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Artigo de método

Fibroblastos Associados ao Câncer de Tumores Mamários de Camundongos como Ferramentas para Estudos Moleculares e Computacionais

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DOI:

10.3791/68364

⸱

3 de julho de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve métodos para cultivar, manipular e analisar CAFs murinos, incluindo ensaios funcionais in vitro / in vivo , transcriptômica e análise computacional. Além disso, descreve uma plataforma baseada na web desenvolvida para analisar os transcriptomas publicamente disponíveis de componentes estromais e epiteliais microdissecados por captura a laser de uma coleção de tumores de câncer de mama humano.

Resumo

Um corpo de pesquisa convincente confirmou o papel crítico do microambiente tumoral (TME) no crescimento e agressividade do câncer de mama (CM). Os fibroblastos associados ao câncer (CAF), o componente celular predominante do TME, influenciam significativamente seu comportamento por meio de crosstalk complexo com câncer e outras células estromais em resposta a sinais de ativação derivados do tumor. Modelos murinos são amplamente utilizados para investigar os mecanismos subjacentes ao papel do CAF na progressão do CM, pois permitem a avaliação do TME endógeno e a avaliação do envolvimento do sistema imunológico usando estudos de xenoenxerto singênico. Aqui, apresentamos um conjunto de métodos para cultivar CAFs derivados de BC, manipular a expressão gênica e avaliar suas funções pró-tumorigênicas usando abordagens in vitro e in vivo . Também descrevemos protocolos para perfil de expressão gênica CAF e análise transcriptômica, juntamente com um procedimento computacional para inferir assinaturas transcricionais em tumores primários usando dados de RNA-seq em massa disponíveis publicamente. Além disso, apresentamos uma ferramenta baseada na web fácil de usar para analisar os transcriptomas de componentes estromais e epiteliais de tumores BC microdissecados por captura a laser. Em última análise, esses métodos podem fornecer informações valiosas sobre os mecanismos moleculares que impulsionam as interações CAF-tumor e têm potencial para identificar novos alvos terapêuticos.

Introdução

O câncer de mama (CM) é a neoplasia maligna mais comum que afeta as mulheres e é caracterizado por significativa heterogeneidade molecular, com perfis moleculares distintos orientando o diagnóstico, as decisões de tratamento e o prognóstico. O microambiente tumoral (TME) também é altamente heterogêneo e desempenha um papel crítico na progressão do tumor, imunidade e resultados do tratamento.

Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são o tipo de célula mais abundante no TME e os principais reguladores do desenvolvimento do tumor. Eles contribuem para a deposição e remodelação da matriz extracelular, angiogênese, evasão imunológica e resistência aos medicamentos 1,2,3,4,5,6. Os CAFs influenciam as células tumorais por meio do contato direto célula-célula, da liberação de vesículas extracelulares7 e da secreção de vários fatores solúveis 2,5 para promover o crescimento tumoral, invasão e resistência à terapia 8,9,10. De fato, as assinaturas gênicas relacionadas ao estroma têm valor preditivo para a progressão do CM e a resposta à terapia e estão associadas à resistência à quimioterapia 11,12,13,14. No entanto, apesar de evidências substanciais sugerindo CAFs como um alvo terapêutico atraente, os ensaios clínicos direcionados a essas células falharam em grande parte15. Um grande desafio é a compreensão limitada dos mecanismos moleculares pelos quais os CAFs modulam o comportamento do tumor. Avanços recentes em análises transcriptômicas espaciais e de célula única forneceram insights mais profundos sobre a complexidade dos CAFs em BC 16,17,18,19,20,21, permitindo a identificação de subtipos distintos de CAF com programas funcionais específicos 16,22 e destacando ainda mais sua complexidade e plasticidade23.

Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs), nos quais oncogenes ou genes supressores de tumor são superexpressos ou inativados, são modelos bem estabelecidos para estudar o câncer humano 24,25,26,27. Em comparação com os modelos singênicos, que envolvem o enxerto de células tumorais em camundongos do tipo selvagem23,28, os GEMMs imitam com mais precisão a progressão em várias etapas do BC e as interações entre as células cancerígenas e o TME. A manipulação das atividades dos CAFs em GEMMs tem sido, no entanto, desafiadora devido à sua heterogeneidade, o que dificulta o direcionamento de todos os subtipos de CAF sem efeitos fora do alvo em outros componentes estromais ou epiteliais5. A combinação de GEMMs com abordagens complementares, como manipulação in vitro de CAF, pode ajudar a gerar modelos celulares para experimentos de perda de função em ambientes in vitro e in vivo. No entanto, o desenvolvimento de modelos celulares estáveis para explorar os papéis funcionais de genes específicos continua sendo um desafio devido ao rápido início da senescência.

Aqui, descrevemos uma plataforma robusta para experimentos estáveis de perda de função em CAFs, seguidos de análise funcional in vitro e in vivo e perfil transcricional das células projetadas; essa abordagem oferece uma estratégia abrangente para dissecar a relevância funcional dos genes expressos por CAF no câncer de mama, com vantagens em especificidade, reprodutibilidade e adaptabilidade em relação aos métodos existentes. Essa abordagem também é complementada por uma nova ferramenta baseada na web para explorar transcriptomas de compartimentos estromais e epiteliais microdissecados por captura a laser de tumores de mama humanos, permitindo comparações entre espécies e facilitando a geração de hipóteses a partir de dados humanos.

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Protocolo

Este estudo está em conformidade com todas as diretrizes institucionais relativas ao manuseio de camundongos e amostragem de tecidos. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as leis e políticas nacionais e internacionais. Os camundongos foram alojados em uma unidade transgênica livre de patógenos específicos sob um ciclo claro/escuro de 12 h a 22 °C com 50% de umidade e receberam comida e água ad libitum. Os procedimentos cirúrgicos devem seguir as instruções veterinárias institucionais para garantir anestesia e analgesia adequadas, tanto durante o procedimento quanto no pós-operatório. A Tabela de Materiais fornece detalhes sobre materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Cultura de células

  1. Células de cultura a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2 com 95% de umidade relativa, em DMEM (HEK293T, CAFs e CAFs imortalizados (iCAFs)) ou meio RPMI (4T1), suplementado com 100 U/mL de Penicilina, 100 μg/mL de Estreptomicina (1% Pen/Strepto).
    NOTA: Composição completa do meio (cDMEM, cRPMI): 10% de FBS inativado por calor, composição do meio de inanição (sDMEM, sRPMI): sem FBS. Tempos médios de duplicação para células: HEK293T e iCAFs são de 24 h; As células 4T1 são 12h.
  2. Células de passagem ao atingir 80% de confluência, na proporção não superior a 1:5, nunca mais do que 10 vezes após o descongelamento para evitar deriva fenotípica, conforme descrito abaixo.
    1. Aspire o meio e adicione suavemente 7 mL de PBS ao lado de um prato de 100 mm. Aspire o PBS, adicione 1 mL de tripsina-EDTA. Incube por 2-3 min a 37 °C.
      CUIDADO: O EDTA está listado como um composto perigoso de categoria 2 para irritação ocular. Manuseie um exaustor biológico usando EPI adequado.
    2. Inative a tripsina-EDTA com 5 mL de cDMEM, desprenda as células pipetando para cima e para baixo e colete em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue a 290 x g por 5 min.
    3. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mL de cDMEM. Para uma divisão de 1:5, semeie 1 mL de células ressuspensas em um prato de 100 mm contendo 9 mL de cDMEM.
  3. Contagem de células: Carregue 10 μL da suspensão celular da etapa 1.2.3 na lateral de uma câmara de contagem de Neubauer, conte as células nos quadrados grandes e multiplique o número obtido por 1 x 104 para calcular o número de células contidas em 1 mL de suspensão celular.
  4. Criopreservação: Congele 50% de um prato de 100 mm (cerca de 3 x 106 células) em 0,5 mL de meio de congelamento gelado (10% de DMSO em FBS inativado por calor) conforme descrito abaixo.
    1. A partir de uma placa de 100 mm, tripsinizar as células conforme descrito nas etapas 1.2.1 e 1.2.2, exceto que as células são ressuspensas em 1 mL de meio de congelamento gelado.
    2. Dispense 0,5 mL em cada criogenia e coloque a -80 ° C em um recipiente, garantindo uma taxa de resfriamento de cerca de 1 ° C / min. Cada alíquota pode ser descongelada em um prato de 100 mm.
  5. Teste de contaminação por micoplasma: Colete 1 mL de meio de cultivo de células confluentes cultivadas por pelo menos 3 dias. Ferva a 95 °C por 20 min. Gire a 16200 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT). Adicione 5 μL de sobrenadante a 45 μL de mistura de reação de PCR (0,15 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 1x tampão de reação, 1 U Taq polimerase, 0,5 μM primers A e B, consulte a Tabela 1). Realize PCR, incluindo controles positivos e negativos, e separe os produtos de PCR em um gel de agarose a 1% junto com uma escada de DNA. Amostras contaminadas com micoplasma mostrarão uma banda de 600 pb.

2. Isolamento de CAFs de tumores mamários

NOTA: Esta etapa é otimizada para tumores em estágio avançado de 5 a 10 mm de diâmetro (consulte a referência29 ).

  1. Sacrifique o rato por luxação cervical. Isole os tumores mamários de pelo menos 125 mm3. Extirpar o tumor com cuidado, removendo a pele circundante, o tecido mamário e as áreas necróticas visíveis. Usando uma pinça, colete em um microtubo de 1,5 mL colocado no gelo.
  2. Pese o tumor com uma balança de precisão, retire um pedaço cúbico de 0,1-0,3 g com um bisturi, transfira para um novo microtubo de 1,5 mL cheio de PBS gelado e mantenha no gelo. Certifique-se de que o tecido esteja submerso para evitar a desidratação.
  3. Transfira para um prato de 60 mm de diâmetro, sobre gelo. Pique finamente 1 mL de PBS com um bisturi até obter pedaços de aproximadamente 1-2 mm.
  4. Transferir para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL por 0,1 g de tumor em cDMEM mais 10 μg/mL de colagenase. Lave o prato com 1 mL do mesmo meio, usando uma pipeta P1000 com ponta cortada para evitar danos às células. Prenda a tampa com uma película de vedação para evitar vazamentos.
  5. Incubar horizontalmente durante 1 h a 37 °C num agitador orbital. Colocar um filtro de células de 70 μm em cima de um tubo cónico de 50 ml e transferir o homogeneizado com uma pipeta serológica de 10 ml. Use a parte de trás de um êmbolo de seringa de 5 mL para moer e empurrar a amostra através do filtro.
  6. Use cDMEM (não excedendo 30 mL de volume final) para recuperar tudo do filtro. Centrifugar as células a 129 x g a 4 °C durante 10 min e rejeitar o sobrenadante.
  7. Adicione 3 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) para remover os glóbulos vermelhos (RBC). Feche bem os tubos e misture por inversão. Incube por 5 min em RT em um agitador orbital.
  8. Pare a lise de hemácias adicionando PBS a um volume final de 30 mL. Centrifugar as células a 129 x g a 4 °C durante 10 min e rejeitar o sobrenadante.
  9. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de cDMEM e conte as células viáveis como na etapa 1.3 usando 10 μL de azul de metileno: as células vivas reduzem o corante a um produto incolor e não ficam coradas, enquanto as células mortas são coradas de azul.
  10. Semeie 5 x 105 células /60 mm em 5 mL de cDMEM, incube 20 min a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 , colete células não aderentes e recoloque-as durante a noite.
  11. Após 48 h ou 72 h, realizar tripsinização diferencial. Como os fibroblastos se desprendem mais rapidamente do que as células epiteliais e mioepiteliais30, proceda conforme descrito na etapa 1.2. mas monitore de perto o descolamento celular sob um microscópio. As células em forma de fibroblasto se tornarão redondas e se desprenderão enquanto as células epiteliais permanecerão presas.
  12. Adicionar cDMEM para inativar a tripsina e coletar CAFs destacados, transferindo-os para uma nova placa de 60 mm em 5 mL de cDMEM. Passe CAFs primários 1:3 (consulte a etapa 1.2) para três passagens e, em seguida, prepare alíquotas congeladas de passagem antecipada conforme descrito na etapa 1.4.

3. Imortalização por transdução viral

NOTA: Algumas das etapas a seguir devem ser executadas em um ambiente adequado para o manuseio de vetores retrovirais (por exemplo, BSL2+); Verifique suas regras institucionais.

  1. Preparação do vírus recombinante
    1. Cultive HEK293T células e verifique se há contaminação por micoplasma (consulte a etapa 1).
    2. Cubra uma placa de 100 mm de diâmetro pipetando 6 ml de uma solução de poli-L-lisina a 0,1 mg/ml em ddH2O durante 5 min em RT, aspire e deixe secar sob o capô (cerca de 10 min).
    3. Semeie 3 x 106 HEK293T células (passagem baixa, micoplasma negativo) em 10 mL de cDMEM na placa revestida de poli-L-lisina da etapa 3.1.2 (consulte a etapa 1.3).
    4. No dia seguinte, prepare dois tubos contendo 0,75 mL de meio otimizado para transfecção sem antibióticos. A um deles, adicione 30 μL de reagente de transfecção mediado por lipídios catiônicos (T1). Ao segundo, adicione 2 μg de pCL-Ampho (vetor de embalagem retroviral) e 2 μg de vetor cDNA pBABE-neo largeT retroviral (T2). Adicione T2 a T1, misture delicadamente e incube por 10 min.
    5. Distribua uniformemente o meio sobre as células após substituí-lo por meio otimizado para transfecção sem antibióticos + 10% de FBS inativado por calor. Mova a placa para uma instalação de cultura de tecidos de nível de biossegurança 2+ (BSL-2+). Substitua o meio por cDMEM após 6-12 h e incube as células por 24-48 h.
    6. Filtrar o meio que contém as partículas pseudovirais através de um filtro de seringa de 0,45 μm e conservar a 4 °C durante alguns dias ou a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
  2. Transdução viral do CAF
    1. Semear 7,5 x 105 CAFs em cada uma das duas placas de 60 mm em 4 ml de cDMEM (ver passo 1.3) e cultivá-los como no passo 1.1.
    2. No dia seguinte, substitua o meio de uma placa por 2 mL do meio contendo pseudovírus da etapa 3.1.6 (CAFs transduzidos), adicione 2 mL de cDMEM e incube por 24 h. Deixe o outro prato intocado (CAFs não transduzidos).
    3. No dia seguinte, repita a etapa 3.2.2 nos CAFs transduzidos. Após 24 h, substitua o meio de ambas as placas por 4 mL de cDMEM.
    4. Após mais 24 h, inicie a seleção substituindo o meio de ambas as placas por cDMEM suplementado com 400 μg / mL G418. Substitua o meio contendo G418 a cada 2-3 dias até que não haja células vivas no prato de controle de CAFs não transduzidos.
      NOTA: As células não transduzidas são sensíveis ao G418 e morrerão dentro de 7 a 10 dias, indicando que apenas as células transduzidas resistentes ao G418 terão sobrevivido na condição de CAFs transduzidos. A concentração ideal de antibiótico deve ser determinada para cada tipo de célula, realizando curvas de eliminação (teste uma faixa de concentração de 50 a 1000 μg / mL G418 por 7 a 10 dias e selecione a dose matando todas as células em 10 dias).
    5. Passe as células transduzidas selecionadas 2x na proporção de 1:3 (consulte a etapa 1.2) antes de sair da instalação BSL. Prepare alíquotas criopreservadas das primeiras passagens como na etapa 1.4.
    6. Verifique se as células continuam a proliferar sem mostrar um fenótipo senescente por várias passagens e prossiga para a caracterização fenotípica e funcional (consulte as etapas 4 e 6-9).

4. Caracterização fenotípica

NOTA: Marcadores CAFs como actina de músculo liso alfa (α-SMA), caveolina, proteína ativadora de fibroblastos (FAP), N-caderina, fator de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFR-β), S100A4 e vimentina29 podem ser avaliados por RT-qPCR e Western Blot.

  1. RT-qPCR: Extrair o ARN total com uma solução monofásica de isotiocianato de fenol e guanidina, conforme descrito na referência15. Transcrever inversamente 2 μg de RNA total num volume de 20 μL, seguindo as instruções do fabricante para as condições de reação. Diluir o cDNA 1:20 e utilizar 3 μL para realizar as reações de RT-qPCR, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela 1 para os primers).
    NOTA: Recomendamos preparar o RNA a partir de um prato de 12 poços.
  2. Western blot
    1. Lave 2x com PBS conforme descrito na etapa 1.2.1, adicione 0,2 mL de tampão de lise gelado, retire as células com um raspador e colete-as em um microtubo de 1,5 mL conforme descrito em29. Deixe por 20 min no gelo.
    2. Centrifugar as amostras a 16 000 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Quantificar as proteínas por ensaio colorimétrico de acordo com as instruções do fabricante. Use pelo menos 20 μg de proteína para o Western blot (consulte a Tabela 2 para anticorpos).
      NOTA: Recomendamos preparar proteínas de pelo menos 6 poços em um prato.
  3. Análise de proteínas secretadas
    1. Semear 2 x 106 iCAFs (ver passo 1.3) numa placa de 100 mm de diâmetro em 10 ml de cDMEM e cultivá-los conforme descrito no passo 1.1.
    2. Após 24 h, remova o meio, lave 2x com 10 mL de PBS e incube por 48 h com 10 mL de sDMEM (consulte a etapa 1.1) para gerar meio condicionado (CM).
    3. Após mais 48 h, filtre o CM através de um filtro de seringa de 0,2 μm para um tubo cônico de 15 mL. Segure a seringa e o tubo com força e esteja preparado para alguma resistência. O CM pode ser armazenado a -80 °C por até 6 meses.
    4. Concentre o CM aproximadamente 10x usando concentradores de proteínas de acordo com as instruções do fabricante, para gerar CM concentrado (conCM). Quantifique o conCM, ferva e execute Western Blot (consulte a Tabela 2 para anticorpos).

5. Análise de knockdown de genes

NOTA: Para interferir de forma estável na expressão gênica, transduzemos iCAFs com partículas lentivirais expressando shRNAs especificamente projetados. Estes podem ser obtidos clonando as sequências de direcionamento em um vetor lentiviral adequado, como pLKO.1-Puro, seguindo os protocolos disponíveis em https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. As sequências de direcionamento específicas podem ser selecionadas usando ferramentas de design de shRNA disponíveis publicamente (ou seja, GPP-Genetic Perturbation Portal do Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). Como alternativa, conjuntos de vetores de segmentação pré-fabricados estão disponíveis comercialmente (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). Recomendamos projetar 4-5 shRNAs diferentes contra cada gene e selecionar os 2 melhores para experimentos. Gere também vetores não direcionados como controles negativos. Algumas das etapas a seguir devem ser executadas em um ambiente adequado para lidar com vírus derivados do HIV (por exemplo, BSL2+). Verifique suas regras institucionais.

  1. Geração de partículas lentivirais
    1. Semeie 3 x 106 HEK293T células como nas etapas 3.1.1-3.1.3. No dia seguinte, prepare os complexos de DNA reagente-DNA de transfecção mediados por lipídios catiônicos como na etapa 3.1.4, usando 9 μg e 3 μg, respectivamente, dos vetores de embalagem pCMV-R8.74 e pCMV-VSVG, e 7 μg da construção pLKO.1 contendo shRNA em 0,75 mL de meio otimizado para transfecção sem antibióticos e proceda conforme descrito nas etapas 3.1.5 e 3.1.6.
  2. Transdução de CAFs
    1. Infetar as células conforme descrito nos passos 3.2.1, 3.2.2 e 3.2.4. Após 24 h, remova o meio de infecção e inicie a seleção com 2 μg / mL de puromicina em cDMEM. Consulte a nota na etapa 3.2.5 para determinar a concentração ideal.
    2. Substitua a puromicina/cDMEM após 48 h. A seleção geralmente é concluída em 3 dias. Expanda e congele as células como na etapa 3.2.6. Avalie a eficiência do knockdown por RT-PCR e Western blot, conforme descrito nas etapas 4.1. e 4.2.

6. Superativação de iCAFs com CM de células tumorais

NOTA: As etapas a seguir ilustram métodos para a caracterização in vitro das atividades pró-tumorais dos iCAFs. As atividades pró-tumorais dos CAFs podem ser aumentadas incubando-os com CM de células tumorais BC de camundongos (superativação, sa), conforme descrito abaixo.

  1. Conte as células BC murinas 4T1 conforme descrito na etapa 1.3 e semeie 2 x 106 células em um prato de 100 mm de diâmetro em 10 mL de cRPMI (consulte a etapa 1.1).
  2. Após 24 h, remova o meio, lave 2x com 10 mL de PBS e incube por 48 h com 10 mL de sRPMI (consulte a etapa 1.1) para gerar CM.
  3. No dia seguinte, semear 2 x 106 iCAFs em uma placa de 100 mm de diâmetro, em 10 mL de cDMEM (ver etapa 1.3) e cultivá-los conforme descrito na etapa 1.1. Filtrar o CM através de um filtro de seringa de 0,2 μm para um tubo cónico de 15 ml, como indicado no passo 4.3.3.
  4. Superativação (s.a.): retire o meio da placa iCAFs, lave 2x com 10 mL de PBS e adicione o 4T1 CM filtrado (8-10 mL). Incubar por 48 h para obter s.a. iCAFs.

7. Proliferação de células tumorais

  1. Pré-tratar as células 4T1 durante 48 h com iCAFs CM, preparadas como nas etapas 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. Tripsinize e conte-os, depois semeie 4 x 103 células/poço de uma placa de 96 poços em 100 μL de cRPMI conforme descrito na etapa 1.3 e cultura como na etapa 1.1. Triplicado técnico da placa.
    1. Prepare uma placa de 96 poços por dia do curso de tempo. O número de células sugerido aqui é otimizado para um protocolo de 4 dias; Reduza por mais tempo.
  3. Após 4 h, ou assim que as células estiverem ligadas, remova o meio, lave com PBS adicionando suavemente 100 μL, tomando cuidado para não desprender as células apoiando a ponta contra a borda do poço, com uma pipeta multicanal e usando um reservatório estéril. Remova o PBS e, em seguida, adicione 100 μL de sDMEM (controle) ou iCAF CM, ambos suplementados com 2% de FBS inativado por calor (consulte as etapas 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. Após 4 h, pare a placa do dia 0 conforme descrito no ponto 7.5. Para os outros pontos de tempo, substitua o meio a cada dois dias até o final do experimento.
  5. Para avaliar a densidade celular, remova a placa de 96 poços da incubadora e lave os poços 2x com 100 μL de PBS, conforme descrito na etapa 7.3.
  6. Sob uma capela de exaustão, adicione 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% em cada poço e fixe as células por 10 min em RT.
    CUIDADO: O PFA pode causar sérios danos aos olhos e irritação da pele; É prejudicial se ingerido e inalado e é suspeito de causar defeitos genéticos e câncer. Manuseie um exaustor usando Equipamento de Proteção Individual (EPI) adequado.
  7. Lave 3x com 100 μL de PBS como na etapa 7.3 e deixe secar sob a hotte (cerca de 10 min).
  8. Incubar com 50 μL de cristal violeta a 0,1% em metanol a 20% por 10 min em RT.
    CUIDADO: O cristal violeta pode causar sérios danos aos olhos e é relatado como um perigo de categoria 4 para toxicidade aguda oral e um perigo de categoria 2 como cancerígeno. Manuseie-o em uma hotte usando EPI adequado.
  9. Lave 3x com 100 μL de ddH2O, esvazie os poços e bata a placa na almofada absorvente ou toalha de papel para remover completamente o líquido.
  10. Dissolva o cristal violeta em 100 μL de ácido acético a 10% por 15 min em RT e meça a densidade óptica (OD) no comprimento de onda de 600 nm em um leitor de microplacas, usando 100 μL de ácido acético a 10% como branco. Normalize o O.D. para esse dia para 0 por condição.

8. Migração e invasão

  1. Pipete 700 μL de DMEM suplementado com 1% de FBS inativado por calor, 1% de Pen/Strepto, nos poços de uma placa de 24 poços. Colocar um inserto transwell de poros de 8 μm, revestido (invasão) ou não (migração) com matriz biologicamente ativa, em cada poço. Deixe a placa na incubadora para equilibrar a 37 °C enquanto coleta e conta as células 4T1 como na etapa 1.3.
  2. Separar as células 4T1 pré-tratadas durante 48 h com iCAFs CM de uma placa de 100 mm de diâmetro, como nos passos 4.3.1, 4.3.2 e 4.3.3, utilizando 1 ml de EDTA 5 mM em vez de tripsina-EDTA.
  3. Adicione 5 mL de cDMEM, colha as células em um tubo cônico de 15 mL e granule centrifugando como na etapa 1.2. Ressuspenda as células em sDMEM, conte como na etapa 1.3 e dilua para 1 x 105 células / 100 μL.
  4. Adicione 100 μL da suspensão celular à câmara superior do transpoço. Como controle de plaqueamento, semear 100 μL de células em uma placa de 24 poços, em 500 μL de cDMEM. Incubar durante 16 h (migração) ou 24 h (invasão) e parar a experiência conforme descrito abaixo.
    NOTA: Os tempos de incubação devem ser determinados empiricamente se forem utilizadas células diferentes.
  5. Rotule as inserções na parte superior com um marcador fino e mergulhe-as em um tubo cônico de 50 mL cheio de PBS para lavagem com pinça. Limpe cuidadosamente a parte interna do poço com um cotonete.
  6. Sob uma capela de exaustão, incube amostras em 700 μL de PFA a 4% por 10 min em RT (consulte a etapa 7.6).
  7. Lave 3x com 700 μL de PBS e deixe secar sob o capô (cerca de 10 min). Incube inserções com 700 μL de violeta cristal a 0,1% em metanol a 20% por 10 min em RT (consulte a etapa 6.10).
  8. Lave as inserções 3x submergindo-as em um tubo cônico de 50 mL cheio de ddH2O usando uma pinça. Limpe cuidadosamente a parte interna do poço com um cotonete. Armazene amostras no RT e tire fotos até 3 dias depois.
  9. Usando um microscópio de contraste de fase, tire uma foto com uma objetiva de 10x a imagem da maior parte da superfície do poço e, em seguida, adquira fotos de 5 áreas independentes com uma objetiva de 20x.
  10. Dissolver o cristal violeta em ácido acético a 10% da seguinte forma: para os alvéolos, adicionar 100 μL de ácido acético e misturar num agitador orbital durante 10 min à RT; para transwells, coloque-os, abaixe a superfície para cima, em uma bancada, deposite 50 μL de ácido acético na superfície e misture pipetando até que o cristal violeta esteja completamente dissolvido.
  11. Leia a absorbância a 600 nm em uma placa de 96 poços usando 50 μL do material dissolvido da etapa acima. Use ácido acético a 10% como um espaço em branco.
  12. Normalize a densidade óptica (OD) do controle de revestimento da etapa 8.5 e expresse a migração ou invasão em relação à condição de controle.

9. Crescimento do tumor primário e formação de metástases pulmonares

NOTA: A etapa a seguir ilustra métodos para a caracterização in vivo das atividades pró-tumorais dos CAFs. Esta etapa é otimizada para avaliar as características pró-tumorigênicas in vivo dos CAFs por co-injeção em modelos de camundongos singênicos. Como as células CAFs e 4T1 são do fundo do camundongo BALB / c, os camundongos BALB / c são usados.

  1. 2 dias antes da injeção, numere camundongos BALB/c fêmeas com 6 semanas de idade com brincos de identificação de metal e raspe a4ª região da glândula mamária com um barbeador.
  2. Colete e conte células 4T1 e s.a. iCAFs, preparados conforme descrito na etapa 6. Em um tubo cônico de 15 mL, misture 1 x 105 células 4T1 e 3 x 105 s.a. iCAFs/camundongo, considerando um excesso de pelo menos 20%. Use 4T1 apenas como controle.
  3. Centrifugue a 290 x g por 5 min, ressuspenda em um volume de PBS calculado para obter o número acima de células / camundongos em 50 μL, transfira para um microtubo de 1,5 mL e mantenha em gelo.
    NOTA: Por exemplo, para injetar 10 camundongos, misture 1,2 x 106 células 4T1 com 3,6 x 106 sa iCAFs, células pellet e ressuspenda em 600 μL de PBS. Injetar 50 μL de suspensão celular por camundongo.
  4. Prepare a área de trabalho limpando e desinfetando a superfície de uma capela de fluxo laminar. Cubra uma placa de cirurgia de espuma com uma folha protetora de bancada.
  5. Anestesiar os camundongos um de cada vez, de acordo com os procedimentos institucionais (utilizamos injeção intraperitoneal de base de tiletamina / base de zolazepam + xilazina 70 mg/kg + 5 mg/kg). Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Usando uma ponta de algodão, desinfete a pele com uma solução de iodopovidona.
  6. Use o teste de pinça do dedo do pé para garantir que os camundongos estejam sob anestesia adequada. Com uma agulha hipodérmica, injete 50 μL da suspensão celular na4ª almofada de gordura mamária. Use o mamilo como referência e injete cerca de 3 mm em direção à perna ipsilateral.
  7. Inspecione os camundongos por algumas horas após a injeção e nos dias seguintes. Os tumores tornam-se palpáveis após 4 dias.
  8. Meça o tamanho do tumor a cada 48 h com um paquímetro, determinando os diâmetros máximo e mínimo. Calcule o volume do tumor usando a fórmula: (comprimento x largura2)/2.
  9. Após 10 dias da injeção, remova cirurgicamente os tumores primários conforme descrito abaixo.
    1. Prepare a área cirúrgica como na etapa 9.5. Esterilize as ferramentas em autoclave e coloque-as em uma superfície estéril durante o trabalho. Esterilize as ferramentas entre os animais usando um esterilizador de esferas quentes.
    2. Anestesiar os camundongos conforme as etapas 9.6 e 9.7. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão de 5 a 8 mm perto do tumor e puxe suavemente a pele, criando uma pequena bolsa para acessar o tumor. Cauterize qualquer vaso sanguíneo visível com uma caneta cauterizadora de baixa temperatura para evitar hemorragias ao dissecar.
    3. Use o bisturi para remover o tumor, tentando não remover nenhuma pele. Coloque os retalhos cutâneos de volta em sua posição original, suture-os com fio cirúrgico 5-0 com uma agulha 17 mm 1/2c e adicione cola cirúrgica para selar completamente a ferida.
    4. Não deixe os camundongos sozinhos até que eles tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Os animais submetidos à cirurgia não são devolvidos à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
  10. Acompanhar de perto os animais após a cirurgia e nos dias seguintes, administrar tratamento analgésico se necessário, conforme protocolos institucionais. Usamos injeções subcutâneas de Carprofeno (3-5 mg / kg).
  11. Pese o tumor usando uma balança de precisão, como na etapa 2.2. Corte o tumor ao meio usando o bisturi. Coloque metade em um microtubo de 1,5 mL, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C para análises moleculares. Fixe a outra metade em 5 mL de PFA a 4% em um tubo cônico de 15 mL por 24 h a 4 ° C para análise histológica.
  12. No dia 21 após a injeção, sacrifique os camundongos por exposição ao CO2 e colete os pulmões após infusão intratraqueal com 4% de PFA, conforme descrito abaixo. Trabalhe sob uma coifa.
    1. Abra a cavidade torácica usando uma tesoura cirúrgica. Remova a pele da área submandibular e das glândulas salivares para expor claramente a traqueia.
    2. Prepare uma seringa de agulha 22G contendo solução de PFA a 4%. Insira a agulha na traqueia do camundongo, direcionando-a para os pulmões enquanto aperta a traqueia em direção à cabeça. Injete a solução até os pulmões incharem (cerca de 2 ml).
    3. Disseque os pulmões e coloque-os em um tubo de 15 mL contendo uma solução de PFA a 4%. Inverter suavemente o tubo algumas vezes e deixá-lo fixar durante 24 h a 4 °C.
  13. Efectuar secções semi-seriadas dos pulmões e comar com hematoxilina e eosina (H&E), uma fatia a cada 50/100 μm até que a amostra se esgote, conforme descrito na referência31.
  14. Pontue metástases após análise guiada por software de microfotografias das seções coradas com H & E.

10. Assinaturas de expressão gênica

  1. Defina uma assinatura de gene conforme descrito abaixo.
    1. Dependendo do ambiente experimental e da questão biológica específica investigada, obtenha uma assinatura gênica de várias maneiras. Mais comumente, avalie a expressão diferencial entre duas condições (por exemplo, CAFs versus contrapartes normais, ou tratadas de várias maneiras (por exemplo, superativadas ou silenciadas) versus não tratadas.
    2. Alternativamente, identifique os genes mais variados ou informativos nas amostras analisadas (por exemplo, genes com alta variância ou com altas cargas nos primeiros componentes de uma análise de componentes principais). Aqui, usaremos uma assinatura regulamentada pelo STAT3 como exemplo. Essa assinatura foi definida como os genes regulados negativamente no silenciamento de STAT3 em BC CAFs29, conforme descrito abaixo. Para uma descrição completa do sequenciamento de RNA, consulte as referências 32,33.
  2. Extrair o RNA total em triplicado técnico de cada amostra, como no passo 4.1.1, e avaliar a qualidade do RNA para verificar a integridade do RNA (RIN ≥ 9).
  3. Prepare bibliotecas a partir de 2 μg de RNA poli(A) selecionado e sequencie-as. Usamos a plataforma NextSeq 500.
  4. O mapa lê o conjunto de referência Mus musculus mm9 usando TopHat v2.0. 1034.
  5. Calcule a contagem de genes usando a ferramenta htseq-count do pacote HTSeq (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. Realize a análise de expressão diferencial usando R e o pacote DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). Filtre genes regulados negativamente com FDR < 0,05 para definir a assinatura STAT3.

11. Estimativa da expressão da assinatura em tumores primários

NOTA: As etapas a seguir descrevem um procedimento para estimar computacionalmente a expressão da assinatura regulada por STAT329 em dados transcriptômicos publicamente disponíveis de tumores primários de BC, testando sua relação com a proporção estromal estimada no mesmo conjunto de amostras.

  1. Instale o R (https://cran.r-project.org/) e o RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). Inicie-o e instale as bibliotecas necessárias: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. Baixe dados de expressão gênica de tumor primário, como dados TCGA de https://portal.gdc.cancer.gov/, dados METABRIC de http://synapse.org/ (syn1757063) ou outros dados transcriptômicos do Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) como matrizes de expressão pré-normalizadas. Os dados devem ser formatados como uma matriz numérica com linhas como genes e colunas como amostras, e normalizados dependendo da plataforma e escalados em log usando um deslocamento de 1.
    1. Baixe a lista de ortólogos de genes humanos-camundongos da Biomart em https://www.ensembl.org/biomart/martview/, selecione o banco de dados: ensembl genes, escolha o conjunto de dados de genes humanos e clique na seleção de atributos na guia esquerda.
    2. Nos recursos pré-selecionados, abra a guia EXTERNO e sinalize o símbolo HGNC, selecione Homólogos na caixa na parte superior da página e sinalize Ortólogos do mouse / Nome do gene do mouse.
    3. Clique no botão Resultados no canto superior esquerdo, selecione o formato CSV e clique no botão GO para baixar o arquivo.
  3. Carregue a assinatura de expressão gênica (um conjunto de genes) em R. Neste caso, usamos a lista de genes regulados negativamente no silenciamento de STAT3 em CAFs murinos.
  4. Carregue a lista de ortólogos de genes de camundongos humanos em R e mapeie a assinatura STAT3 para os ortólogos humanos correspondentes por meio da tabela Biomart.
  5. Carregue os dados de expressão gênica do tumor primário em R e chame a função GSVA com parâmetros como um objeto ssgseaParam, incluindo dados de tumor primário e uma lista que compreende a assinatura STAT3.

12. Testar a relação entre a expressão da assinatura gênica e as características clínicas

  1. Identifique as variáveis de interesse. A porcentagem estromal representa a proporção de células na amostra tumoral sequenciada pertencentes ao estroma tumoral. Use as seguintes características clínicas frequentemente associadas a dados ômicos: tamanho do tumor, estágio, idade do paciente no diagnóstico, status dos linfonodos, status da metástase, etc. Estimativas de porcentagem estromal pré-calculadas estão disponíveis para TCGA.
    NOTA: Especificamente, as estimativas estromais disponíveis são: EDec Imune / Estromal = Deconvolução Epigenômica da porcentagem estromal / imune37; Pontuação imunológica = ssGSEA com base nos perfis de expressão gênica de 141 genes imunológicos38; LUMP = Desmetilação de Leucócitos para Pureza, que tem uma média de 44 locais CpG imunoespecíficos não metilados39; Escore estromal = ssGSEA com base nos perfis de expressão gênica de 141 genes estromais38; IHQ = estimada por análise de imagem de lâminas coradas com hematoxilina e eosina produzidas pelo Nationwide Children's Hospital Biospecimen Core Resource40; ABSOLUTO = com base em dados somáticos do número de cópias41.
  2. Baixe dados EDEc de http://genboree.org/theCommons/documents/569, pontuações estromais e imunes de https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2) e dados de pureza tumoral (LUMP, IHC, ABSOLUTE) de TCGAbiolinks. Para outros conjuntos de dados, calcule a porcentagem de estroma fazendo uso do pacote GSVA, calculando o ssGSEA para estroma e assinaturas imunes obtidas de Yoshihara et al.38.
  3. Calcule a correlação entre o vetor numérico da proporção estromal estimada e o vetor numérico da expressão da assinatura STAT3 em amostras de tumor primário. Isso pode ser obtido com a função cor.test em R.
  4. Baixe os dados clínicos associados ao conjunto de dados transcriptômicos dos tumores primários como uma tabela com amostras em linhas e características clínicas em colunas.
  5. Carregue os dados clínicos em R e verifique se as amostras na matriz transcriptômica e na tabela de metadados estão na mesma ordem que a função de correspondência.
  6. Para variáveis numéricas (por exemplo, tamanho do tumor), calcule a correlação entre o vetor numérico da expressão da assinatura STAT3 em amostras de tumor primário e o vetor de valores de características clínicas com a função cor.test.
  7. Para variáveis categóricas (por exemplo, status de metástase), teste a diferença na expressão da assinatura STAT3 entre dois grupos de amostras (por exemplo, tumores metastáticos versus não metastáticos) com o teste não paramétrico de Wilcoxon (assumindo que os dois grupos de amostras são independentes). Isso pode ser alcançado com a função wilcox.test em R.

13. Testando a regulação da assinatura no estroma tumoral

NOTA: A expressão de uma assinatura estromal em tumores primários analisados por meio de sequenciamento de RNA em massa tem a vantagem de contar com grandes coortes de pacientes com anotações clínicas detalhadas. Por outro lado, apenas a separação do estroma e do epitélio permite definir alterações na expressão gênica em qualquer um dos dois compartimentos celulares do tumor quando comparados ao tecido normal42. MetaLCM é um ShinyApp que facilita a análise de conjuntos de dados transcriptômicos de tumores de mama microdissecados com captura a laser. Por meio dessa ferramenta, o usuário pode pesquisar genes robustos expressos diferencialmente entre duas condições em conjuntos de dados transcriptômicos de tumores de mama microdissecados por captura a laser e testar a regulação de assinaturas gênicas previamente definidas no estroma tumoral. As etapas a seguir descrevem como usar o MetaLCM.

  1. Acesse o aplicativo no link https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/. Para iniciar a análise, selecione as características das condições comparadas.
  2. Escolha a direção para a comparação. Ao escolher genes regulados positivamente, os genes com maior expressão na condição 1 são mostrados.
  3. Escolha o limite de valor p para expressão diferencial e pressione Executar para executar a análise e sempre que as configurações forem alteradas.
  4. Para restringir a análise a uma lista de genes predefinida, digite símbolos de genes separados por vírgulas ou importe um arquivo CSV contendo símbolos de genes em uma única coluna.
  5. Pressione Enviar lista de genes para importar símbolos de genes. Pressione Redefinir para restaurar a análise usando todos os genes. Salve a lista de genes diferencialmente expressos: quando uma lista de genes é fornecida, várias correções de testes são realizadas apenas nesses genes. A tabela compreende o logFC médio, o valor p recolhido e os valores logFC e p individuais para expressão diferencial em cada conjunto de dados disponível.
  6. Trace um mapa de calor com as mudanças de dobra de genes diferencialmente expressos. O mapa de calor mostra apenas os genes expressos diferencialmente com o sinal completamente coerente de expressão diferencial entre os conjuntos de dados.

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Resultados

Avaliação in vitro das atividades dos CAFs
A contribuição dos fibroblastos associados ao câncer (CAFs) derivados de tumores mamários para as características agressivas do câncer de mama (CM) foi estudada usando CAFs imortalizados (iCAFs) gerados de acordo com a etapa 3. Os iCAFs foram superativados conforme descrito na etapa 6 e, em seguida, morreram de fome em sDMEM para coletar seu CM, que foi usado para tratar células 4T1 por 48 h (ver etapa 7.1). Este tratamento foi segui...

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Discussão

Neste estudo, apresentamos protocolos otimizados para a imortalização de CAFs murinos e a caracterização de suas atividades pró-tumorigênicas tanto in vitro quanto in vivo. Em vez de isolar seletivamente subtipos específicos de CAF com base na expressão do marcador, optamos por reter toda a população de células para preservar a heterogeneidade. As células foram caracterizadas funcionalmente como um todo, e seus perfis de expressão gênica foram analisados para capturar s...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Associação Italiana de Pesquisa do Câncer (AIRC, IG16930 e IG24851 ao VP); o Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa (MIUR PRIN 2017 e 2022 a V.P.); a Fundação Truus e Gerrit van Riemsdijk, Liechtenstein, doação para VP; Região do Piemonte (Desviar). A.S. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da Fundação Italiana de Pesquisa do Câncer (FIRC), e L.A. foi apoiado pela Fondazione Umberto Veronesi.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1Kb mais escada de DNAThermoFisher Scientific10787018
Placa de 24 poçosSarstedt833922
Placa de 96 poçosSarstedt833924
Ácido acéticoSigma Aldirch695092
IdadeI-HFBiolabs da Nova InglaterraR3552Armazene a -20 > C
BetadineMeda Pharma23907076
Bü rker Câmara de contagem VWR40443703
Tela de Ponta Fina de Baixa Temperatura CauteryKeelerAX10339KL
CentrifugaEppendorf5810R
Tubo cônico 15 mLSarstedt62554502
Tubo cônico 50 mLSarstedt62547254
Microtubos Cryopure 2 mLSarstedt72380992
Violeta de cristalSigma AldirchC0775Armazene na RT, use em um exaustor 
Placa de cultura com 100 mm de diâmetro Sarstedt833902
Placa de cultura 60 mm de diâmetro Sarstedt833920
ddH20CaseiroArmazene na RT, use em um capuz biológico
Paquímetro digitalPreciva02-301-2
Microscópio digitalLeicaDM6B
DimetilsulfóxidoSigma AldirchD8418Uso em um capuz biológico
Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)Gibco11965092Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
EcoRI-HFBiolabs da Nova InglaterraR3101Armazene a -20 > C
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma AldirchE6758Armazene na RT, use em um capuz biológico
Soro fetal bovino (FBS)Gibco16000044Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Pontas filtradas 10 µ LSarstedt703010255
Pontas filtradas 100 µ LSarstedt703030255
Pontas filtradas 1000 µ LSarstedt703060255
Pontas filtradas 20 µ LSarstedt703030265
Pontas filtradas 200 µ LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ m Sarstedt831826102
Filtropur S Plus 0,45 µ m Sarstedt831826
Tesoura fina2Biol1406009
Pinça2Biol1102412
GeneticinaGibco10131035Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000ThermoFisher Scientific11668019Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Câmaras de invasão Matrigel com 8 μ m Membrana PET Corning354480
Leitor de microplacas (absorbância de 600 nm)PromegaGM3500
Microtubos 1,5 mL Sarstedt7269001
OptimemGibco31985047Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Paraformaldeído (PFA)Sigma Aldirch158127Armazenar em RT, usar em um exaustor
pBABE-neo grandeTcDNA Addgene1780Armazene a -20 > C, uso em um capuz biológico
pCL-AmphoNovus Biológico18746853Armazene a -20 > C, uso em um capuz biológico
pCMV-R8.74Addgene22036Armazene a -20 > C, uso em um capuz biológico
pCMV-VSVG Addgene8454Armazene a -20 > C, uso em um capuz biológico
Penicilina-estreptomicina (Pen Strepto, 10.000 μ g/mL) Gibco15140122Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Microscópio de contraste de fase Olympus BX42
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)CaseiroArmazene na RT, use em um capuz biológico
pLKO.1-Puro Addgene10878Armazene a -20 > C, uso em um capuz biológico
Solução de poli-L-lisinaSigma AldirchPág. 8920Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Dicloridrato de puromicina de  Streptomyces albonigerSigma AldirchPág. 8833
rCutSmart Buffer Biolabs da Nova InglaterraB6004Armazene a -20 > C
Barbeador para roedoresAesculapGT416
Instituto Memorial de Roswell Park (RPMI)Gibco61870010Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Cotonetes sedentos de ponta redondaSigma AldirchZ744127
BisturiGima27041
Balança Secura Semi MicroSartoriusSECURA125-1S
Pipeta sorológica 10 mL Sarstedt861254001
Pipeta sorológica 2 mL Sarstedt861252001
Pipeta sorológica 25 mL Sarstedt861256001
Pipeta sorológica 5 mL Sarstedt861253001
Pontos 5-0Ética1866G
Seringa 10 mLPentaferteNº 00202250E14
Seringa 5 mLPentaferteNº 00202250E12
Seringa Omnican Insulina 1 mLBraunRolamento 9151125S
Tecido adesivo3M Vetbond1469SB
Inserções Transwell 8 µ M pore Falcão353097
Inserções Transwell Matrigel 8 µ M pore Corning354480
Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenolGibco15400054
Concentrador centrífugo Vivaspin 20 MWCO 10.000 Da Sigma AldirchZ614602

Referências

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