carbono (CO₂) ou outro método apropriado de acordo com o protocolo de uso de animais aprovado e as diretrizes éticas estabelecidas.
12. Do dia 13 ao dia 18, continue monitorando os animais e registre o peso corporal de cada camundongo diariamente até que esteja totalmente recuperado aos níveis pré-experimento.
13. Determine a concentração ideal de DSS, resultando em aprox. 20% de perda de peso corporal acompanhada de fezes moles, mas ainda formadas. A dose ideal de DSS pode variar entre machos e fêmeas, linhagens de camundongos, idades, lotes de DSS e instalações para animais.

2. Indução CAC

1. Dia 0-6: Tratamento com OMA Dia 7-28: ^1º ciclo de tratamento com DSS
   1. Preparação de estoque AOM: Dissolva o pó AOM em solução salina estéril para atingir uma concentração estoque de 10 mg / mL. Filtrar a solução através de um filtro de 0,45 μm, distribuir alíquotas de 1 ml em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e conservar a -80 °C durante um ano.
      NOTA: A OMA é um agente cancerígeno volátil e deve ser manuseada com cautela sob um capuz de biossegurança com equipamento de proteção individual (EPI) adequado, seguindo as recomendações de segurança do fabricante. AOM e quaisquer materiais contaminados com AOM devem ser descartados de acordo com os protocolos de descarte de resíduos químicos perigosos da instituição. É responsabilidade do investigador garantir as aprovações necessárias de saúde e segurança ambiental com antecedência.
   2. Se estiver usando rega automatizada em gaiolas, 1 semana antes do início do experimento, bloqueie o bico de água potável automatizado e troque os animais por garrafas de água para aclimatação, como na etapa 1.2.
   3. No dia 0, pesar e registrar o peso corporal de cada camundongo para calcular a quantidade total necessária de OMA. Em seguida, calcule o volume total de OMA (concentração final de trabalho de 1 mg / mL) com base no peso de cada animal para atingir uma dose de 10 mg / kg, por exemplo, 200 μL para um camundongo de 20 g.
   4. Descongelar o número necessário de novas alíquotas de 10 mg/ml AOM no gelo antes de cada utilização. Diluir cada alíquota de 1 ml de OMA com 9 ml de solução salina estéril para atingir uma concentração de trabalho de 1 mg/ml.
   5. Administre OMA a camundongos por meio de injeção intraperitoneal. Realize este procedimento dentro de um gabinete de biossegurança usando EPI apropriado, como luvas duplas e uma máscara N95 para proteção ideal.
      CUIDADO: Descarte qualquer sobra de solução AOM de acordo com os requisitos de descarte de resíduos químicos perigosos.
   6. No dia 3, transfira os animais tratados com AOM para gaiolas limpas. Use EPI apropriado ao manusear gaiolas contaminadas com AOM e outros materiais para proteção.
      CUIDADO: Descarte a cama suja da gaiola e qualquer resto de comida de acordo com os procedimentos de descarte de resíduos químicos perigosos aprovados pela instituição.
      NOTA: A OMA e os seus metabolitos são completamente excretados 72 h após a administração¹⁸, altura em que o leito sujo da gaiola pode ser eliminado.
   7. No dia 7, realize a homogeneização da microbiota intestinal para minimizar a variabilidade de gaiola para gaiola. Para fazer isso, faça uma amostra de 25% da cama de cada gaiola, misture bem e redistribua-a de volta em cada gaiola.
      NOTA: Evite trocar de gaiola durante a semana de tratamento com DSS e por cinco dias depois. Coordene com o serviço de troca de gaiolas de criação da instalação, conforme necessário.
   8. Inicie a indução da colite fornecendo DSS na água potável usando tubos cônicos de 50 mL equipados com bicos adequados. Verifique os ratos diariamente para confirmar se os animais têm acesso irrestrito à água do DSS. Substitua a água DSS a cada dois dias. Registre o peso corporal de cada camundongo diariamente.
   9. No dia 14, substitua a água DSS por garrafas de água potável normais. Continue a monitorar de perto os animais quanto à dor e angústia.
   10. Nos dias 14-19, pese cada rato diariamente. Eutanásia de animais que perdem mais de 25% de seu peso corporal, ou se um animal atinge qualquer um dos pontos finais humanos descritos no protocolo aprovado de cuidados e uso de animais. Além disso, monitore e registre quaisquer casos de sangramento retal.
2. Dia 7-28: 1º ciclo de tratamento com DSS
   1. No dia 7, realize a homogeneização da microbiota intestinal para minimizar a variabilidade de gaiola para gaiola. Para fazer isso, faça uma amostra de 25% da cama de cada gaiola, misture bem e redistribua-a de volta em cada gaiola.
      NOTA: Evite trocar de gaiola durante a semana de tratamento com DSS e por cinco dias depois. Coordene com o serviço de troca de gaiolas de criação da instalação, conforme necessário.
   2. Inicie a indução da colite fornecendo DSS na água potável usando tubos cônicos de 50 mL equipados com bicos adequados. Verifique os ratos diariamente para confirmar se os animais têm acesso irrestrito à água do DSS. Substitua a água DSS a cada dois dias. Registre o peso corporal de cada camundongo diariamente.
   3. No dia 14, substitua a água DSS por garrafas de água potável normais. Continue a monitorar de perto os animais quanto à dor e angústia.
   4. Nos dias 14-19, pese cada rato diariamente. Eutanásia de animais que perdem mais de 25% de seu peso corporal, ou se um animal atinge qualquer um dos pontos finais humanos descritos no protocolo aprovado de cuidados e uso de animais. Além disso, monitore e registre quaisquer casos de sangramento retal.
3. Dia ^{29-49: 2º} ciclo de tratamento com DSS
   1. Repita a homogeneização da microbiota junto com a administração de DSS, seguindo os mesmos procedimentos das etapas 2.2.1-2.2.4. Opcional: Após o segundo e/ou terceiro ciclo de DSS, realizar a colonoscopia conforme descrito anteriormente¹⁹.
4. Dia 50-70:^3º ciclo de tratamento com DSS
   1. Repita a homogeneização da microbiota junto com a administração de DSS, seguindo os mesmos procedimentos das etapas 2.2.1-2.2.4. Como os camundongos tendem a perder mais peso três dias após o terceiro ciclo de DSS, monitore de perto todos os animais quanto à perda excessiva de peso corporal ou a quaisquer indicações de sangramento retal durante esse período e forneça ração úmida para cuidados de suporte, se indicado.

3. Avaliação da gravidade da colite e patologia macroscópica da CAC

1. No dia 70, colete 2-3 pellets fecais frescos de cada camundongo para testar a presença de sangue oculto e / ou marcadores de inflamação, como lipocalina-2²⁰ , para avaliar a gravidade da colite. Use reagentes/kits apropriados (consulte a lista de materiais e equipamentos) e siga as instruções do fabricante para realizar os ensaios, brevemente descritas abaixo.
2. Para preparar amostras fecais para avaliação dos níveis de lipocalina-2 do marcador de inflamação, coloque pellets de fezes frescas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Dissolva os grânulos em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) usando um misturador de vórtice até obter uma solução uniforme. Centrifugue a solução a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C. O sobrenadante pode ser usado imediatamente para ELISA de lipocalina-2 ou armazenado a -80 ° C para uso posterior.
3. Execute o ELISA de lipocalina-2 de camundongo de acordo com as instruções do fabricante do kit. Execute experimentos piloto de diluição em série para determinar a diluição ideal de amostras fecais em relação aos padrões.
   NOTA: Espera-se que os níveis de lipocalina-2 aumentem pelo menos 1000 vezes em camundongos tratados com DSS em comparação com animais de controle tratados com água²⁰.
4. Avalie a gravidade da colite usando um sistema de pontuação de diarreia¹⁷ , conforme descrito nas etapas 1.8-1.10.
5. No dia 70, eutanasiar os animais por asfixia com CO₂ ou usando qualquer outro método humano aprovado.
6. Pulverize a área abdominal de cada animal com etanol 70% para minimizar a contaminação durante as etapas subsequentes.
7. Use pinças cirúrgicas finas para levantar a pele e a camada peritoneal. Faça uma incisão horizontal com uma tesoura para expor a cavidade abdominal.
8. Puxe o intestino delgado para fora e identifique o ceco. Levante suavemente o ceco e o cólon usando uma pinça. Disseque cuidadosamente o cólon cortando o mesentério e a vasculatura associada usando uma tesoura, evitando perfurar ou cortar o cólon.
9. Corte o osso pélvico e a pele ao redor da área retal-anal para expor todo o cólon distal. É importante dissecar todo o cólon com a parte distal intacta, pois a maioria dos tumores geralmente ocorre nessa região.
10. Coloque o cólon dissecado em uma tira limpa de papel de filtro, endireitando-o suavemente.
11. Meça o comprimento dos dois pontos com uma régua e documente-o com uma fotografia. Inclua a régua na fotografia para escalar.
12. Limpe as manchas de Peyer no exterior do cólon, tomando cuidado para não perfurar o tecido.
13. Enxágüe o cólon em PBS estéril frio.
14. Fixe uma ponta de micropipeta de 200 μL (sem filtro) em uma seringa de 3 mL usando filme de parafina. Use esta configuração para encher a seringa com PBS estéril, insira a ponta da pipeta no lúmen do cólon e lave suavemente o conteúdo do cólon 2-3 vezes, garantindo a remoção completa dos sedimentos das fezes.
15. Estique suavemente o cólon em uma tira de papel de filtro limpa e pré-umedecida. Abra os dois pontos longitudinalmente e coloque-os sobre o papel de filtro.
16. Identifique tumores maiores, que geralmente se apresentam como bolhas proeminentes que se projetam da parede do cólon com uma aparência vermelha e inflamada.
17. Para tumores menores, tenha cuidado adicional durante a identificação. Utilize um laço de semeadura bacteriana estéril para sondar suavemente a superfície do cólon em busca de irregularidades ou inchaços. Confirme se quaisquer inchaços detectados não são remanescentes de gânglios linfáticos ou vasos sanguíneos localizados na parte externa da parede do cólon.
18. Use paquímetros digitais para medir a largura e o comprimento de cada tumor.
19. Registre a contagem de tumores e o tamanho e a localização de cada tumor em um mapa de cólon pré-impresso.

4. Avaliação histológica

1. Use dois pares de pinças de ponta fina para agarrar as duas extremidades laterais do cólon distal. Role o cólon da extremidade distal para a extremidade proximal em uma forma de rolo suíço, conforme descrito em outro lugar²¹. Certifique-se de que a extremidade distal esteja no centro do rolo e a extremidade proximal forme a camada mais externa.
2. Prenda cada cólon enrolado na Suíça usando uma agulha 271/2-G.
3. Coloque cada cólon enrolado na Suíça em um de tecido devidamente rotulado.
4. Mergulhe os de tecido contendo cólon laminado na Suíça em paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS estéril. Deixe os tecidos permanecerem no fixador por 24 h.
5. Após 24 h, transferir os tecidos para etanol a 70%. Os tecidos podem ser mantidos em etanol a 70% a 4 °C por até três meses.
6. O rolo suíço pode ser usado para vários exames histopatológicos, incluindo coloração convencional de hematoxilina e eosina (H & E), imuno-histoquímica e imunofluorescência.

5. Colheita de tecidos para isolamento de proteínas e RNA de tumores e cólon circundante

1. Trabalhe no gelo e use tubos e reagentes pré-resfriados para preservar a integridade do material biológico.
2. Após a avaliação do tumor, disseque os tumores e colete-os em tubos pré-resfriados e pré-marcados com tampão apropriado (veja abaixo) no gelo. Dependendo do desenho experimental, agrupe todos os tumores do mesmo animal ou processe-os individualmente. Se desejar, colete da mesma forma pedaços de ~ 1 cm de tecido do cólon não tumoral circundante.
3. Isolamento de proteínas
   1. Adicione 0,5 mL de esferas de vidro de moagem de 800 μm e 400 μL de tampão de lise (1% NP-40 em 150 mM NaCl com 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 1% de coquetel de protease e inibidor de fosfatase em cada tubo de homogeneização tecidual e transfira o tecido cólon/tumoral para cada tubo.
   2. Homogeneizar o tecido do cólon / tumor usando um homogeneizador de tecido à base de contas a 6 M / S por 30 s, repita duas vezes para homogeneização completa.
      NOTA: Coloque os tubos no gelo entre os ciclos para evitar o superaquecimento da amostra devido à homogeneização mecânica.
   3. Após a homogeneização, aspirar 150 μL do lisado (sobrenadante) e transferir para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL.
   4. Girar o lisado a 10.000 g a 4 °C para granular qualquer material insolúvel. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo, se desejar.
   5. Quantificar a concentração total de proteínas por ensaio de ácido bicinconínico (BCA) ou outro método apropriado.
   6. Se desejar, ajuste a concentração total de proteína para 4 mg / mL para cada amostra com o mesmo tampão de lise.
   7. Use lisados de proteínas imediatamente para ensaios a jusante, como immunoblotting ou análise de citocinas, ou armazene a -80 ° C para uso posterior.
4. Purificação de RNA:
   1. Após a dissecção, coloque o cólon / tumores em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e mergulhe em 200 μL de reagente de preservação de RNA apropriado.
      NOTA: Ponto de pausa: o tecido fresco do cólon / tumor pode ser congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C para processamento posterior
   2. Descongele o tecido do cólon / tumor no gelo.
   3. Transfira o cólon/tumor para um tubo de homogeneização de tecido contendo 500 μL de tampão de lise apropriado adequado para isolamento de RNA e 200 μL de esferas de vidro de moagem.
   4. Homogeneizar usando um homogeneizador de tecido à base de grânulos a 6 M/S por 30 s três vezes, com um intervalo de dois minutos entre cada ciclo.
      NOTA: Transfira o tubo no gelo entre os ciclos para evitar que a degradação do RNA superaqueça durante a homogeneização mecânica.
   5. Transfira 300 μL de lisado para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   6. Isolar o RNA total utilizando o procedimento de purificação de ARN adequado, se necessário. Meça a concentração, pureza e qualidade/integridade do RNA conforme apropriado para uso a jusante.

Resultados

Realizamos a otimização da dose de DSS para nossas condições experimentais. A dosagem de DSS precisa ser recalibrada para cada instalação de animais, cepa de camundongo, projeto de estudo e lote de DSS. Para este estudo, camundongos C57BL / 6J foram alojados em um biotério livre de patógenos específicos em gaiolas ventiladas com dieta de roedor de 18% de proteína irradiada ad libitum padrão. Camundongos machos e fêmeas começam a perder peso a partir do dia 5 após serem colocados na água DSS, atingindo seu peso mais baixo três dias após a retirada do DSS (Figura 1A, C). No dia de maior perda de peso, os camundongos machos exibiram aproximadamente 15% de perda de peso, enquanto as fêmeas apresentaram cerca de 20% de perda de peso (Figura 1B, D). Com base nesses resultados, determinamos que a dose ideal para nossas condições experimentais específicas era de 3,0% para fêmeas e 3,25% para machos. O cronograma de tratamento para AOM/DSS é descrito na Figura 2A, com a homogeneização do microbioma ocorrendo no início de cada ciclo de tratamento DSS até que o experimento seja concluído para mitigar os efeitos e a variabilidade da gaiola. A dinâmica típica de perda de peso e recuperação animal durante toda a duração do experimento é mostrada na Figura 2B. Os animais recuperam totalmente o peso corporal original dentro de duas semanas após a descontinuação da administração de DSS. Um modelo de colite DSS bem calibrado resulta em bolinhas de fezes moles, mas ainda formadas, em vez de diarreia (escore de consistência das fezes 1-2), com detecção ocasional de sangue oculto nas fezes indicativo de sangramento subclínico e poucos casos de sangue visível nas fezes (escore de presença de sangue 1-2)¹⁷. Para avaliar melhor a gravidade da colite, amostras fecais foram coletadas para analisar os níveis de lipocalina-2 do marcador inflamatório. A presença de sangue oculto não foi detectada em camundongos que receberam água potável regular durante todo o experimento, ao contrário dos animais tratados com DSS (Figura 2C). Consistentemente, os níveis de lipocalina-2 foram elevados aproximadamente 1.000 vezes em camundongos tratados com AOM / DSS em comparação com controles somente com AOM / água (Figura 2D).

No desfecho, dissecamos os dois pontos e contamos os tumores usando um mapa de registro tumoral (Figura 3A). A colite DSS resulta em um comprimento de cólon significativamente menor, ao contrário dos controles AOM/somente água (Figura 3B). Além disso, os animais tratados com AOM / DSS desenvolvem tumores de cólon visíveis, a maioria dos quais se forma na extremidade distal ( Figura 3C ). O exame histológico das seções do cólon coradas com H & E revelou erosão significativa das células epiteliais, infiltração imune e ulceração em camundongos AOM / DSS (Figura 4A). A gravidade da histopatologia do cólon pode ser quantificada usando sistemas de pontuação estabelecidos para CAC murino induzido por DSS, com base em quatro parâmetros (Figura 4B): infiltração imune e edema (0-3), ulceração (0-3), morfologia epitelial do cólon (0-4) e neoplasias (0-4)22,23,24. Os resultados de tais avaliações, aplicados a exemplos histológicos na Figura 4A, são apresentados na Figura 4C. A proliferação epitelial do cólon foi avaliada por meio de análise imuno-histoquímica usando coloração Ki67, demonstrando que o tratamento com DSS promove proliferação de células epiteliais do cólon. Além disso, os cortes de cólon podem ser utilizados para coloração imunofluorescente de vários marcadores, como o marcador de angiogênese CD31 (Figura 4D, E).

Avaliamos ainda os efeitos da homogeneização da microbiota em desfechos experimentais, como a magnitude da inflamação colônica, perda de peso corporal e carga tumoral cumulativa em cada animal. Um grupo de camundongos foi alojado em gaiolas que foram submetidas à mistura e redistribuição de camas sujas no Dia 0 para obter a homogeneização da microbiota, ao lado de animais de controle em gaiolas em que essa manipulação foi omitida. Os animais de ambos os grupos receberam 2,5% de água DSS por 7 dias. Embora os níveis médios do marcador inflamatório lipocalina-2 nas fezes por gaiola no dia 8 não tenham diferido significativamente entre os grupos (teste t de Welch), observamos uma variabilidade significativamente menor entre os pontos de dados em gaiolas que sofreram homogeneização da microbiota (Figura 5A, teste F de Welch para comparar variâncias, p<0,0001). Consistentemente, no dia 8, todos os animais exibiram uma extensão semelhante de perda de peso corporal em comparação com a linha de base do dia 0. No entanto, os camundongos do grupo de homogeneização da microbiota mostraram menos variabilidade na perda de peso corporal em comparação com o grupo controle (Figura 5B). Além disso, em um protocolo de indução de CAC de 10 semanas (Figura 2A) com (homogeneização da microbiota) e sem mistura de cama de gaiola (controle) antes de cada ciclo de DSS, a carga tumoral cumulativa por camundongo foi mais consistente no grupo homogeneizado da microbiota em comparação com os controles que eram significativamente mais variáveis (Figura 5C). No geral, esses dados fornecem fortes evidências de que a homogeneização da microbiota melhora fortemente a robustez e a reprodutibilidade do modelo AOM/DSS.

Figura 1. Titulação da dose de DSS em camundongos machos e fêmeas. (A-D) Porcentagem de alteração do peso corporal em comparação com o dia 0 em camundongos machos (A, B) e fêmeas (C, D) C57BL/6J de 14 semanas de idade mantidos na água com concentrações indicadas de DSS (1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% para machos e 2%, 3%, 4% para fêmeas). (A, C) Os animais receberam DSS por 7 dias e monitorados quanto à perda de peso corporal por até 12 dias. B e D mostram perda de peso corporal de camundongos machos no dia 8 (B) e camundongos fêmeas no dia 9 (D) desde o início do tratamento com DSS. Os dados são apresentados como médias ± SEM; n=3 em A & B, n=4 em C & D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Linha do tempo e monitoramento do CAC induzido por AOM/DSS. (A) Linha do tempo experimental do CAC induzido por AOM/DSS. (B) Peso corporal relativo ao dia 0 em camundongos C57BL/6J fêmeas experimentais tratados com AOM/DSS (vermelho) ou controle (somente AOM, sem DSS, preto). Todos os animais receberam uma dose de OMA (10 mg/kg) e foram randomizados para três ciclos de DSS a 3% (vermelho) ou água potável normal (controle, preto) por um total de 70 dias. Os dados são apresentados como médias ± EPM, n=2 e 11. (C) Teste de hemocultura fecal de camundongos fêmeas de controle (somente AOM) ou tratados com DSS (AOM e 1,5% DSS). (D) Níveis fecais de lipocalina-2 de 6 camundongos fêmeas controle (somente OMA, preto) ou 35 tratados (OMA e 1,5% DSS, vermelho) no dia 70. Os dados são apresentados como médias ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Avaliação macroscópica do cólon. (A) Exemplo de um mapa de registro de tumor. (B) Imagens representativas do cólon de camundongos fêmeas de controle (somente AOM) ou tratados com DSS (AOM e 1,5% DSS) no dia 70. O encurtamento do comprimento do cólon indica maior inflamação em animais tratados com DSS. Barra - 5 mm; , p=0,002, teste de soma de postos de Mann-Whitney; n=12 & 30. (C) Imagens representativas de patologia macroscópica de cólon com tumores no dia 70 de camundongos fêmeas tratados com OMA e DSS a 3% (os tumores são circulados e marcados com triângulos pretos). Barra - 5 mm. Texto explicativo - visão ampliada das regiões do cólon distal com tumores; barra - 1 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Avaliação histológica da CAC. (A) Seções representativas coradas com H & E de cólon laminado na Suíça de camundongos tratados com AOM / DSS e controle (somente AOM) no dia 70 com regiões distais aumentadas de 3 animais exibidos à direita. Os dois pontos de controle mostram a organização intacta da cripta colônica. Os cólons de camundongos tratados com AOM / DSS são caracterizados por espessamento submucoso (pontas de setas), infiltração imunológica (setas), ruptura ou perda da arquitetura da cripta (estrela), erosão da camada epitelial, hiperplasia epitelial ou epitélio displásico (círculos) com adenoma e formação de adenocarcinoma (delineado por linha pontilhada). Barra - 500 μm. (B) Sistema de pontuação histopatológica usado para avaliar a gravidade do fenótipo CAC. (C) Exemplo de escores de histologia do cólon de camundongos tratados apenas com AOM ou AOM / DSS mostrados em A. (D) Coloração imuno-histoquímica representativa para o marcador de proliferação Ki67 em cólon suíço de animais tratados com OMA após 1 ou 3 ciclos de DSS. As células positivas para Ki67 em proliferação (marrons) localizam-se na parte inferior das criptas colônicas, mas se espalham para cima e invadem dentro das criptas com iniciação de CAC e patologia mais avançada. Bar - 100 μm. (E). Coloração imunofluorescente representativa avaliando a vascularização com base no marcador endotelial CD31 (vermelho) e contracorada com DAPI para visualizar núcleos (azul) em seções de cólon de camundongos tratados com AOM/DSS. Bar - 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. A homogeneização da microbiota reduz a variabilidade na inflamação do cólon e na carga tumoral de CAC. (A) Níveis médios de lipocalina-2 fecal em camundongos tratados com DSS a 2,5% no dia 8. A análise estatística foi realizada usando o teste t de Welch para comparar os níveis médios de lipocalina-2 fecal entre os dois grupos (p = 0,137, n = 6 e 12 gaiolas). Além disso, foi realizado um teste F sobre variâncias, resultando em um valor de p de 0,0001, indicando diferenças significativas na variância entre os dois grupos. (B) Perda média de peso corporal em animais tratados com AOM/DSS que receberam água DSS no dia 8. Embora a perda média de peso corporal entre os dois grupos não seja significativamente diferente (teste t de Welch, p = 0,194, n = 6 e 12), a variância dentro dos grupos é significativamente diferente (teste F, p = 0,027). (C) Carga tumoral por camundongo após 10 semanas de tratamento com AOM/DSS. A análise estatística foi realizada usando o teste t de Welch para avaliar as diferenças na carga tumoral média entre os grupos (p = 0,211, n = 8 e 18) e um teste F para avaliar a diferença entre as variâncias (p = 0,013). (AC) Os gráficos de violino azul representam o grupo que passou pela homogeneização da microbiota, enquanto os gráficos de violino verde representam o grupo controle (sem homogeneização da microbiota), ns - não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo AOM/DSS foi introduzido pela primeira vez em 1996 por Okayasu et ^al.25 e desde então tem sido reconhecido como um excelente modelo para imitar fielmente a iniciação e progressão do câncer de cólon de tecido normal para alterações adenomatosas e, finalmente, carcinoma, como demonstrado por Suzuki et al. em 2006²⁶, especialmente no contexto da inflamação do cólon. Estudos subsequentes avaliaram os efeitos de AOM e AOM / DSS em diferentes cepas de camundongos, bem como o impacto de durações de tratamento variáveis no fenótipo e penetrância do tumor^{26 , 27 , 28} . Em 2018, Christopher Williams e seu grupo publicaram um protocolo atualizado²⁹ que estabeleceu uma base crucial para o desenvolvimento dessa metodologia. Avanços recentes demonstraram ainda mais a utilidade do modelo AOM/DSS para os estudos da imunidade da mucosa, integrando métodos de isolamento de infiltrados imunes intestinais e imunofenotipagem via citometria^{de fluxo 30}.

Um dos principais pontos fortes do protocolo AOM / DSS está na fácil adaptabilidade a praticamente qualquer cepa de camundongos, levando à investigação dos efeitos de diferentes origens genéticas. Assim, Suzuki et al. compararam a suscetibilidade à carcinogênese do cólon induzida por AOM/DSS em quatro cepas diferentes de camundongos usando a penetrância do adenoma do cólon como leitura, com os seguintes resultados: BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN²⁶. Estudos adicionais descobriram que camundongos FVB/N desenvolvem tumores de cólon mais prontamente após tratamento repetido com OMA em comparação com as cepas C57BL/6J e 129/SvJ²⁷. Notavelmente, o desenvolvimento de adenocarcinoma de cólon bem diferenciado com quase 100% de penetrância foi relatado em camundongos FVB / N em um protocolo de indução AOM / DSS CAC de 10 semanas³¹. Esses achados sugerem coletivamente que diferentes cepas de camundongos podem não ser igualmente suscetíveis ao tratamento com AOM / DSS, contribuindo para variações na tumorigênese e destacando ainda mais a necessidade de um conjunto consistente de diretrizes para a harmonização e reprodutibilidade do protocolo AOM / DSS entre cepas de camundongos, instalações de alojamento e outras variáveis. Dentre eles, a variabilidade significativa no microbioma intestinal dificulta a reprodutibilidade de estudos focados na inflamação e na penetrância tumoral ^9,10. Especificamente, a composição do microbioma intestinal, incluindo as espécies Duncaniella muricolitica e Alistipes okayasuensis, pode ter um impacto desproporcional na gravidade da colite DSS¹³. Outro estudo destacou a importância da composição da microbiota na indução de CAC, demonstrando que camundongos deficientes em NLRP3 exibiram um fenótipo de colite exacerbada caracterizado por uma presença aumentada dos filos bacterianos Bacteroidetes (especificamente Prevotellaceae) e TM7¹⁰.

Apesar da popularidade do método, os protocolos AOM/DSS existentes não abordaram a questão significativa da alta variabilidade observada entre os animais dentro dos grupos experimentais³². Para enfrentar esse desafio, apresentamos um conjunto de recomendações para otimização e harmonização de protocolos, implementando a titulação DSS (levando em consideração o sexo do animal) e a homogeneização da microbiota. Nossa abordagem visa reduzir a variabilidade e aumentar a reprodutibilidade do modelo AOM/DSS em cepas animais, projetos experimentais e endpoints. Embora não possamos fornecer recomendações específicas sobre o tamanho das amostras, o número de réplicas experimentais será guiado pelo desenho específico do estudo e pelos tamanhos de efeito esperados para cada experimento. A menor variabilidade dentro do grupo alcançada por esses refinamentos requer menos animais em cada condição para atingir o mesmo poder estatístico na detecção dessas diferenças. Prevemos que essas melhorias promoverão ainda mais o uso ético de animais, a administração responsável de fundos de pesquisa e a redução da mão de obra, levando a uma maior eficiência.

O modelo AOM/DSS tem valor translacional significativo no estudo do câncer colorretal associado à colite humana. Dados os desafios de modelar o CCR humano devido à sua etiologia complexa, é importante enfatizar que, embora o modelo AOM/DSS possa fornecer alguns insights sobre a patogênese do CCR esporádico, ele é mais apropriado para estudos sobre malignidade associada à inflamação. Além disso, o câncer induzido por AOM/DSS tem baixa incidência de metástase ^33,34 e, portanto, é inadequado para estudar a disseminação metastática. Apesar dessas limitações, o modelo AOM/DSS é altamente penetrante, confiável, demonstra histopatologia relevante para humanos e imita com precisão a progressão da doença de inflamação para displasia e adenocarcinoma, ao mesmo tempo em que permanece custo-efetivo. Neste protocolo, fornecemos recomendações para gerar resultados reprodutíveis e minimizar fatores de confusão com base nos fluxos de trabalho existentes ^8,35.

A identificação da dosagem ideal de DSS por meio de experimentos piloto de dose-resposta, levando em conta o sexo do animal como uma variável biológica 16,36,37, é o primeiro passo crítico para o estabelecimento de um protocolo robusto de AOM/DSS (Figura 1). Descobrimos que o tratamento com DSS a 3% por 7 dias resultou em uma diminuição mais significativa no peso corporal em mulheres (~ 20%) em comparação com homens (~ 15%) (Figura 1B, D). No entanto, os camundongos machos podem ser mais, menos ou igualmente sensíveis à SDS em comparação com as fêmeas. Isso pode ser atribuído a diferentes cepas de camundongos e variações na composição do microbioma intestinal em instalações de animais, necessitando de reajuste da concentração de DSS adaptada a cada conjunto específico de experimentos. A concentração ideal de DSS é uma troca entre maximizar a inflamação do cólon e a indução do tumor sem exceder a toxicidade tolerável. Em nossa experiência, esse equilíbrio é provavelmente alcançado em doses de DSS, resultando em perda de peso corporal de aproximadamente 20% após o primeiro ciclo. Os animais tendem a perder menos peso no segundo ciclo de tratamento, mas uma maior redução no peso corporal é geralmente observada no terceiro ciclo da SDS, potencialmente devido à formação de tumores no cólon. Portanto, a perda de peso corporal de 25% pode ser adotada como um desfecho humano para protocolos institucionais de uso de animais. Além disso, a colite por DSS bem calibrada resulta em bolinhas de fezes moles, mas ainda formadas, em vez de diarréia e teste hemoccultista positivo ocasional, mas poucos casos de traços de sangue visíveis nas fezes, com os animais esperados para se recuperarem completamente dentro de duas semanas após a interrupção da administração de DSS.

O DSS é um polímero com peso molecular que varia de 36.000 a 50.000 Da. Devido à variabilidade de lote para lote na fabricação do DSS, é essencial realizar experimentos de recalibração de dose de DSS para cada novo lote do produto. Para manter a consistência, é prático estimar a quantidade total de DSS necessária para que todo o estudo seja comprado no mesmo lote. Além disso, este protocolo também descreve etapas para padronizar a composição da microbiota em toda a coorte experimental de camundongos durante a indução do CAC, mitigando assim os efeitos potenciais da gaiola para reduzir a variabilidade. Como precaução adicional para minimizar os efeitos na gaiola, recomenda-se que animais de diferentes grupos experimentais sejam co-alojados sempre que possível. Dependendo dos objetivos experimentais específicos e das políticas éticas de uso de animais, essas considerações devem ser refletidas em experimentos piloto. A deriva da microbiota também pode ser precipitada por mudanças de cama em uma gaiola úmida com vazamento de garrafas de bebida. É melhor abster-se de trocas de gaiola durante o parto de SAD e por cinco dias depois. O uso de tubos de 50 mL para administração de água DSS reduz o risco de vazamento e minimiza o desperdício de DSS. Essas considerações logísticas podem exigir uma estreita colaboração entre a equipe de pesquisa e os técnicos de cuidados com os animais que realizam serviços de troca de gaiolas e manejo.

Neste protocolo, também fornecemos um fluxo de trabalho básico para coleta de tecidos e células, bem como coleta de dados. Isso inclui testes para a presença de sangue oculto (Figura 2C) e mapeamento de tumores (Figura 3A). O modelo AOM/DSS é adequado para camundongos imunocompetentes, tornando-o um sistema ideal para explorar o microambiente imunológico tumoral devido ao sistema imunológico totalmente intacto^38,39, em contraste com as abordagens de xenoenxerto. Notavelmente, é passível de perturbação experimental do sistema imunológico ou componentes estromais, seja por meio de um sistema Cre-Lox genético para knock-ins / outs de genes específicos do tipo de célula ou repórter, ou enxerto ou depleção de populações de células específicas. Como exemplo, combinando o modelo AOM/DSS com transplante de medula óssea, investigamos anteriormente como mutações no sistema hematopoiético modulam a gravidade e a carga da CAC⁴⁰. Para auxiliar em tais estudos, existem excelentes métodos publicados para isolar leucócitos infiltrantes tumorais viáveis adequados para análises posteriores, como imunofenotipagem, ensaios funcionais e multiômica de célula única⁴¹. Finalmente, devido à alta penetrância e latência consistente, o modelo AOM/DSS é adequado para estudos terapêuticos pré-clínicos usando a carga tumoral total como leitura primária.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pó de azoximetano	Sigma-Aldrich	CAS 25843-45-2, Cat# A4586	Carcinógeno para induzir tumores de cólon
Microcentrífuga de bancada	NA&	nbsp; NA	Para preparação de amostras
Camundongos C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	Tensão e idade conforme apropriado para cada estudo específico
Tubos cônicos, 50 mL	Fisher	14955239	Para administrar água DSS
Sal de sódio sulfato de dextrano, MW ca 40.000	Cayman Chemical	23250	Para induzir a inflamação do cólon
Etanol, 70%	Fisher	43655223	Para higienizar superfícies de trabalho e ferramentas de dissecação
Moagem de contas de vidro, 800 µ m	VWR	12621-148	Para facilitar a homogeneização do tecido do cólon/tumor
HemoCue America  Kit de Teste de Sangue Oculto Fecal Oculto Hemoccult ICT Hemoccult da Beckman Coulter	HemoCue America 395065A	Catálogo No.23280010	Para detecção de sangue oculto nas fezes
Seringa de Insulina 27GX5/8 1CC	BD	3294-12	Para injeções de AOM
Bloqueador de lixit	NA	NA	Para bloquear a entrega automatizada de água às gaiolas de camundongos, se presente (fornecido pela instalação animal, estéril)
Barra de agitação magnética e placa de agitação	NA		NA Para dissolver DSS
Homogeneizador de Contas Microtubo, BeadBlaster 24	Benchmark	D2400	Para homogeneizar o cólon / tumor
Camundongo Lipocalin-2 / NGAL DuoSet ELISA	R & Catálogo D Systems	No.DY1857	Para detectar a lipocalina-2 a partir de amostras fecais
Solução NP-40, 10%	Thermo Fisher Scientific	85124	Para lise tumor/tecido de cólon
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A65453	Para quantificar a concentração de proteína em lisados totais de tecidos, ou qualquer outro método apropriado
Coquetel de inibidores de protease e fosfato	Fisher	PI78440	Para preparar amostras para análise de citocinas/proteínas
Tampão RLTplus	Qiagen	1053393	Para isolar RNA, ou qualquer outro método apropriado de isolamento
RNA RNAlater	Thermo Fisher Scientific	AM7021	Para preservar amostras de tecido antes do isolamento de RNA
Kit RNeasy Microprep	QIAGEN	74004	Para isolar RNA, ou outro método de isolamento e purificação de RNA conforme apropriado
Bocal de Garrafa de Água para Roedores (30mm)	Vision	Type E	Para administrar água ou solução DSS
Tesouras e fórceps estéreis	NA	NA	Para dissecção de tecidos
Agulhas de seringa, 27G x 1/2in de comprimento (curto)	BD	305109	Para fixação de tecido de rolo suíço de cólon
Seringas, Luer lock, 3 mL	BD	309657	Para lavar os cólon antes da dissecção e estadiamento
TapeStation	Agilent		Para concentração de RNA e avaliação de qualidade/integridade
Teklad 2918	Evigo Bioproducts	T.2918M.15	Dieta padrão para roedores, 18% de proteína, irradiada
de tecido	VWR	#87002-472	Para preservar a amostra para incorporação
Balança de laboratório de carregamento superior, 0-220 g	NA	NA	Para pesar animais
Papel absorvente Whatman	VWR International	Cat# 28298-020	Para encenar cólon dissecado para patologia macroscópica e contagem de tumores