Sequenciamento de Amplicon usando as tecnologias de sequenciamento de leitura longa

A tuberculose (TB) continua a ser uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo e representa um desafio contínuo de saúde pública, especialmente em países de baixa e média renda ^1,2. Apesar das iniciativas destinadas a melhorar as medidas de controle da TB, os avanços têm sido lentos, em parte devido às dificuldades em obter técnicas diagnósticas rápidas, precisas, econômicas e abrangentes ^3,4,5. Embora os métodos de diagnóstico molecular, como ensaios de sonda de linha (LPAs) e testes automatizados de amplificação de ácido nucleico (NAATs), tenham acelerado a identificação de TB e TB resistente a medicamentos (DR-TB), sua detecção limitada de mutação restringe o teste completo de suscetibilidade a medicamentos (DST). Essa limitação é particularmente significativa em países com alta carga de TB 6,7,8,9.

Para lidar com essas limitações, a Organização Mundial da Saúde (OMS) recomendou o uso de tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS), que surgiram como ferramentas poderosas para vigilância e detecção de resistência à TB^10,11. Tanto o sequenciamento do genoma completo (WGS) quanto as abordagens de NGS direcionado (tNGS) oferecem uma cobertura de mutação mais ampla, permitindo a identificação de variantes associadas à resistência em vários medicamentos 8,12,13,14,15. Embora o sequenciamento do genoma completo (WGS) forneça um relatório DST abrangente, sua dependência da cultura o torna inadequado para diagnósticos rápidos, pois a cultura pode levar até seis semanas 15,16,17. O NGS direcionado oferece uma alternativa melhor, pois não depende da cultura; O sequenciamento pode ser realizado diretamente de espécimes clínicos¹⁸. Como resultado, a OMS recomendou o uso de três ensaios de tNGS para DST: Ensaio Deeplex Myc-TB: Este ensaio detecta resistência à rifampicina, isoniazida, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos (amicacina, canamicina, capreomicina), etambutol, pirazinamida e etionamida 19,20,21. Ensaio de TB sentinela: Tem como alvo a resistência à rifampicina, isoniazida, fluoroquinolonas e drogas injetáveis de segunda linha^18,20. Ensaio AQ-TB: identifica resistência à rifampicina, isoniazida, fluoroquinolonas e medicamentos injetáveis de segunda linha. Esses ensaios foram otimizados para uso na plataforma de leitura curta devido à sua alta precisão²⁰. As plataformas de leitura longa ONT MinION, por outro lado, fornecem dados em tempo real, portabilidade e potencial de implementação econômica^22,23. No entanto, o uso generalizado de NGS é limitado pelas demandas de infraestrutura e custo, especialmente com sistemas de leitura curta¹⁰.

O ensaio Deeplex é o mais abrangente dos três ensaios recomendados. O ensaio foi originalmente projetado para realizar PCR multiplex em 18 regiões associadas à resistência a 13 medicamentos anti-TB. No entanto, a OMS recomendou para 10 medicamentos anti-TB, indicando sensibilidade e especificidade suficientes. Este estudo otimizou-o para uso com o ONT MK1B MinION, uma plataforma de sequenciamento de leitura longa. O sistema de célula de fluxo portátil e reutilizável desta plataforma reduz os custos de infraestrutura e potencialmente sequenciamento por amostra ^4,22,23. Embora outros ensaios compatíveis com leitura longa tenham sido desenvolvidos, eles tendem a ter um escopo limitado de DST, normalmente visando apenas uma faixa estreita de genes de resistência. Em contraste, o ensaio oferece ampla cobertura de alvos, tornando-o uma ferramenta de diagnóstico mais abrangente para DST descentralizado^24,25. Uma lista detalhada dos alvos genômicos amplificados pelo ensaio e suas associações de medicamentos correspondentes é fornecida na Tabela 1, destacando as capacidades diagnósticas do ensaio²⁵.

Antes da extração do DNA, as amostras devem ser descontaminadas e inativadas em condições de Nível de Biossegurança 3 (BSL-3), seguindo as precauções de segurança necessárias 25,26,27. A amplificação interna e os controles externos devem ser incorporados em cada corrida, com a contaminação rastreada por meio de controles negativos e avaliações laboratoriais de rotina²⁵. Métricas de qualidade importantes, incluindo profundidade de leitura, amplitude de cobertura e sucesso de amplificação, devem ser avaliadas após o sequenciamento. Para sequenciamento direcionado, a OMS aconselha uma profundidade mínima de leitura de 100x para cada amplicon e cobertura adequada de todas as regiões de resistência a medicamentos direcionadas para permitir a detecção de variantes menores presentes em ≥5%²⁸. A Organização Mundial da Saúde endossa esses métodos de sequenciamento direcionados para identificar resistência a medicamentos de primeira e segunda linha, assumindo que sistemas de garantia de qualidade sejam estabelecidos e que todas as regiões-alvo sejam suficientemente cobertas²⁸.

Esta pesquisa foi conduzida como parte do projeto TS ELiOT, que recebeu aprovação ética do Comitê de Ética em Pesquisa Humana (HREC) da Universidade de Stellenbosch (N21/09/093) em 20 de outubro de 2021. Além disso, obteve autorização da Western Cape Health Research para o uso de instalações governamentais. As amostras foram coletadas por meio de um esforço colaborativo com o NHLS Green Point e a Universidade de Stellenbosch, sob o número de aprovação SU HREC N09/11/296. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da amostra

1. Inativação de calor
   1. Incubar as culturas MGIT a 80 °C durante 1 h para obter a inativação completa do calor em condições BSL-3.
   2. Prossiga com a extração de DNA usando o método InstaGene²⁹.
2. Extração de DNA
   1. Coloque 5 mL de cultura de MGIT inativada por calor em um tubo de 15 mL.
   2. Centrifugue a 4000 x g por 30 min em temperatura ambiente (RT).
   3. Remova cuidadosamente o sobrenadante pipetando, deixando o sedimento.
   4. Adicione 200 μL de reagente de extração de DNA à base de quelação ao sedimento e incube a 56 °C por 15 min.
   5. Transfira a solução para um tubo com tampa de rosca de 2 ml e adicione três esferas de vidro de 2 mm de diâmetro a cada uma.
   6. Vortex por 10 s para espalhar as células e colocar os tubos em uma incubadora de banho seco a 100 ° C por 8 min.
   7. Homogeneizar as amostras usando o homogeneizador de batimento de esferas com as seguintes configurações: 3 ciclos de 20 s a 4,0 m/s.
   8. Centrifugue a 12.000 x g por 15 min em RT e transfira cuidadosamente 130 μL do sobrenadante (líquido contendo DNA) para um tubo de 1,5 mL, evitando sedimentos e detritos.
   9. Ressuspenda as esferas por movimento ou vórtice e adicione 156 μL das esferas ao tubo de 1,5 mL contendo o DNA extraído.
   10. Pipete lentamente para cima e para baixo 10 vezes para misturar e incubar em RT por 5 min.
   11. Coloque os tubos em um rack magnético por 5 min para separar as esferas ligadas ao DNA.
       NOTA: Um sobrenadante claro deve aparecer acima de um pellet compacto de esferas magnéticas escuras na lateral do tubo voltado para o ímã, indicando prontidão para remoção do sobrenadante.
   12. Pipetar o sobrenadante sem perturbar os grânulos.
   13. Adicione 100 μL de etanol a 80% recém-preparado ao pellet de esferas enquanto estiver no rack e deixe por 30 s, depois remova o etanol. Repita a etapa de lavagem.
   14. Seque o pellet de esferas ao ar em RT por 5 min. Certifique-se de que o pellet do grânulo pareça fosco e que nenhum líquido visível permaneça antes de prosseguir para a próxima etapa.
   15. Remova o tubo do rack magnético.
   16. Adicione 25 μL de água livre de nuclease (NFW) diretamente nas esferas secas e ressuspenda pipetando suavemente para cima e para baixo 10 vezes.
   17. Incubar em RT por 5 min.
   18. Retorne o tubo ao suporte magnético por mais 5 min.
   19. Transfira cuidadosamente o DNA eluído (sobrenadante) para um novo tubo de 1,5 mL.
   20. Meça a concentração de DNA usando o reagente de quantificação dsDNA baseado em fluorescência de alta sensibilidade.
       NOTA: O DNA pode ser armazenado em um freezer a -20 °C ou prosseguir com PCR.
3. Amplificação (PCR)
   1. PCR multiplex e limpeza pós-PCR, seguindo as instruções do fabricante²⁵.
   2. Meça a concentração de DNA usando o reagente de quantificação dsDNA baseado em fluorescência de alta sensibilidade.
4. Eletroforese em gel
   1. Prepare um gel de agarose a 2% dissolvendo o pó de agarose em 1x tampão TAE por meio de aquecimento por micro-ondas até derreter completamente.
   2. Adicione 5 μL de corante de gel de DNA fluorescente não tóxico à agarose derretida e misture bem.
   3. Despeje a mistura de gel em uma bandeja de fundição de gel equipada com um pente para formar poços.
   4. Deixe o gel solidificar em RT.
   5. Depois de solidificado, remova o pente e coloque a bandeja de gel no tanque de eletroforese cheio com 1x tampão TAE.
   6. Carregue 5 μL de uma escada de DNA kb misturada com 5 μL de tampão de carregamento no primeiro poço.
   7. Para cada produto de PCR, misture 5 μL do produto com 5 μL de tampão de carga e carregue em poços individuais.
   8. Execute o gel a 100 V por 1 h.
   9. Visualize as bandas de DNA usando o sistema de documentação de gel com transiluminação.

2. Preparação da biblioteca ONT

1. Preparação final
   1. Calcule 100 ng de cada amostra de amplicon com base na concentração e transfira o volume necessário para um tubo de PCR limpo.
   2. Para calcular a massa total (em ng) de amplicons em uma determinada amostra, multiplique a concentração da amostra (ng/μL) pelo seu volume restante (μL) após o controle de qualidade (CQ).
      NOTA: Por exemplo, se uma amostra tiver uma concentração de 2 ng/μL e um volume restante de 1 μL pós-QC, a massa total do amplicon é:
      Massa total = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      Para preparar 10 ng de amplicons para sequenciamento, use a fórmula de diluição:
      C₁V₁ = C₂V₂
      Onde: C₁ = 45 ng, V₁ = desconhecido, C₂ = 10 ng, V₂ = 1 μL, V₁ = (C₂ × V₂) / C₁ = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      Assim, μL da amostra inicial do amplicon deve ser usado para obter 10 ng de DNA para sequenciamento.
   3. Ajuste o volume total de cada amostra para 12,5 μL usando NFW.
   4. Misture as amostras delicadamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes e gire brevemente.
   5. Adicione 1,75 μL de tampão de reação de reparo final e cauda A e 0,75 μL de mistura de enzimas de reparo final e cauda A a cada amostra.
   6. Misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes e gire brevemente para baixo.
   7. Incubar os tubos em um termociclador a 25 °C por 30 min, seguido de 65 °C por 30min.
      NOTA: Nesta fase, caso o usuário decida interromper o processo, é aconselhável utilizar grânulos para a purificação do DNA preparado para o fim. O ADN purificado pode então ser armazenado a 4 °C durante um período máximo de sete dias.
2. Ligação de código de barras nativa
   1. Descongele e prepare as esferas magnéticas para purificação de DNA e seleção de tamanho, contas de limpeza de DNA paramagnético, EDTA e códigos de barras nativos (NB01-96) de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, coloque-as no gelo.
   2. Em novos tubos de PCR, adicione o seguinte em sequência: 2,75 μL de água livre de nuclease, 1 μL de DNA preparado para a extremidade, 1,25 μL de códigos de barras nativos (NB01-96) e 5 μL de mistura de enzimas de ligação ao DNA.
   3. Misture cada reação pipetando suavemente 10 vezes, gire brevemente usando uma microcentrífuga e incube por 20 min em RT.
   4. Adicione 1 μL de EDTA a cada poço, misture bem pipetando e gire brevemente.
   5. Agrupe amostras com código de barras em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   6. Ressuspenda os grânulos de limpeza de DNA por vórtice e adicione 0,7x o volume total da amostra agrupada (por exemplo, para 23 amostras com um volume total de 253 μL, adicione 177,1 μL de grânulos).
   7. Misture a solução pipetando e incube em um HulaMixer por 10 min em RT.
   8. Prepare 2 mL de etanol a 80% misturando 1600 μL de etanol puro com 400 μL de NFW.
   9. Coloque o tubo em um rack magnético por 5 min até que o eluído esteja límpido e incolor.
   10. Remover e rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
   11. Lave os grânulos com 700 μL de etanol a 80% recém-preparado sem perturbar o pellet, depois remova e descarte o etanol.
   12. Repita a etapa de lavagem com etanol.
   13. Centrifugue o tubo brevemente, retorne ao rack magnético e remova o etanol residual.
   14. Deixe as contas secarem ao ar por 30 s.
   15. Remova o tubo do rack magnético, ressuspenda os grânulos em 35 μL de água livre de nuclease por movimentos suaves e incube a 37 ° C por 10 min.
   16. Retorne o tubo ao suporte magnético até que o eluído esteja límpido e incolor.
   17. Transfira 35 μL do eluato para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL para as etapas subsequentes.
       NOTA: A biblioteca pode ser armazenada a 4 °C durante a noite nesta fase.
3. Ligação e limpeza do adaptador
   1. Prepare o kit de reagentes de ligação rápida de DNA de acordo com as instruções do fabricante e coloque-o no gelo.
   2. Misture o Adaptador Nativo (NA) e a Ligase Rápida pipetando e coloque no gelo.
   3. Descongele o tampão de eluição (EB) em RT, vórtice, centrífuga e coloque-o no gelo.
   4. Descongele o tampão de fragmento curto (SFB) em RT, vórtice, centrífuga e coloque no gelo.
   5. Em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação de 1,5 mL, misture o seguinte: 30 μL de amostra agrupada com código de barras, 5 μL de adaptador nativo (NA), 10 μL de tampão de reação de ligação rápida e 5 μL de T4 DNA ligase de ação rápida.
   6. Pipete suavemente para misturar, centrifugue brevemente e incube por 20 min em RT.
   7. Ressuspenda os grânulos de limpeza do DNA por vórtice e adicione 20 μL (0,4x) de grânulos à reação.
   8. Misture delicadamente pipetando e incube em um HulaMixer por 10 min em RT.
   9. Esfolar as esferas numa cremalheira magnética e aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
   10. Lave as esferas adicionando 125 μL de Short Fragment Buffer (SFB), ressuspenda sacudindo, centrifugue brevemente e retorne ao rack magnético.
   11. Pellet as contas e aspirar o sobrenadante; Repita a etapa de lavagem uma vez.
   12. Centrifugue brevemente, retorne o tubo ao suporte magnético e aspire qualquer sobrenadante residual.
   13. Remova o tubo do rack magnético e ressuspenda os grânulos em 15 μL de tampão de eluição (EB).
   14. Centrifugar brevemente e incubar a 37 °C durante 10 minutos para eluir o ADN.
   15. Coloque o tubo no rack magnético, peletize as esferas até que o eluato esteja límpido e incolor e aspire 15 μL do eluato em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL.
   16. Quantificar 1 μl do eluído.
   17. Dilua a biblioteca para 20 fmol (calcule usando a calculadora NEB) e use 12 μL da biblioteca preparada de 20 fmol para sequenciamento na célula de fluxo R10.4.1.
       NOTA: A biblioteca agora pode ser armazenada a -20 °C, permitindo o uso repetido.
4. Preparando e carregando a célula de fluxo de sequenciamento de nanoporos
   1. Descongele o Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB), Flow Cell Tether (FCT) e Flow Cell Flush (FCF) em RT, misture-os por vórtice e gire-os para baixo.
   2. Prepare a mistura de escorva de células de fluxo combinando 5 μL de albumina de soro bovino (BSA, 50 mg / mL), 30 μL de corda de célula de fluxo (FCT) e 1170 μL de fluxo
   3. Abra a porta de escorva da célula de fluxo, aspire ~ 20 μL de tampão para remover bolhas de ar, carregue 800 μL da mistura de escorva na porta de escorva sem introduzir bolhas de ar e aguarde 5 min.
   4. Prepare a biblioteca misturando 37,5 μL de tampão de sequenciamento (SB), 25,5 μL de Library Beads (LIB) ou Library Solution (LIS) e 12 μL da biblioteca de DNA de 20 fmol em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misturando completamente por pipetagem.
   5. Prepare a célula de fluxo novamente levantando suavemente a tampa da porta de amostra da célula de fluxo, carregando 200 μL da mistura de escorva na porta de escorva sem introduzir bolhas de ar e preparando a biblioteca para carregamento.
   6. Misture a biblioteca preparada suavemente pipetando e carregue 75 μL da biblioteca na porta de amostra da célula de fluxo de sequenciamento gota a gota, garantindo que cada gota flua para a porta antes de adicionar a próxima.
   7. Feche a tampa da porta de amostra da célula de fluxo, garantindo que o tampão entre na porta de amostra da célula de fluxo e, em seguida, feche a porta de escorva.
   8. Conecte o dispositivo de sequenciamento portátil a um computador (com uma fonte de alimentação ininterrupta) e inicie o sequenciamento usando um software de controle e análise de dispositivo de sequenciamento.
5. Parâmetros de software
   NOTA: Este aplicativo de software, desenvolvido pela ONT, é utilizado para o gerenciamento abrangente de execuções de sequenciamento e a geração de relatórios detalhados.
   1. Para iniciar o processo de sequenciamento, selecione a opção Iniciar seguida de Iniciar sequenciamento.
      NOTA: Em seguida, será solicitado que você designe uma pasta para armazenamento de arquivos e forneça um nome para a execução do sequenciamento, por exemplo, "sequencing_run_1". Depois, clique em Continuar para as configurações para selecionar o nome do kit apropriado, como library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, e personalize o tempo de execução desejado, por exemplo, 20 h (o tempo máximo de execução é 72 h).
   2. Em seguida, escolha o tipo de arquivo de saída, selecionando entre opções como POD5 para leituras de saída brutas e FASTQ para saídas basecalled. Em seguida, selecione o modelo FAST-Basecalling.
   3. Observe que algumas das configurações padrão incluem varredura frequente de poros a cada 1.5 h, um comprimento mínimo de leitura de 200 bp e uma pontuação de qualidade mínima de 8. Por fim, revise as configurações e inicie o processo de leitura.

3. Análise pós-sequenciamento

1. Requisitos do sistema
   NOTA: Guia para configurar o ambiente e analisar os dados de sequenciamento de amplicon do Mycobacterium tuberculosis usando o pipeline ONT-TB-NF. As instruções atendem a usuários do Windows (via WSL) e macOS.
   1. Use o seguinte - Sistema operacional: Windows 10/11 (com WSL2) ou macOS; Memória: Mínimo de 8 GB de RAM (16 GB recomendado); Armazenamento: Pelo menos 50 GB de espaço livre em disco; Internet: Necessário para baixar pacotes e dados; Permissões: Capacidade de instalar software e gerenciar ambientes.
2. Verifique a seguinte configuração de ambiente: Usuários do Windows (usando WSL2). Habilite o WSL2.
   1. Abra o PowerShell como Administrador e execute: wsl - install.
   2. Reinicie o computador quando solicitado.
3. Instale o Ubuntu
   1. Após reiniciar, inicie a Microsoft Store, procure por Ubuntu e instale a versão preferida (por exemplo, Ubuntu 22.04 LTS).
   2. Inicie o Ubuntu no menu Iniciar .
   3. Crie um novo nome de usuário e senha do UNIX quando solicitado.
   4. Listas de pacotes de atualização: sudo apt update && sudo apt upgrade -y.
4. Usuários do macOS
   1. Instale o Homebrew (se ainda não estiver instalado): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
   2. Instale os pacotes necessários: brew install git wget
5. Instalando o Conda ou Mamba
   1. Visite a página de download do Miniconda para baixar o instalador correto para o sistema operacional.
   2. Para instalar o Miniconda, execute o instalador e siga as instruções na tela. Após a conclusão da instalação, reinicie o terminal.
   3. Configurar canais Conda:
      conda config --add channels defaults
      conda config --add channels bioconda
      conda config --add channels conda-forge
   4. Instalando o Mambaforge (Mamba)
      Para Linux:
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      Para macOS:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
   5. Instale o Mambaforge: bash Mambaforge-*.sh
   6. Siga as instruções para concluir a instalação e reinicie o terminal para ativar o Mamba.
6. Configurando o pipeline ONT-TB-NF
   1. Crie um novo ambiente Conda: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
   2. Alternativamente, use Mamba: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
   3. Ative o ambiente: conda ative ont_tb_env
   4. Instale o Nextflow: curl -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
   5. Clone o repositório ONT-TB-NF: git clone https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
   6. Extrair imagens necessárias do Docker (se estiver usando o Docker)
      docker pull hkubal/clair3:v0.1-r12
      docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
7. Executando o pipeline
   1. Concatene os arquivos FASTQ Basecalled de cada amostra de forma independente usando o comando a seguir.
      gato *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow run run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /caminho/para/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /caminho/para/amplicon_regions.cama \
      tópicos 16 \
      output_dir /absoluto/caminho/para/output_directory
8. Arquivos de saída e interpretação
   1. Após a execução bem-sucedida, certifique-se de que o pipeline gere as seguintes saídas no diretório de saída especificado:
      1. Leituras alinhadas: arquivos *.bam.
      2. Chamadas variantes: *.vcf arquivos contendo SNPs e indels.
      3. Relatórios resumidos: arquivos *.csv ou *.tsv resumindo mutações de resistência a medicamentos e outras métricas relevantes.
      4. Relatórios de controle de qualidade: arquivos *.htmL gerados por ferramentas como o MultiQC.
      5. Logs: logs detalhados da execução do pipeline.
      6. Arquivos intermediários: Armazenados no diretório work/ (podem ser excluídos após a execução bem-sucedida).
         NOTA: No caso de encontrar erros de permissão, é essencial verificar se possui as permissões necessárias para ler e gravar arquivos, bem como para executar scripts. Em relação às questões ambientais, certifique-se de que o ambiente Conda apropriado seja ativado antes de executar o pipeline. Para aqueles que utilizam perfis do Docker, é imperativo confirmar se o Docker está instalado e operacional. Além disso, deve-se monitorar meticulosamente os recursos do sistema para evitar quaisquer limitações de memória ou armazenamento durante a execução. Uma visão geral dessas metodologias é apresentada na Figura 1.

O método de extração de DNA selecionado foi escolhido por sua eficiência e rendimento superior em comparação com outras técnicas rápidas. Ele produziu consistentemente DNA genômico de alta qualidade (gDNA) e a integração de uma etapa de limpeza baseada em grânulos ajudou a minimizar o tempo de processamento e reduzir os custos por amostra. Isso foi alcançado eliminando a necessidade de avaliações adicionais de controle de qualidade, como medições espectrofotométricas, com a fluorometria como a única ferramenta de quantificação de DNA. As concentrações pós-PCR foram consideradas ideais para sequenciamento nas plataformas de leitura curta e longa (Tabela 2). A integridade do amplicon foi confirmada por meio da análise de fragmentos por eletroforese em gel de agarose (Figura 2). No entanto, os isolados 89 e 136 foram excluídos do sequenciamento de leitura longa devido à concentração insuficiente de amplicon, conforme refletido na Tabela 2 e na Figura 2.

O fluxo de trabalho completo, desde a extração de DNA até a geração de resultados na plataforma de leitura longa, foi concluído em 36 horas, excluindo pausas, e provou ser compatível com o tempo de resposta necessário para o sequenciamento de leitura curta (Tabela 3). Os dados de sequenciamento de leitura curta foram analisados usando um pipeline baseado na web otimizado para essa plataforma, enquanto os dados de leitura longa foram processados usando o pipeline ONT-NF-TB, conforme descrito na seção Protocolo.

Um total de 140 amostras foram analisadas, sequenciadas em 7 execuções em 7 pontos de tempo diferentes. A profundidade média de cobertura em todos os genes associados à resistência foi de 6087X para dados de leitura curta e 4462X para dados de leitura longa. A profundidade de cobertura variou entre genes e amostras, com o gene rrs exibindo a menor cobertura média em ambas as plataformas, 128,82X para leitura curta e 99,46X para leitura longa. Em contraste, o gene eis demonstrou a maior cobertura, com valores de 21.955,1X e 22.242,08X, respectivamente (Figura 3). Apesar dessa variabilidade, a amplitude da cobertura permaneceu consistentemente alta em 99,9% para ambas as abordagens de SEQUENCIAMENTO DIRECIONADO, indicando representação quase completa das regiões-alvo.

Uma análise comparativa dos resultados do sequenciamento revelou um alto nível de concordância entre as duas plataformas para vários medicamentos anti-TB importantes. Variantes de alta frequência associadas à resistência ao etambutol (EMB), fluoroquinolonas (FQs), canamicina (KAN), amicacina (AMK) e capreomicina (CAP) foram detectadas com 100% de concordância. Nenhuma mutação associada à resistência foi identificada para linezolida (LZD), bedaquilina (BDQ) ou clofazimina (CFZ) em nenhuma das plataformas. No entanto, observou-se concordância reduzida para as variantes associadas à estreptomicina, com uma taxa de 71,43%. A sensibilidade de detecção para os principais genes associados à resistência, rpoB (rifampicina (RIF)), katG/fabG1/ahpC/inhA (isoniazida (INH)), fabG1/inhA (etionamida (ETH)) e pncA (pirazinamida (PZA)), variou de 89,47% a 96,77%. No geral, a taxa de concordância para todas as variantes de alta frequência entre as duas plataformas foi de 93,02%. A discordância foi predominantemente observada em variantes de baixa frequência, que foram frequentemente detectadas pelo algoritmo de leitura curta, mas perdidas pelo pipeline de leitura longa (Tabela 4).

Figura 1: Visão geral do método, desde a preparação da amostra até a geração de um relatório a partir dos pipelines de análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise de fragmentos de amplicon de 21 isolados e 3 controles (controle positivo, controle interno e controle negativo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação da profundidade de cobertura entre os genes. O gráfico de violino exibe a profundidade de cobertura de leitura de sequenciamento, com dados de leitura curta mostrados em laranja e dados ONT em azul. O eixo x representa os genes, enquanto o eixo y indica o valor da profundidade de cobertura, oferecendo uma comparação visual da profundidade de sequenciamento entre as duas saídas de SEQUENCIAMENTO DIRECIONADO para cada gene. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: As regiões visadas pelos ensaios, juntamente com o medicamento correspondente associado à mutação nessas regiões específicas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Concentrações de qubit do DNA e subsequentes amplicons de PCR. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: A avaliação do tempo total desde a extração do DNA até a obtenção dos resultados. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Previsões de suscetibilidade a medicamentos. Uma comparação de 140 saídas de leitura curta e longa. Clique aqui para baixar esta tabela.

Nenhum.