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Isolamento, cultura e caracterização de fibroblastos associados ao câncer de próstata

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DOI:

10.3791/68367

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1 de agosto de 2025

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1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um procedimento abrangente para isolar, expandir e imortalizar fibroblastos de prostatectomias radicais. Além disso, descreve ensaios desenvolvidos para avaliar os efeitos funcionais da diafonia de células tumorais de fibroblastos, aproveitando tanto o tratamento com meio condicionado quanto a co-cultura.

Resumo

O estroma tumoral pode ser ativamente moldado por células tumorais para adotar propriedades pró-tumorigênicas, tornando-se um ponto focal da pesquisa do câncer. Entre os componentes estromais, os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) - geralmente o tipo de célula mais abundante no microambiente tumoral (TME) - desempenham um papel fundamental na promoção da progressão do câncer por meio de suas interações com células tumorais e outros componentes estromais. Elucidar os mecanismos por trás dessas interações requer métodos robustos para isolar e caracterizar CAFs, que também podem lançar as bases para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer direcionadas ao CAF. Este estudo apresenta um método para isolar fibroblastos do tumor e das regiões normais adjacentes de espécimes de prostatectomia radical obtidos de pacientes com câncer de próstata (CaP). Essa abordagem permite o isolamento simultâneo de CAFs e suas contrapartes normais (NFs) do mesmo indivíduo, fornecendo um sistema experimental pareado. Protocolos detalhados são fornecidos para a manutenção de CAFs e NFs primários para análises in vitro a jusante, bem como para sua imortalização para facilitar estudos de longo prazo. Também descrevemos ensaios funcionais projetados para comparar os efeitos de CAFs e NFs no comportamento das células cancerígenas, incluindo proliferação, migração e crescimento independente de ancoragem. Duas abordagens complementares são detalhadas: tratamento de células cancerígenas com meio condicionado (CM) derivado de fibroblastos e co-cultura direta de fibroblastos com células tumorais. Juntas, essas metodologias representam um kit de ferramentas abrangente para investigar a interação dinâmica entre CAFs e células tumorais, não apenas no CaP, mas potencialmente em uma variedade de cânceres humanos. Além disso, a caracterização molecular dessas interações pode revelar mediadores chave da oncogênese impulsionada por CAF, oferecendo alvos promissores para intervenção terapêutica.

Introdução

O câncer de próstata (CaP) é o câncer mais frequentemente diagnosticado em homens em quase dois terços dos países em todo o mundo. Em 2022, aproximadamente 1,5 milhão de novos casos foram relatados, resultando em 3.97.000 mortes em todo o mundo. Esses números tornam o CaP o segundo câncer mais comum e a quinta principal causa de mortalidade relacionada ao câncer entre os homens1.

O CaP é uma doença multifocal e biologicamente complexa, marcada por substancial heterogeneidade intertumoral 2,3,4, diversos subtipos moleculares e desfechos clínicos variáveis 5,6, os quais influenciam significativamente o prognóstico e a resposta terapêutica7.

Embora o papel crítico do microambiente tumoral (TME) na iniciação e progressão do tumor de próstata esteja bem estabelecido 8,9, as interações moleculares entre as células tumorais e o compartimento estromal circundante permanecem incompletamente compreendidas. Embora esteja bem estabelecido que o microambiente do tumor de próstata (TME) desempenha um papel crítico na iniciação e progressão do tumor, as interações moleculares entre as células tumorais e o estroma circundante permanecem insuficientemente definidas. O TME compreende uma variedade de células estromais, incluindo as de origem mesenquimal e imune, que são ativadas em resposta a sinais derivados do tumor e, posteriormente, adquirem funções promotoras de tumor10,11. Entre estes, os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) geralmente representam a população estromal mais abundante. Os CAFs contribuem para a remodelação da matriz extracelular (MEC), promovem o crescimento do tumor e facilitam a invasão e migração de células cancerígenas 4,11,12,13. Por meio de fatores secretados e interações diretas célula-célula, os CAFs também influenciam a proliferação, invasão e resistência à terapia. Notavelmente, os CAFs são uma população heterogênea. Embora geralmente associados a funções pró-tumorigênicas, alguns subtipos podem exercer papéis supressores de tumor14,15. É importante ressaltar que a ausência de marcadores únicos para CAFs apresenta desafios para sua identificação precisa e a dissecção funcional de seus diversos papéis12,16.

Uma abordagem robusta para investigar a interferência funcional entre CAFs e células tumorais envolve isolar CAFs primários e fibroblastos normais (NFs) correspondentes e, em seguida, avaliar sua respectiva influência no comportamento das células tumorais, como proliferação, migração, formação de colônias e crescimento independente de ancoragem 17,18,19. Este artigo descreve um protocolo refinado e altamente reprodutível para isolar CAFs e NFs de espécimes de prostatectomia radical de pacientes com CaP de alto risco. Um componente crítico deste protocolo é a identificação e dissecção precisas de regiões tumorais e livres de tumor por um uropatologista especialista, permitindo a derivação de CAFs e NFs do mesmo paciente. Essa abordagem de amostra pareada ajuda a controlar a heterogeneidade intertumoral e as variáveis individuais específicas do paciente que podem influenciar os fenótipos de fibroblastos 20,21,22. Para garantir que tecido tumoral suficiente esteja disponível, nos concentramos em amostras de pacientes com escore de Gleason ≥7.

A caracterização fenotípica confiável dos fibroblastos isolados requer o uso de múltiplos marcadores para distingui-los de outros tipos celulares, particularmente células epiteliais, que podem compartilhar a expressão de marcadores sobrepostos16. Como os fibroblastos primários do CaP normalmente sofrem senescência após 10-15 passagens, complicando as análises de longo prazo, também apresentamos um protocolo para imortalização celular via expressão estável da transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT)23.

Para explorar os efeitos funcionais de CAFs e NFs em células tumorais, testamos e otimizamos várias estratégias experimentais. Dado que os CAFs exercem sua influência por meio de fatores secretados e contato direto célula-célula24, dois sistemas de ensaio complementares são desenvolvidos: (1) tratamento de células cancerígenas com meio condicionado por fibroblastos (CM) e (2) co-cultura direta de fibroblastos e células tumorais. Esses ensaios avaliam as principais propriedades das células cancerígenas, incluindo proliferação, crescimento independente de ancoragem e migração. Para padronizar a influência dos fatores secretados, os meios condicionados de CAFs e NFs foram concentrados e quantificados (conCM) com base no teor de proteína total.

A demonstração de efeitos funcionais significativos por meio desses ensaios pode apoiar a identificação de mediadores críticos da tumorigênese conduzida por CAF, oferecendo alvos potenciais para intervenção terapêutica.

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Protocolo

Este estudo foi realizado em total conformidade com as diretrizes institucionais para o uso de amostras clínicas, aprovadas pelo Comitê de Bioética do Hospital Città della Salute Molinette em Turim, Itália. Todas as amostras foram obtidas após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido pelos pacientes participantes. A seção a seguir fornece um protocolo detalhado e passo a passo para o isolamento de fibroblastos associados ao câncer (CAFs) e seus equivalentes de fibroblastos normais (NF) correspondentes. O protocolo inclui dissecção do tumor e áreas não tumorais adjacentes, processamento de tecidos, cultura de células e caracterização fenotípica e funcional das células isoladas. Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis dentro de um gabinete de biossegurança certificado. As células foram cultivadas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 usando meio de Eagle modificado de Dulbecco completo (cDMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, salvo indicação em contrário. Todas as etapas de centrifugação são realizadas com o freio engatado. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista abrangente de reagentes, materiais e equipamentos usados em todo o protocolo. Esta metodologia foi otimizada para amostras de câncer de próstata de alto risco, com uma pontuação de Gleason de 4+3 ou superior.

1. Dissecção cirúrgica da amostra

NOTA: Este procedimento foi realizado em peças cirúrgicas coletadas de procedimentos de prostatectomia radical25 realizados em pacientes com câncer de próstata (CaP) de alto grau e manejados seguindo protocolos padronizados, baseados em diretrizes institucionais internas e literatura internacional estabelecida e melhores práticas 26,27,28.

  1. Coloque a próstata sob um capuz de biossegurança em uma cortina estéril e oriente-a de acordo com os pontos de referência anatômicos.
    NOTA: Este procedimento deve ser realizado por um uropatologista experiente.
  2. Usando uma lâmina estéril, excise fatias de tecido de áreas identificadas no relatório de biópsia pré-operatória como neoplásicas ou livres de células tumorais.
  3. Realizar uma análise criostática rápida29 em ambas as amostras de tecido, preparando cortes de tecido de 2,5 μm de espessura e colorindo-os com hematoxilina e eosina (H&E) para verificar a presença ou ausência de células tumorais nas regiões selecionadas, de acordo com os critérios diagnósticos para adenocarcinoma prostático da última edição da classificação da OMS30 (ver Figura 1A).
    NOTA: Se surgirem discrepâncias, repita o processo de amostragem até que a confirmação histológica das áreas neoplásicas e não neoplásicas seja obtida.
  4. Extirpar aproximadamente 10 mm2 amostras das regiões neoplásicas e não neoplásicas, colocá-las em tubos cônicos de 15 mL contendo 7 mL de tampão de armazenamento de tecido gelado e mantê-las no gelo para procedimentos subsequentes.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a 4 °C por até 48 h neste tampão.

2. Isolamento de fibroblastos

NOTA: Todos os procedimentos de processamento a seguir devem ser realizados no gelo a 4 °C, salvo indicação em contrário. Consulte a Figura 1 A para obter um esquema.

  1. Dia 1: Pese as amostras de tecido.
    NOTA: 70-100 mg são obtidos em média.
  2. Passar para pratos de 6 cm e realizar quatro lavagens sequenciais, duas vezes em 4 mL de PBS gelado e duas vezes em 4 mL de cDMEM gelado, ambos suplementados com 200 U/mL de Penicilina, 200 μg/mL de Estreptomicina (2x), usando fórceps estéril para transferir o tecido de um prato para o outro.
  3. Rompa mecanicamente o tecido colocando-o em uma placa de 6 cm no gelo, com 1 mL de DMEM suplementado com 100 U/mL de penicilina-G e 100 μg/mL de estreptomicina, depois pique-o em pequenos fragmentos (<1 mm2) usando tesoura ou lâminas.
  4. Transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de cDMEM gelado. Centrifugar a 754 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Use uma pipeta de 10 mL para remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de cDMEM gelado. Centrifugue novamente a 754 x g por 5 min a 4 °C.
  6. Remova o sobrenadante como acima e ressuspenda o pellet em colagenase II (1 mg / mL em DMEM), usando 1 mL / 100 mg de tecido. Passe para um microtubo de 1,5 mL.
    NOTA: Devido à variabilidade dos lotes de colagenase, teste diferentes lotes e certifique-se de que eles tenham o suficiente para realizar todos os isolamentos previstos.
  7. Cobrir os tubos com película de parafina e digerir as amostras O/N (8-12 h) a 37 °C com balanço contínuo.
    NOTA: Execute as etapas a seguir no Dia 2.
  8. Transfira as amostras para tubos cônicos de 15 mL e adicione 5 mL de cDMEM gelado à suspensão celular para inativar a colagenase e, em seguida, centrifugue a 754 x g por 5 min a 4 ° C.
    NOTA: A colagenase é eliminada aspirando-a para um recipiente contendo detergente.
  9. Aspire o sobrenadante usando uma pipeta de 10 mL e ressuspenda o pellet em 1 mL de tripsina / EDTA a 0,05%. Incubar durante 5 min a 37 °C, agitando ocasionalmente.
  10. Adicione 1 mL de DNase I às amostras e misture bem. Use uma solução de 25 mg / mL recém-preparada em PBS.
    NOTA: O tratamento com DNase I nesta fase ajuda a obter a solução de célula única.
  11. Centrifugar a 754 x g durante 5 min a 4 °C.
  12. Use uma pipeta de 10 mL para aspirar o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de cDMEM frio. Centrifugue a 754 x g por 5 min 4 °C.
  13. Ressuspenda as células em cDMEM FBS a 20%. Placa e incubar a 37 °C, 5% de CO2 e 95% de umidade por pelo menos 3 dias. Tome cuidado para não mover/inclinar o prato. Para 70-100 mg de tecido, distribua a suspensão celular em placas de 2 x 3,5 cm, em 2 mL de meio. Reduza a escala de acordo, se necessário.
    NOTA: Menos de 50 mg de tecido resultará em derivação celular ineficiente. O esquema de divisão e congelamento é mostrado na Figura 1B.
  14. Após 3 dias, verifique a morfologia/viabilidade das células e substitua 2/3 do meio para manter os fatores de crescimento produzidos pelas células. Levará cerca de 7 a 10 dias para que as células atinjam a confluência, substituindo o meio a cada dois dias.
  15. Uma vez confluentes, passe as células em um prato de 10 cm em 20% de FBS cDMEM.
  16. Substitua o meio em dias alternados, usando 15% de meio FBS duas vezes, depois uma vez, 12,5% e 10%. Para análises FACS, a extração de RNA e proteínas e os estoques de congelamento seguem o esquema da Figura 1B.
  17. Células divididas quando cerca de 100% confluentes (cerca de 10 dias). Lave 2-3 vezes com PBS abundante por 5 min cada. Adicione 1% de tripsina/EDTA (2x) e coloque na incubadora, verificando o descolamento celular a cada poucos minutos.

3. Condição de cultura

  1. Passe as células somente quando 100% confluente, não mais do que 1:3.
  2. Congelar alíquotas correspondentes a 50% de um prato confluente de 10 cm em 0,5 mL de meio de congelamento gelado (10% de DMSO em FBS). Descongele cada alíquota em um prato de 10 cm.
    NOTA: O tempo médio de duplicação é de 80-90 h.

4. Análise FACS

NOTA: Este protocolo garante uma caracterização confiável da população de fibroblastos e identifica a contaminação potencial de células epiteliais, endoteliais ou imunes. A análise FACS é realizada na passagem 2, conforme ilustrado na Figura 2A.

  1. Colha as células e ressuspenda-as em tampão FACS (PBS mais 2% FBS) a uma concentração de 106 células/mL.
  2. Rotule os tubos de citometria de fluxo e adicione 1 x 105 células em um volume de 100 μL em cada um deles. Para coloração com 4 anticorpos, prepare 11 tubos para contabilizar a coloração e o gating, da seguinte forma (Tabela 1)
    NOTA: 1 tubo, sem anticorpos (controle não corado), para avaliar a autofluorescência celular, 1 tubo com controle de isotipo de anticorpo, para avaliar uma ligação específica, 4 tubos, cada um com um único anticorpo, para compensação; contas de compensação podem substituir células, 4 tubos de fluorescência menos um (FMO) para gating, cada um deixando de fora um dos anticorpos, 1 tubo com todos os 4 anticorpos (amostra real). Os seguintes anticorpos marcados com fluorescência são usados (consulte a Tabela de Materiais): (1) Anti-EpCAM-PE (marcador de células epiteliais), (2) Anti-CD31-VioBlue (marcador de células endoteliais), (3) Anti-CD45-FITC (marcador de células imunes), (4) Anti-CD90-APC (marcador de células de fibroblastos). Podem ser utilizados anticorpos conjugados com outros fluoróforos, de acordo com os filtros de citómetro de fluxo disponíveis. Execute todas as etapas no gelo para preservar a viabilidade celular.
  3. Incube as células com bloqueadores de receptores cristalizáveis de fragmentos (FcR), como anticorpos anti-CD16/CD32 purificados ou tampão de bloqueio (PBS 1%-2% BSA). Use 1-5 μL de reagente bloqueador FcR por 100 μL de suspensão celular e incube a 4 ° C por 10-15 min.
  4. Prossiga diretamente com a coloração sem lavar. Adicionar aos tubos diluições de anticorpos adequadas ou os controlos de isotipo correspondentes, conforme especificado no quadro 1.
  5. Misture suavemente e incube a 4 °C no escuro por 30 min.
  6. Lave com 2 mL de tampão FACS.
  7. Centrifugue durante 5 min a 300 x g, a 4 °C.
  8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de tampão FACS fresco.
  9. Adicione corante de viabilidade (iodeto de propídio) de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  10. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo.
  11. Use controles de compensação de coloração única para configurar a matriz de compensação. Para análise de dados, aplique a seguinte estratégia de passagem em gráficos de densidade FACS:
  12. Passagem de dispersão direta e lateral: plotagem FSC-A vs. SSC-A e projetar uma região ao redor da população celular principal para excluir detritos celulares.
  13. Para exclusão dupla: plotar FSC-A vs. FSC-W (ou FSC-H vs. FSC-A) e projete uma região para excluir aglomerados de células, que mostrarão maior largura em relação à área (ou aumento da área em relação à altura). Selecione as células individuais e execute o mesmo procedimento, plotando SSC-A vs. SSC-W (ou SSC-H vs. SSC-A) para aumentar a pureza da população de uma única célula.
  14. Plote o corante de viabilidade (ou seja, iodeto de propídio) vs. SSC-A e selecione células vivas negativas.
  15. Em células vivas, plote CD326 (eixo x) vs. CD31 (eixo y); use as amostras FMO correspondentes para definir os portões com precisão. O FMO permite levar em conta a propagação da fluorescência em um canal específico causada pelos outros fluoróforos.
    1. Olhando para a amostra CD326 FMO, desenhe uma porta de quadrante que inclua todas as células nos quadrantes esquerdos (ou seja, negativo para CD326). Repita o mesmo procedimento usando a amostra CD31 FMO para ajustar a porta de modo a ter todas as células FMO nos quadrantes inferiores (ou seja, negativo para CD31). Use este quadrante para analisar as amostras e selecione as células no quadrante inferior esquerdo (CD31-CD326-).
  16. Repita o mesmo procedimento plotando CD326 (eixo x) vs. CD45 (eixo y), usando o CD326 FMO e o CD45 FMO para definir a porta do quadrante. Use este quadrante para analisar todas as amostras e selecionar células no quadrante inferior esquerdo (CD45-CD326-).
  17. Enredo CD90 vs. SSC-A e use o CD90 FMO para definir uma região que exclui células negativas e inclui apenas CD90+. Use esta região para analisar todas as amostras, medindo a porcentagem de células CD90+ . Os resultados representativos são mostrados na Figura 2A.

5. Imortalização de fibroblastos

NOTA: A imortalização das populações CAF e NF é alcançada por transdução estável com um vetor retroviral que expressa hTERT. Abaixo estão os protocolos para preparar partículas pseudovirais infecciosas e transduzir células.

  1. Produção de partículas retrovirais
    1. Dia 1, revestimento de poli-L-lisina e revestimento de células: Cubra uma placa de 10 cm com 6 mL de solução de poli-L-lisina (0,1 mg/mL em H2O), incube 5 min sob a capa do TC, aspire e deixe a placa aberta secar sob a capa antes de plaquear 3 x 106 HEK293T células.
    2. Dia 2: Adicione 30 μL de reagente de transfecção mediado por lipídios catiônicos a 0,75 mL de meio otimizado para lipofecção sem antibióticos.
    3. Paralelamente, adicione 2 μg de vetor de empacotamento de retrovírus pCL-Ampho e 2 μg de plasmídeos pBABE-puro-hTERT a outros 0,75 mL de meio otimizado para lipofecção sem antibióticos.
    4. Incube por 5 min em RT.
    5. Misturar as duas diluições num tubo cónico de 15 ml e incubar durante 20 min à RT.
    6. Enquanto isso, substitua o meio HEK293T por 6 mL de meio otimizado para lipofecção suplementado com 10% de FBS.
    7. Distribua suavemente os complexos de DNA na superfície do prato e incube por 6 h a O/N em uma incubadora de CO2 umidificada.
    8. Dia 3: Substitua o meio por 7 mL de cDMEM e incube por 48 h.
      NOTA: A partir desta etapa, o trabalho deve ser realizado em uma instalação de cultura de tecidos de nível de biossegurança 3 (BSL3), seguindo as regras institucionais.
    9. No dia 5, colete o meio contendo vírus e filtre através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
    10. Alíquota e conservar a -80 °C.
  2. Transdução viral
    1. Dia 1: Placa de fibroblastos de passagem baixa a 60% de confluência em 2 poços de uma placa de 6 poços.
    2. Dia 2: Substitua o meio por 1 mL da preparação retroviral pBABE-puro-hTERT produzida anteriormente contendo 8 μg/mL de polibreno e incube por 12-16 h.
    3. Dia 3: Substitua o meio contendo vírus por 2 mL de cDMEM.
    4. Dia 4: Após 24 h, inicie duas rodadas de 48 h de seleção de puromicina (2 μg/mL).
      NOTA: A concentração deve ser determinada empiricamente para cada lote de antibiótico e tipo de célula, e a concentração mais baixa deve ser selecionada para matar todas as células dentro de 4 dias após a seleção.
    5. Dia 8: Verifique se todas as células de controle não infectadas morreram. Substitua o meio por cDMEM e deixe as células infectadas crescerem até ficarem confluentes antes de passá-las 1:3. Deixe as células atingirem a confluência e se dividirem novamente 1:3. Nesta fase, as células podem sair da instalação BLS3.
      NOTA: Prepare alíquotas congeladas o mais rápido possível. Para garantir que a imortalização ocorreu, passe as células 5-6 vezes e pontue sua morfologia e taxas de duplicação, que não devem mudar com as passagens. Compare funcionalmente as células imortalizadas com suas contrapartes primárias, usando os métodos descritos abaixo.

6. Caracterização de fibroblastos

  1. Fenotipicamente analisa as células isoladas quanto à expressão de marcadores CAF/NF e caracteriza funcionalmente suas potenciais atividades pró-oncogênicas em células tumorais.
    NOTA: Os oligonucleotídeos e anticorpos qPCR otimizados para avaliar os níveis de expressão do marcador nos níveis de RNA e proteína são relatados na Tabela 2 e na Tabela de Materiais, respectivamente. Esteja ciente de que os anticorpos contra a proteína de ativação de fibroblastos (FAP) geralmente são inespecíficos. Certifique-se de incluir controles positivos e negativos apropriados31,32. Diferentes métodos podem ser usados para avaliar a interferência entre fibroblastos e células tumorais. Aqui, duas abordagens alternativas são descritas, consistindo no tratamento de células tumorais com meio condicionado (MC) derivado de CAFs ou NFs, ou na co-cultura de fibroblastos e células tumorais. A eficácia de qualquer abordagem para aumentar a proliferação de células tumorais é descrita.

7. Preparação e concentração do meio condicionado

NOTA: O meio condicionado é concentrado e dosado com precisão após a coleta para facilitar a comparação entre diferentes células.

  1. Plaquear as células a 70% de confluência em um prato de 15 cm em cDMEM.
  2. No dia seguinte, mude para 15 mL de meio de fome (DMEM sem FBS) e incube por 48 h para produzir o CM.
  3. Colete o CM, centrifugue a 300 x g por 5 min em RT e filtre através de um filtro de 0,22 μm para eliminar os detritos celulares e esterilizar.
  4. Transferir para tubos de concentração (MWCO 10.000 Da) e centrifugar 20 min a 2000 x g e 4 °C, ou de acordo com as instruções do fabricante, para obter cerca de 1 ml do CM concentrado (conCM), ou seja, 15 x concentração.
  5. Alíquota do conCM e armazenar a -80 °C.
  6. Quantificar o teor proteico do conCM coletado usando um ensaio de proteína colorimétrica.
    NOTA: A concentração média obtida é de 0,5 e 2 μg/μL. Concentrações mais baixas ainda podem ser usadas.

8. Ensaio de proliferação

NOTA: A proliferação celular (usando linhagens celulares de CaP humano DU145 ou LNCaP) foi avaliada usando um instrumento de análise de células vivas em duas configurações diferentes, tratando as células tumorais com conCM ou co-cultivando-as com CAFs ou NFs. Nesse caso, devem ser utilizadas células tumorais fluorescentes. Os resultados representativos são mostrados na Figura 3.

  1. Ensaio de proliferação após tratamento com conCM
    NOTA: Este protocolo é otimizado para células DU145; células diferentes podem exigir ajustes.
    1. Células tumorais em placas cDMEM em uma placa de 96 poços (750 células/poço), considerando pelo menos 3 repetições por condição, e incubar O/N.
    2. Substituir o cDMEM por meio de inanição, suplementado ou não, por 50 μg/mL de conCM.
    3. Transfira a placa para a câmara do instrumento de análise de células vivas dentro da incubadora.
    4. Deixe aquecer a 37 °C durante 30 min e, em seguida, inicie o primeiro escaneamento.
    5. Use o canal de contraste de fase, escolhendo uma objetiva apropriada e o número de campos/poço desejados (objetiva de 10x e 5 campos/poço são recomendados) e tipo de varredura padrão. Escaneie a cada 6 h por 4-5 dias (a duração deve ser determinada empiricamente para condições e tipos de células).
    6. Realize a análise de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
    7. Calcule para cada poço (réplicas técnicas para cada condição) a mudança de dobra em relação ao seu valor no tempo zero. Gere os gráficos correspondentes e avalie a significância estatística usando o software apropriado.
  2. Ensaio de proliferação após co-cultura
    1. Co-placa 750 células DU145 que expressam RFP e CAFs ou NFs na proporção de 1:3 em cDMEM em uma placa de 96 poços.
    2. No dia seguinte, mude para 2% de DMEM FBS. Transfira a placa para a câmara do instrumento de análise de células vivas na incubadora e inicie a varredura padrão a cada 6 h por 4 dias, usando o contraste de fase e o canal laranja.
    3. Realize a análise de proliferação de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
    4. Calcule para cada poço (réplicas técnicas para cada condição) a mudança de dobra em relação ao seu valor no tempo zero. Gere os gráficos correspondentes e avalie a significância estatística usando o software apropriado.

9. Ensaio de migração de cicatrização de feridas

NOTA: Aqui, uma versão automatizada do ensaio clássico de arranhões33 é apresentada para medir a migração celular, usando um instrumento de análise de células vivas.

  1. Células tumorais em placa em uma placa de 96 poços adequada para o instrumento de análise de células vivas para obter uma monocamada confluente.
  2. No dia seguinte, trate as células com 10 ug/mL de mitomicina C por 2 h.
    NOTA: Esta etapa é essencial para evitar a proliferação celular durante o ensaio, o que confundiria os resultados.
  3. Aplique o arranhão nos poços seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Lave com 100 μL de PBS para remover as células destacadas.
  5. Adicionar meio de inanição, com 50 mg/mL ou sem (controle).
  6. Coloque a placa na câmara de análise de células vivas na incubadora.
  7. Após 30 min, programe o protocolo de cicatrização de feridas recomendado, a cada 4 h por 1 dia ou mais, dependendo das células e condições.
  8. Analise os resultados de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).

10. Crescimento independente da ancoragem pelo ensaio do ágar mole

  1. CAFs ou NFs de placas a 70% de confluência em placas de 12 poços, deixando três poços vazios como controle.
  2. No dia seguinte, prepare uma solução estoque de ágar mole 4x (3,6%) adicionando 0,45 g de ágar de baixo ponto de fusão a 12,5 mL de PBS em um tubo cônico de 50 mL em condições estéreis.
  3. Dissolva em um forno de micro-ondas. Cuidado com a fervura excessiva que faria com que a solução se concentrasse.
  4. Arrefecer a 37 °C e, em seguida, preparar uma solução de trabalho 1x diluindo 1:4 com cDMEM pré-aquecido.
  5. Aspire o meio da placa de 12 poços e adicione 500 μL de solução de ágar 1x a cada poço.
  6. Deixar solidificar durante 20 min a 4 °C, enquanto armazena o resto da solução de ágar a 37 °C.
  7. Enquanto isso, tripsinize as células tumorais e prepare uma suspensão celular de 2 x 104 células / mL.
  8. Misture volumes iguais da suspensão celular e da solução de ágar 1x pipetando várias vezes e dispense 500 μL (ou seja, 5000 células) no topo da primeira camada de ágar em cada poço. Certifique-se de preparar pelo menos 10% de excesso de suspensão celular.
  9. Deixe o ágar-ágar solidificar incubando por 20 min a 4 °C.
  10. Adicione 1 mL de cDMEM a cada poço e renove-o a cada dois dias, aspirando suavemente o meio da borda do poço e adicionando o meio fresco ao centro, quase gota a gota para evitar o deslocamento da camada de ágar macio.
  11. Incube até que apareçam colônias facilmente visíveis. As células DU145 geralmente levam cerca de 12 dias, com pequenas variações.
  12. Descarte as colônias de meio e corante adicionando 200 μL de solução de cloreto de nitroazul de tetrazólio (1 mg / mL em PBS). Incubar durante a noite a 37 °C em uma incubadora umidificada.
  13. Uma vez que as colônias estejam coradas, descarte a solução de corante e adquira imagens usando um estereomicroscópio. Coloque a placa na platina do microscópio e defina a ampliação para seu valor mais baixo (0,8x) para garantir que todo o poço esteja visível. Use o botão de foco grosso para focar as colônias com nitidez e, em seguida, ajuste as configurações de iluminação e modo antes de capturar as imagens.
  14. Use o software apropriado34 para quantificar o número de colônias e a área ocupada seguindo as etapas fornecidas no Arquivo Suplementar 1.
  15. Pontue o número e a distribuição de tamanho das colônias (ver Figura 4).

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Resultados

Os pares CAF e NF de 7 pacientes com CaP de alto grau foram isolados com sucesso com este protocolo. A idade dos pacientes na cirurgia e os escores de Gleason estão resumidos na Tabela 3. Para avaliar a pureza das populações de fibroblastos derivados, a passagem de dois CAFs e NFs primários foi destacada e corada com os anticorpos fluorescentes indicados ou com iodeto de propídio para avaliar a apoptose. Os resultados representativos da análise FACS subsequente são mostr...

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Discussão

A derivação e análise de células do tecido CaP fornecem um modelo experimental relevante, particularmente considerando que os modelos animais disponíveis não replicam totalmente a anatomia da próstata humana e a progressão da doença37. As glândulas prostáticas dos chimpanzés são anatomicamente semelhantes às dos humanos, mas apresentam uma progressão lenta e estocástica da doença, além de implicar limitações éticas. Os cães diferem significativamente na estrutura ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Associação Italiana de Pesquisa do Câncer (AIRC), IG16930 e IG24851 ao VP; o Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa (MIUR PRIN 2017 e 2022 a V.P.); a Fundação Truus e Gerrit van Riemsdijk, Liechtenstein, doação para VP; Região do Piemonte (Desviar). A.S. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da Fundação Italiana de Pesquisa do Câncer (FIRC), e L.A. foi apoiado pela Fondazione Umberto Veronesi. Figura 2 foi criado com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 12 poçosSarstedt833921
Placa de 24 poçosSarstedt833922
Placa de 6 poçosSarstedt833920
Placa de 96 poçosSarstedt833924
mAb de camundongo anti-GAPDH (6C5)Sigma AldrichCB1001Fonte: Mouse; Diluição para WB: 1:1000
aSMASigma AldrichA5228 Fonte: Mouse; Diluição para WB: 1:3000
CaveolinaTecnologia de sinalização celularCST3267Fonte: Coelho; Diluição para WB: 1:1000
CD31-VioBlueMilteny Biotec130-119-980Citometria de fluxo Ab, marcador de células endoteliais
CD326-PE (EpCAM)Milteny Biotec130113-826Citometria de fluxo Ab, marcador de células epiteliais
CD45-FITCMilteny Biotec130-110769Citometria de fluxo Ab, marcador de leucócitos Pan
CD90-APCMilteny Biotec130-114-903Citometria de fluxo Ab, marcador de fibroblastos
Colágeno VI (COL6A1)AbcamAB182744Fonte: Coelho; Diluição para WB: 1:1000
Tubo cônico 15 mLSarstedt62554502
Tubo cônico 50 mLSarstedt62547254
Microtubos Cryopure 2 mLSarstedt72380992
Placa de cultura com 100 mm de diâmetro Corning353003
Placa de cultura com 100 mm de diâmetro Corning353025
Placa de cultura 60 mm de diâmetro Corning353002
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma AldirchD8418Uso em um capuz biológico
Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)Gibco11965092Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
FAPAbcamAB53066Fonte: Coelho; Diluição para WB: 1:500
Reagente de bloqueio FcR, humanoMilteny Biotec130-059-901Bloqueador Fc
Soro fetal bovino (FBS)Gibco16000044Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Pontas filtradas 10 µ LSarstedt703010255
Pontas filtradas 100 µ LSarstedt703030255
Pontas filtradas 1000 µ LSarstedt703060255
Pontas filtradas 20 µ LSarstedt703030265
Pontas filtradas 200 µ LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ m Sarstedt831826102
Pinça2Biol1102412
FSP1/S100A4Tecnologia de sinalização celularD9F9D (13018)Fonte: Coelho; Diluição para WB: 1:2000
IL6Tecnologia abclonalA0286Fonte: Coelho; Diluição para WB: 1:1000
ImagemJInstituto Nacional de SaúdeVersão 1.53cSoftware para análise de imagens
Placa de 96 poços Incucyte ImageLockSartórioBA-04857
Incucyte® SX5SartórioSX5Instrumento de análise de células vivas
Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000ThermoFisher Scientific11668019reagente de transfecção mediado por lipídios catiônicos
MACS® Solução de armazenamento de tecidoMilteny Biotec130-100-008
Leitor de microplacas (absorbância de 600 nm)PromegaGM3500
Microtubos 1,5 mL Sarstedt7269001
NcadAbcamAB18203Fonte: Coelho; Diluição para WB: 1:1000
Nitro Blue Tetrazolium Sigma AldirchN5514
Parafilme Sigma AldirchHS234526B
pBABE-puro-hTERTAddgene1771Armazene a -20 > C, uso em um capuz biológico
pCL-AmphoNovus BiológicoNBP2-29541Armazene a -20 > C, uso em um capuz biológico
PDGFRBSanta CruzSC-432Fonte: Coelho; Diluição para WB: 1:1000
Penicilina-estreptomicina (PS, 10.000 μ g/mL) Gibco15140122Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Microscópio de contraste de fase Olympus BX42
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)CaseiroNaCl, 137 mM; KCl, 2,7 mM; Na2HPO4, 10 mM;KH2PO4, 1,8 mM. Autoclave e Loja em RT
Solução de poli-L-lisinaSigma AldirchPág. 8920Armazene a 4 ° C, uso em um capuz biológico
Dicloridrato de puromicinaSigma AldirchPág. 8833
Balança Secura Semi MicroSartoriusSECURA125-1S
Pipeta sorológica 10 mL Sarstedt861254001
Pipeta sorológica 2 mL Sarstedt861252001
Pipeta sorológica 25 mL Sarstedt861256001
Pipeta sorológica 5 mL Sarstedt861253001
ESTATÍSTICA 3CST9139Fonte: Mouse; Diluição para WB: 1:1000
STAT3 Y705CST9131Fonte: Coelho; Diluição para WB: 1:1000
estereomicroscópioLeicaMZ125
Seringa 10 mLPentaferteNº 00202260D12
TermoMixerEppendorph22331
Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenolGibco15400054
VimSanta CruzSC-6260Fonte: Mouse; Diluição para WB: 1:2000
Concentrador centrífugo Vivaspin 20Sigma AldirchZ614602MWCO 10.000 Da 
Tesoura Wagner2Biol14070-12

Referências

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