É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Amostragem ambiental de micróbios fotossintéticos e seus vírus: do campo ao laboratório

1.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/68379

⸱

3 de julho de 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos métodos de amostragem das zonas eufóticas de ecossistemas marinhos e de água doce para isolar cianofagos (e seus hospedeiros) e processos pós-amostragem que enriquecem genótipos únicos e caracterizam a dinâmica de interação vírus-hospedeiro.

Resumo

A amostragem ambiental de microrganismos fotossintéticos e seus vírus desempenha um papel crítico na compreensão da biodiversidade marinha e de água doce contemporânea e da dinâmica do ecossistema, bem como nos impactos dos fatores relacionados às mudanças climáticas (por exemplo, aumento das temperaturas e acidificação) nas trajetórias evolutivas das espécies e na composição da comunidade. Infelizmente, a diversidade da virosfera não suporta uma única amostragem universal e fluxo de trabalho experimental. De fato, cada sistema de vírus possui recursos exclusivos, que exigem modificações nos protocolos padrão em virologia para atingir os objetivos da pesquisa. Embora a descoberta e caracterização de vírus exija abordagens específicas para o sistema alvo, para todos os vírus, os objetivos da pesquisa são semelhantes: isolar o vírus; determinar a gama de hospedeiros; confirmar infecção produtiva; e caracterizar o vírus, o hospedeiro e a dinâmica vírus-hospedeiro. Descrições robustas de sistemas vírus-hospedeiro consistem minimamente em elucidar morfologia, fisiologia, bioquímica e perfis ômicos. Mais informações podem ser obtidas manipulando o sistema alterando fatores como multiplicidade de infecção, temperatura, pH, troca de hospedeiro, evolução direcionada ou aplicação de drogas para observar a resposta do sistema vírus-hospedeiro. Nosso laboratório estuda vírus em todos os domínios da vida (Archaea, Bacteria e Eukarya). Neste relatório, detalhamos métodos para amostragem de micróbios fotossintéticos da zona eufótica de ambientes de água doce e marinhos com foco no isolamento de bacteriófagos (ou seja, cianofagos) de cianobactérias. As cianobactérias são espécies-chave críticas para a produção primária e ciclagem de nutrientes nesses ecossistemas aquáticos. O fluxo de trabalho descrito se estende desde a amostragem de águas em diferentes profundidades até a caracterização de características do sistema vírus-hospedeiro usando cultura de meios líquidos e sólidos, métodos moleculares/genéticos avançados e abordagens analíticas. Os métodos descritos são adaptáveis à descoberta de bacteriófagos e vírus em sistemas vírus-hospedeiros em todos os domínios da vida.

Introdução

Caracterizar a dinâmica de infecção e as relações evolutivas dos cianofagos e seus hospedeiros é fundamental para entender os estados atuais e futuros dos ecossistemas marinhos e de água doce. Técnicas avançadas de sequenciamento de alto rendimento e métodos analíticos modernos permitem o sequenciamento rápido de genomas de cianofagos (e hospedeiros) para estudar as relações vírus-hospedeiro 1,2. No entanto, os fluxos de trabalho começam com amostragem ambiental para isolar e identificar vírus e seus hospedeiros 3,4,5. Devido à diversidade da virosfera, não existe um protocolo único para amostragem e caracterização de todos os vírus e bacteriófagos. De fato, cada sistema hospedeiro de vírus tem suas características únicas. No entanto, os objetivos básicos são semelhantes, independentemente do sistema de vírus que está sendo explorado: isolar o vírus; determinar a gama de hospedeiros; demonstrar infecção produtiva em um ou mais hospedeiros; caracterizar a dinâmica de infecção vírus, hospedeiro e vírus-hospedeiro usando abordagens qualitativas e quantitativas. Uma compreensão avançada do sistema de vírus pode ser examinada perturbando o sistema. A alteração de parâmetros como multiplicidade de infecção (MOI)6, temperatura, pH, cepa do hospedeiro ou pela aplicação de medicamentos para determinar como o sistema responde, fornece informações adicionais sobre a natureza da dinâmica vírus-hospedeiro. Manipulações mais avançadas, como a evolução dirigida, podem fornecer informações adicionais sobre a trajetória evolutiva potencial do sistema e como os desfechos coevolutivos podem impactar a comunidade microbiana e o ecossistema mais amplos.

Neste estudo, apresentamos um protocolo modelo (mas prontamente adaptável) para amostragem ambiental de micróbios fotossintéticos, como cianobactérias e microalgas, que desempenham um papel crítico na ciclagem de nutrientes e na produção primária em ecossistemas marinhos, de água doce e outros ecossistemas aquáticos 7,8,9,10,11 . O fluxo de trabalho se concentra em isolar hospedeiros das zonas eufóticas de ambientes marinhos e de água doce e seus vírus e bacteriófagos, que são os principais impulsionadores desses ecossistemas12. Tanto os vírus quanto os bacteriófagos afetam as estruturas populacionais eucarióticas e procarióticas e influenciam fortemente a diversidade e a produtividade do ecossistema13. Assim, o objetivo aqui é fornecer um protocolo de amostragem e fluxo de trabalho pós-amostragem que facilite o enriquecimento de hosts e vírus para investigar: dinâmica de vírus único/host único, multivírus/host único, vírus único/multihost e multivírus/host múltiplo; -substratos ómicos subjacentes à dinâmica de infeção vírus-hospedeiro; e potenciais trajetórias coevolutivas e desfechos evolutivos que afetam o sistema vírus-hospedeiro em estudo e o ecossistema maior do qual os vírus e o hospedeiro foram extraídos.

Especificamente, descrevemos um fluxo de trabalho para amostragem ambiental, pré-processamento de amostras em campo (ou seja, antes de chegar ao laboratório), pós-processamento para isolamento de bacteriófagos (e vírus), enriquecimento de culturas de espécies mistas de microrganismos para identificar hospedeiros permissivos, desenvolvimento de isolados de colônia única de hospedeiros putativos, confirmando uma boa-fé relação vírus-hospedeiro (ou seja, infecção produtiva) e caracterizando propriedades fundamentais da infecção (por exemplo, virulência). Os ensaios de infecção não apenas permitem o cálculo da virulência relativa (VR) 14 e resiliência do hospedeiro (RR) 15, mas também incluem etapas para extrair amostras de cultura em pontos-chave para investigar substratos ômicos subjacentes à fisiologia observada (ou seja, a dinâmica de interação vírus-hospedeiro). Por fim, discutimos possíveis armadilhas, solução de problemas e soluções, bem como maneiras de modificar etapas selecionadas para atingir táxons específicos. O fluxo de trabalho é aplicável aos sistemas cianofágio-cianobactérias, ficodnavírus-microalgas e fusellovírus-archaea termofílicos16,17, demonstrando sua utilidade na caracterização de vírus em todos os três domínios da vida: Bactérias, Eukarya e Archaea.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Amostragem ambiental

NOTA: Este protocolo descreve a amostragem offshore de micróbios fotossintéticos da zona eufótica dentro de 5 milhas da costa ao largo da costa do sul da Califórnia. No entanto, o protocolo foi adaptado para amostragem de lagos, lagos congelados ou fontes termais geotérmicas (Figura 1).

  1. Amostragem ambiental offshore ao longo da costa sul da Califórnia
    NOTA: Uma embarcação de console central de 6 m, em V profundo (ou seja, barco) com motores de popa duplos de 150 hp foi carregada com equipamentos de pesquisa (Tabela de Materiais). Três locais foram selecionados para amostragem de zona eufótica: (a) Local 1: N 30° 15.436, W 117° 31.551; (b) Local 2: N 33° 12.521, W 117° 25.275; e (c) Sítio 3: N 32° 59.914, W 117° 17.058. Em cada local, 20 L de amostras de água foram extraídas ao meio-dia de três profundidades diferentes em cada local: < 3 m (amostra de superfície), 6 m e 14 m.
    1. Conjunto da bomba de transferência: Ao chegar a cada local de amostra, implante a âncora do barco e registre as coordenadas GPS do sistema de navegação. Monte o sistema de amostragem.
      1. Em resumo, encaixe uma extremidade do tubo de PVC azul flex-plus de 2.54 cm de diâmetro interno (50 pés) a um filtro de sucção de 2.54 cm para evitar que grandes detritos entrem no sistema de bomba. Prenda a junção do tubo do filtro com fita adesiva. Encaixe a extremidade oposta do tubo no coletor de admissão da bomba de transferência de aço inoxidável de 1 hp.
      2. Conecte uma seção de 10 pés de mangueira flexível de borracha resistente ao colapso de 2.54 cm de diâmetro interno à saída da bomba. Conecte o cabo elétrico da bomba de transferência ao gerador inversor de 3800 W movido a gás. Depois de montada, prepare a bomba de transferência e teste para garantir que o sistema da bomba esteja operacional (Figura 1, linha superior).
    2. Pesagem do tubo de transferência: Prenda uma extremidade de uma corda marinha de náilon de 25 m de comprimento e 1,25 cm de diâmetro ao ilhó de uma âncora de cogumelo de 14 kg. Use fita adesiva para prender a corda ao tubo de PVC azul a cada 3 m com o filtro de sucção ajustado aproximadamente 1 m acima da âncora para evitar que o filtro se aloje na areia ou bata em rochas debaixo d'água. Use a âncora para submergir o tubo de transferência (tubo de PVC azul) e para evitar que fortes correntes subterrâneas criem um grande ângulo entre o barco e o tubo, o que daria profundidades de amostra imprecisas. Abaixe o conjunto âncora/corda e tubo até a profundidade.
    3. Extração de amostras de água do mar: Assim que a ponta do tubo com o filtro estiver na profundidade desejada, ligue o gerador e a bomba. Volte a escorvar a bomba ou agite o tubo de transferência para que a água comece a bombear a partir da profundidade. Uma vez que um fluxo constante de água estava sendo transferido da profundidade, descarregue 1-2 volumes de tubos de volta ao oceano para garantir que a água da profundidade desejada esteja fluindo através da bomba. Colete amostras de água em jarros de água de 20 L (Figura 1, linha superior, extrema direita).
    4. Transporte de amostras para a estação de campo: Encha jarros de água de 20 L até aproximadamente 18 L para permitir a troca gasosa (por exemplo, O2/CO2) entre as amostras de água e o espaço livre durante o transporte. Antes de tampar os jarros de água, registre a temperatura, o pH e a salinidade das amostras de água bruta. Em seguida, tampe e coloque jarros de água em uma cama de gelo no armazenamento do subconvés e cubra com um lençol leve para evitar a exposição excessiva à luz solar e altas temperaturas.
  2. Pré-processamento de amostras de água em campo
    NOTA: Na chegada a uma instalação em terra (por exemplo, quarto de hotel/sala de conferências/estação de campo), uma série de etapas de pré-processamento foram realizadas para proteger o conteúdo microbiano nas amostras de água e separar diferentes frações das amostras de água do mar com base no tamanho das partículas.
    1. Conjunto do sistema de filtragem: Prenda uma extremidade de um pedaço de 1 m de comprimento de tubo de vinil transparente de 9.525 mm de diâmetro interno à entrada da espiga da mangueira na porta de vácuo de uma bomba de vácuo de diafragma de ar portátil. Prenda a extremidade oposta da mesma mangueira a um conjunto de ventosa de filtro de 1.0 L, 0.45 μm. Use conjuntos de copos de filtro de 0,45 μm e 0,22 μm em sequência para separar diferentes frações da amostra de água do mar, conforme descrito abaixo.
    2. Para testar o sistema quanto a vazamentos ou filtros defeituosos/rasgados, filtre 0,25 L de água do mar através do copo do filtro de membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 μm. Um sistema sem vazamento mostrará a sucção entre o filtro e a grade assim que a amostra de água do mar for completamente filtrada.
    3. Filtração através do conjunto do copo do filtro de membrana PES de 0,45 μm: Para isolar microrganismos fotossintéticos (por exemplo, microalgas e cianobactérias), o objetivo é filtrar 2 L de amostra de água do mar através do copo do filtro de membrana PES de 0,45 μm usando dois copos de filtro de 1 L (ou quatro copos de filtro de 500 mL). Rotular adequadamente todos os frascos de filtrado com o tamanho do filtro, a profundidade de onde a amostra foi colhida, a data e o designador do local de amostragem. Por fim, tampas de rosca e frascos de tampa contendo filtrado de 0,45 μm com um pano ou manga semitransparente para evitar luz solar excessiva.
      NOTA: Não permita que o filtro no copo do filtro seque. Mantenha sempre uma fina camada de líquido no filtro. O filtro acumulará detritos biológicos (por exemplo, células). Se o filtro ficar entupido com detritos, desparafuse cuidadosamente o conjunto do copo e reserve o copo do filtro usado, mas não descarte o copo entupido. Conecte um novo filtro de 0.45 μm e continue.
    4. Filtração através do conjunto do copo do filtro de membrana PES de 0,22 μm: Para isolar grandes vírus eucarióticos, use 1 L do filtrado de 0,45 μm da etapa anterior (etapa 1.2.3) e filtre através de um copo de filtro de 0,22 μm. Rotular adequadamente o frasco de ultrafiltrado com o tamanho do filtro, a profundidade de onde a amostra foi colhida, a data e o local de amostragem designado. Finalmente, rosqueie a tampa e cubra o frasco contendo ultrafiltrado de 0,22 μm (da filtragem do filtrado de 0,45 μm).
      NOTA: Não permita que o filtro no copo do filtro seque. Mantenha sempre uma fina camada de líquido no filtro. O filtro acumulará detritos biológicos, que contêm amostras biológicas. Se o filtro ficar entupido, desparafuse o conjunto do copo e reserve o copo do filtro usado. Não descarte o copo entupido. Conecte um novo filtro de 0.22 μm e continue.
    5. Concentrado de biomassa do filtro de 0,45 μm: Despeje 48 mL de filtrado (de filtração de 0,22 μm) em cada um dos dois tubos de centrífuga cônicos de polipropileno estéreis de 50 mL. Use um bisturi estéril para cortar uniformemente ao longo da borda mais externa do filtro de 0,45 μm gasto dentro do conjunto do copo. Use uma pinça estéril para remover o filtro úmido e carregado de biomassa. Corte ao meio. Enrole metade do papel de filtro em um tubo cônico de 50 mL. Repita com a segunda metade da membrana do filtro e o segundo tubo. Aparafuse as tampas dos tubos e prenda com filme transparente. Rotule o tubo.
    6. Concentre a biomassa de vírus grandes do filtro de 0,22 μm: Despeje 14 mL de ultrafiltrado em cada um dos dois tubos de centrífuga cônicos de polipropileno estéreis de 15 mL. Use um bisturi estéril para cortar ao longo da borda externa do filtro de 0.22 μm usado dentro do conjunto do copo. Use uma pinça estéril para remover o filtro úmido e carregado de biomassa. Corte ao meio. Enrole e insira metade do papel de filtro em um dos tubos cônicos de 15 mL. Repita para a segunda metade da membrana do filtro e o segundo tubo cônico de 15 mL. Aparafuse as tampas dos tubos e prenda com filme transparente (por exemplo, Parafilm). Rotule cada tubo com o tamanho do filtro (ou seja, 0.22 μm), local, profundidade e data.
    7. Reter o filtrado de 0,45 μm restante, bem como o filtrado de 0,22 μm restante para envio de volta ao laboratório. Repita todo este processo de filtração (etapas 1.2.2 a 1.2.6) para cada profundidade e local de amostragem.
      NOTA: O ultrafiltrado é usado no laboratório como base de mídia (com minerais nativos e outros nutrientes).
      Microscopia de amostra bruta (opcional): Pegue um tubo cônico de 50 mL com um filtro de 0,45 μm e agite suavemente. Use um conta-gotas de plástico (ou pipetador) para retirar 30-50 mL de água do mar do tubo cônico de 50 mL e prepare uma lâmina de microscópio de vidro com a amostra e uma lamínula. Usando um microscópio de campo e um computador, visualize o conteúdo da lâmina do microscópio para detectar e registrar as características dos microrganismos observados (Figura 2D).

2. Processamento de amostras para concentrar vírus/bacteriófagos e enriquecer hospedeiros

NOTA: Este protocolo descreve as primeiras etapas de processamento necessárias quando as amostras chegam ao laboratório a partir do local de campo. O transporte por avião versus veículo rodoviário pode exigir considerações diferentes. A viabilidade ambiental da amostra diminuirá com mudanças abruptas de temperatura, pH, salinidade, exposição ou falta de exposição à luz, concentração de gás dissolvido (por exemplo, CO2 e O2) e tempo entre a extração ambiental e o processamento em laboratório.

  1. Spin concentrando e armazenando vírus e bacteriófagos
    NOTA: Uma vez que as amostras chegam ao laboratório, o processamento dentro de 8 h após a chegada pode minimizar a perda de micróbios viáveis devido ao lapso de tempo entre a extração do local da amostra e a chegada ao laboratório. As etapas fornecidas abaixo fornecerão alíquotas de suspensão concentrada de bacteriófagos (ou vírus) (ou seja, estoques de trabalho) para armazenamento e uso a longo prazo.
    1. Ultrafiltrado concentrado: Para cada profundidade de amostragem por local, envie os ~800 mL restantes de ultrafiltrado para o laboratório. Use um filtro de rotação centrífuga 3K NMWL 15 mL e centrifugue a 6000 x g por 10-20 min para concentrar 50-100 mL de ultrafiltrado até 1,0-1,5 mL. Prepare grades para imagens TEM conforme descrito anteriormente16 para avaliar se há partículas semelhantes a vírus (VLPs) no ultrafiltrado concentrado resultante. Se forem detectadas VLPs, divida o concentrado em alíquotas de 100 mL. Conservar a 4 °C (ou -20 °C para armazenamento a longo prazo).
    2. Concentração de partículas do filtro de 0,22 μm: Use um bisturi estéril para raspar suavemente os detritos dos filtros de 0,22 μm para o ultrafiltrado dentro dos tubos de 50 mL nos quais os filtros foram transportados. Use um conjunto de copo concentrador de rotação 10K NMWL para concentrar 50-200 mL de suspensão até um volume de ~ 3 mL de retentado de amostra. Prepare grades para imagens TEM conforme descrito anteriormente16 para determinar se há VLPs do filtrado de 0,45 μm que podem ter sido capturadas na superfície do filtro de 0,22 μm. Se forem detectadas VLPs, divida o concentrado em alíquotas de 100 mL e armazene a 4 °C (ou -20 °C para armazenamento de longo prazo).
  2. Retentado concentrador e enriquecedor de spin a partir de filtros de 0,45 μm.
    NOTA: As culturas mistas de microrganismos podem conter hospedeiros para os vírus e bacteriófagos isolados acima (etapas 2.1.1 e 2.1.2). A concentração de spin e o enriquecimento de culturas mistas fornecem estoques de trabalho a partir dos quais se desenvolvem culturas puras de hospedeiros putativos (consulte a etapa 3).
    1. Concentração de suspensões mistas: Para cada profundidade de amostragem por local, envie ~ 100 mL de ultrafiltrado com um filtro de 0,45 μm carregado de detritos celulares para o laboratório. Use um bisturi estéril para raspar os detritos do filtro de 0,45 μm para o ultrafiltrado nos tubos de 50 mL em que foram transportados. Centrifugar a amostra a 2000 x g durante 10 min, 4 °C para peletar a biomassa. Ressuspenda o pellet em 5 mL de meio diluído de BG-11 1:818 por trituração suave com uma pipeta.
    2. Retentado enriquecedor a partir de filtro de 0,45 μm: Prepare seis culturas paralelas em frascos de Erlenmeyer defletores de 250 mL contendo: 50 mL de meio BG-11 (3 frascos) e uma mistura de ultrafiltrado do local da amostra (40 mL) mais BG-11 (10 mL). Inocular cada balão com 0,5 ml de concentrado de células (a partir do passo 2.2.1). Incubar com agitação leve em um fotobiorreator por um mínimo de 7 a 10 dias a 25 ° C com intensidade de luz definida em 20-40 mmol, fótons/m2/s.19 Quando o crescimento for robusto (por exemplo, OD730 nm = 0,8), centrifugue a 2000 x g, 10 min, 4 ° C para pellet. Ressuspenda o pellet em 10 mL de meio diluído de BG-11 1:8 por trituração suave com uma pipeta. Prepare 10-20 alíquotas de 0,5 mL de suspensão celular em criotubos com tampa de rosca para armazenamento a -80 ° C.

3. Desenvolvimento de culturas puras de genótipo único de hospedeiros microbianos

NOTA: Este protocolo descreve procedimentos para isolar e purificar hospedeiros microbianos putativos para vírus e bacteriófagos de culturas mistas processadas a partir de amostras ambientais coletadas. Vários fenótipos de hospedeiros podem ser isolados e purificados, aumentando assim a probabilidade de detecção de hospedeiros permissivos para os vírus e bacteriófagos presentes em amostras de água armazenadas (etapas 2.1.1-2.1.2).

  1. Placas estriadas e seleção de isolados de colônia única
    NOTA: Várias culturas puras de genótipo único são desenvolvidas a partir de culturas mistas para aumentar a probabilidade de isolar um hospedeiro suscetível e permissivo de vírus ou bacteriófagos capturados durante a amostragem ambiental e para investigar a gama de hospedeiros de vírus e bacteriófagos.
    1. Desenvolva isolados de colônia única (SCI) conforme descrito abaixo.
      1. Prepare placas de ágar BG-1120. Descongelar no gelo uma alíquota da suspensão mista que foi armazenada a -80 °C (a partir do passo 2.2.2). Use uma alça estéril para listrar os concentrados de células nas placas de ágar BG-11 usando técnicas padrão20. Incubar placas listradas em um fotobiorreator por ~ 10 dias a 25 ° C com intensidade de luz de 20-40 mmol fóton / m2 / s ou até que as colônias apareçam nas placas.
      2. Prepare ~ 10 culturas de sementes em tubos de cultura de 20 mL com 5 mL de meio BG-11 e / ou 5 mL de uma mistura de ultrafiltrado do local da amostra e BG-11. Escolha um SCI da placa com um palito estéril e inocule cada tubo individualmente, colocando um palito em cada tubo. Incubar com agitação leve em um fotobiorreator por um mínimo de 10-15 dias a 25 ° C com intensidade de luz definida em 20-40 mmol fóton / m2 / s ou até que o crescimento seja detectado (por exemplo, OD730nm = 0,4-0,8).
        NOTA: Se houver vários fenótipos de colônia (por exemplo, morfologia, transparência, cor) na primeira placa de listra, selecione colônias individuais para inoculação de uma variedade de fenótipos de colônia.
    2. Desenvolvimento de culturas puras de estoques de trabalho: Uma vez detectado um crescimento positivo da cultura de sementes, repita os procedimentos de estrias até que apenas um único fenótipo de colônia apareça nas placas (Figura 3B e Figura 4B). Culturas de sementes de escala para culturas de 50 mL em frascos defletores de 250 mL (Figuras 3C e Figura 4C), conforme descrito acima (etapa 2.2.2). Prepare ~ 20 alíquotas de 0,5 mL de suspensão de célula SCI e pipete em criotubos de tampa de rosca de 1,0 mL para armazenamento a -80 ° C.
      NOTA: Para o desenvolvimento de culturas puras de cianobactérias, antibióticos ou antifúngicos podem ser necessários (por exemplo, imipenem, cicloheximida) para reduzir a contaminação da cultura21. O procedimento de plaqueamento é um ponto de articulação onde o isolamento de cianobactérias ou microalgas pode ser direcionado. Os parâmetros de luz durante a incubação podem variar em termos de intensidade de luz ou ciclos liga-desliga.
  2. Caracterização de genótipo único e armazenamento de estoques de giro
    NOTA: Para confirmar o isolamento e enriquecimento de genótipos hospedeiros putativos individuais, as culturas puras são caracterizadas morfologicamente e geneticamente.
    1. Caracterização morfológica: Uma vez que os ciclos de cultura líquida e trabalho em placa de meio sólido resultem em um fenótipo de célula única, caracterize os morfotipos microbianos por microscopia de luz (Figura 2A-C) e, se disponível, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e/ou microscopia eletrônica de varredura (SEM; Figura 3A e Figura 4A). Sob microscopia de luz (por exemplo, ampliação de 60x-100x), pode-se observar organização celular unicelular, colonial, filamentosa, espiral, ramificada ou tricoma verde, marrom clara ou transparente. Isso indicará uma possível atribuição taxonômica.
    2. Caracterização Genética: Validar o isolamento de um único genótipo de microrganismo por extração de DNA das supostas culturas puras, seguida de sequenciamento parcial do genoma. Em cianobactérias, o gene 16S rRNA é frequentemente um alvo (Figura 5A) 22 . Uma análise filogenética 16S pode identificar agrupamento taxonômico22. Em microalgas, o rRNA 18S é frequentemente direcionado23. Para isolados de interesse ou novos isolados, o sequenciamento do genoma completo pode ser buscado.

4. Desenvolvimento de suspensões de vírus/bacteriófagos de genótipo único

NOTA: Este protocolo descreve procedimentos para isolar e purificar suspensões virais e bacteriófagos de genótipo único de múltiplas amostras ambientais.

  1. Diluição e TEM de concentrados de VLP
    NOTA: Usando TEM e ensaios de placa baseados em placas24, a confirmação de que as VLPs são bacteriófagos genuínos (ou vírus) que infectam células hospedeiras é alcançada.
    1. Microscopia eletrônica de transmissão de filtrados (0,45 μm e 0,22 μm): Use concentrados de filtração de 0,45 μm e 0,22 μm de amostras de água bruta (consulte a etapa 2.1) para preparar grades MET16 e imagens para examinar a heterogeneidade das partículas do vírus (ou seja, diversidade de morfotipos). Dilua as amostras que resultam em grades com alta confluência (por exemplo, 90%) antes de concluir as etapas subsequentes para atingir 30% a 50% de confluência. A contagem manual de partículas ou o uso de software de imagem podem ser empregados para estimar a confluência celular em grades.
      NOTA: A alta confluência em grades pode resultar na limpeza de gramados hospedeiros em placas de mídia sólida, em vez do surgimento de placas individuais que podem ser selecionadas. Assim, diluir amostras antes dos ensaios de placa pode economizar tempo. Alternativamente, várias placas de gramado hospedeiro podem ser testadas para interações hospedeiro-vírus usando diluições seriadas de concentrados de VLP.
    2. Detecção de atividade de bacteriófagos (ou vírus) em gramados hospedeiros: Em placas de ágar BG-11, cultive gramados hospedeiros putativos de cianobactérias (ou microalgas) a partir de estoques em funcionamento (etapa 3.1.2). Pipete 0,5 mL de suspensão VLP em 4,5 mL de mídia em gramados (Figura 6A, esquerda) e gire suavemente até que toda a superfície do gramado esteja revestida com suspensão. Incubar em um fotobiorreator por 3-10 dias a 25 ° C com intensidade de luz de 20-40 mmol fótons / m2 / s ou até que as placas sejam visíveis nas placas (Figura 6A, à direita).
  2. Raspagem de placas e desenvolvimento de suspensões de vírus ou bacteriófagos de genótipo único
    NOTA: Ao raspar fenótipos de placa individuais e propagar bacteriófagos em culturas líquidas do hospedeiro, as interações hospedeiro-bacteriófago (ou hospedeiro-vírus) são confirmadas de boa-fé, permitindo que os estoques de trabalho de bacteriófagos (ou vírus) sejam desenvolvidos para ensaios de infecção. Os estoques de trabalho de bacteriófago (ou vírus) devem ser titulados por um dos vários métodos (por exemplo, qPCR, ensaios de placa) para prosseguir com os ensaios de infecção em uma multiplicidade definida de infecção (MOI).
    1. Isolar e propagar um genótipo de bacteriófago (ou vírus): Uma vez que as placas individuais possam ser vistas nas placas (devido à diluição adequada do concentrado de VLP), use uma alça estéril para raspar uma única placa. Gire o loop em uma cultura de sementes de 10 mL do hospedeiro (Figura 6B, à esquerda). Incubar com agitação leve (por exemplo, 70-120 rpm) em um fotobiorreator por 3-10 dias a 25 ° C com intensidade de luz definida em 20-40 mmol fóton / m2 / s ou até que gotas de OD730 nm ou detritos celulares sejam detectados no fundo do tubo, o que indica morte / lise celular ( Figura 6B, direita ) 25 .
      NOTA: Se as placas se formarem nos gramados do hospedeiro, mas não houver sinais de infecção na cultura líquida, as placas podem ter sido formadas por uma bacteriocina26 em vez de um bacteriófago (ou vírus). O TEM pode apoiar ensaios em placas, indicando a morte celular por infecção por bacteriófagos (ou virais).
    2. Quantificação do título para estoques de bacteriófagos (ou vírus): O isolamento de bacteriófagos (ou vírus) é obtido usando os métodos de filtração e concentração por rotação descritos acima. Quantificar os títulos de suspensões de bacteriófagos (ou vírus) por ensaios seriados de placas de diluição27. Alternativamente, execute a extração de DNA e o sequenciamento do genoma do vírus completo e filogenética (Figura 5B) para desenvolver primers para conduzir a titulação de bacteriófagos baseada em qPCR para estabelecer estoques de trabalho para ensaios de infecção subsequentes.
      NOTA: A propagação de genótipos de bacteriófagos (ou vírus) únicos pode ser aumentada para culturas de 50 mL ou 100 mL se os volumes de título ou estoque de trabalho forem muito baixos para as necessidades experimentais. Considere a natureza do sistema vírus-hospedeiro (por exemplo, alta virulência ou baixa virulência), a multiplicidade de infecção (MOI) planejada para ensaios de infecção e quantos ensaios de infecção serão concluídos para um projeto ao desenvolver estoques de trabalho de bacteriófagos (ou vírus). Não é aconselhável descongelar e congelar novamente os estoques de vírus. Descongele e use um estoque completo de vírus de réplicas da mesma preparação com o mesmo título para cada experimento. Outras técnicas de titulação podem complementar os métodos descritos, incluindo ionização por eletrospray/espectrometria de massas (ESI/MS)28.

5. Ensaios de infecção

NOTA: Este protocolo descreve os ensaios de infecção do fago do hospedeiro (ou vírus do hospedeiro) que são usados para: caracterizar qualitativamente a virulência, a gama de hospedeiros e o fenótipo de infecção (um indicador da estratégia de replicação) em meio sólido; e avaliar quantitativamente a cinética de crescimento, a virulência do vírus14 e a resiliência do hospedeiro15 em cultura líquida.

  1. Determinando a virulência relativa do bacteriófago (ou vírus) e a gama de hospedeiros em meio sólido
    NOTA: Todos os ensaios de meios sólidos, incluindo ensaios spot-on-lawn, ensaios de placa de diluição em série de placa única e ensaios de placa de resistência do hospedeiro, fornecem dados qualitativos sobre os parâmetros de infecção bacteriófago-hospedeiro, como virulência do vírus, gama de hospedeiros e estratégia de replicação. Os ensaios de crescimento de cultura líquida permitem medidas mais quantitativas e modelagem da dinâmica vírus-hospedeiro.
    1. Ensaios spot-on-lawn: Para determinar a gama de hospedeiros, prepare gramados de vários hospedeiros putativos isolados de amostras ambientais ou de cepas adquiridas de outros laboratórios ou coleções de culturas. Em gramados, coloque 2 μL de suspensão de bacteriófagos (ou vírus) no gramado com uma pipeta. Em uma região separada da mesma placa, identifique o mesmo volume de Triton X-100 e água nanopura (18MW) como controles positivo e negativo, respectivamente16. Realize vários ensaios pontuais com um determinado bacteriófago (ou vírus) em vários hospedeiros para avaliar a gama de hospedeiros do bacteriófago16. Os fenótipos de placa oferecem informações sobre a estratégia de replicação do bacteriófago (ou vírus). Placas com bordas nítidas e que descem até o ágar indicam replicação lítica, enquanto placas com bordas difusas ou halo podem indicar replicação não lítica16,17.
      NOTA: Alternativamente, os ensaios de placa de diluição em série de placa única indicam se existe uma relação linear entre o tamanho da placa e o título do bacteriófago. Use um marcador na parte de trás do prato para particioná-lo em uma grade ou seções de pizza. Em seguida, usando o mesmo volume (ou seja, 2 mL), mas com diluições de suspensão de bacteriófagos (por exemplo, 1:1, 1:4, 1:16, 1:64), conduza o ensaio spot-on-lawn em uma única placa hospedeira.
    2. Ensaios de resistência do hospedeiro: Para determinar se um conjunto de bacteriófagos pode produzir infecção em um determinado hospedeiro, prepare um gramado hospedeiro em um prato conforme descrito acima. Usando um marcador na parte de trás do prato, divida o prato em uma grade ou seções de pizza. Em seguida, coloque 2 mL de cada suspensão de bacteriófago (ou vírus) em uma seção da grade (ou torta), usando Triton X-100 e água nanopura como controles. Se todas as suspensões de bacteriófagos (ou vírus) forem adicionadas com títulos iguais, avalie qualitativamente a virulência relativa entre as cepas de bacteriófagos (ou vírus) no hospedeiro (ou seja, placa maior = vírus mais virulento).
  2. Quantificando virulência, resiliência e crescimento em ensaios de infecção por cultura líquida
    NOTA: Os resultados qualitativos iniciais fornecem uma base para direcionar pares específicos de bacteriófagos-hospedeiros e realizar análises mais quantitativas da dinâmica das interações vírus-hospedeiro. Na cultura líquida, uma curva de crescimento do hospedeiro infectado é gerada e comparada ao crescimento do hospedeiro não infectado (controle).
    1. Realize o ensaio de infecção de vírus único/hospedeiro único de cultura líquida conforme descrito abaixo.
      1. Estabeleça culturas líquidas paralelas (~ 6-12) de um microrganismo (por exemplo, uma cianobactéria) comprovadamente suscetível e permissiva por ensaios de placa de meio sólido (etapa 5.1) em: 1,0 L (320 mL de cultura), 500 mL (160 mL de cultura) ou 250 mL (80 mL de cultura) - frascos de cultura defletores, conforme descrito anteriormente17. Em um ponto de tempo predefinido (normalmente 0,5 ou 1 tempo de duplicação do hospedeiro), inocule um subconjunto de culturas paralelas com densidade celular equivalente (por exemplo, OD730nm = 0,08) em triplicata com suspensão de bacteriófago usando o volume apropriado necessário para produzir uma multiplicidade pré-selecionada de infecção (MOI) com título de estoque de trabalho disponível.
      2. Deixe outras culturas paralelas (também em triplicata) não inoculadas (ou seja, não infectadas) como controles. Opcionalmente, inocule um terceiro conjunto de culturas paralelas com uma cepa de bacteriófago (ou vírus) diferente para comparações entre pares selecionados de bacteriófago-hospedeiro. Deixar as culturas crescerem num fotobiorreator durante 3-10 dias a 25 °C, com intensidade luminosa fixada em 20-40 mmol de fotões/m2/s.
      3. Gere curvas de crescimento do hospedeiro fazendo leituras de OD730nm em intervalos de tempo regulares (por exemplo, 8 h) de culturas infectadas e não infectadas (controle) por bacteriófagos (Figura 7A). Use a verificação TEM de culturas de controle não infectadas (Figura 7C) e infecção produtiva em culturas de células hospedeiras (Figura 7D). Os efeitos citopáticos 29,30 são facilmente observáveis na maioria das células infectadas, enquanto as células não infectadas não mostram sinais de transformação morfológica ou estresse.
    2. Análise de linha de base para ensaios de infecção de cultura líquida: A partir de ensaios de infecção de cultura líquida de vírus único/hospedeiro único (SVSH), várias métricas de linha de base podem ser derivadas, como: taxa máxima de crescimento específico (μmáx.) 31, virulência relativa de bacteriófagos (ou vírus)14 e resiliência relativa do hospedeiro15 - para uma descrição mais quantitativa da dinâmica bacteriófago-hospedeiro ou vírus-hospedeiro (Figura 7B). As métricas relatáveis padrão incluem taxa de crescimento (geralmente relatada como taxa máxima de crescimento específico, ou μmáximo) e virulência relativa (VR)14 em comparação com um controle de hospedeiro não infectado e/ou um bacteriófago separado no mesmo hospedeiro. Outras métricas, como capacidade de carga do sistema (Assíntota N) e resiliência relativa do hospedeiro (RR)15 também podem ser relatadas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O uso de um gerador elétrico portátil movido a gasolina, uma bomba de transferência de água e tubos resistentes ao colapso serve como uma maneira eficaz de extrair amostras de água do oceano, lagos, lagos congelados e outros ambientes aquáticos (por exemplo, lagoas) em profundidades selecionadas (Figura 1, três linhas superiores). Equipamentos alternativos são necessários para águas ácidas de alta temperatura de fontes termais geotérmicas, piscinas e potes d...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A virosfera é vasta e diversificada, exigindo assim diferentes abordagens experimentais para estudar diferentes sistemas de vírus. Isso inclui diferentes estratégias para isolar vírus e seus hospedeiros de diferentes ambientes e diferentes métodos de processamento para garantir que culturas puras de hospedeiros e seus vírus possam ser produzidas a partir de amostras brutas. Essas culturas puras podem ser usadas em ensaios de infecção por SVSH, tanto em meio sólido quanto em cultura líqui...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado em parte pela US National Science Foundation (NSF) OISE grant no. 1856091 (PI-Ceballos) e NSF DBI grant no. 2119968 (PI-Ceballos). Os autores reconhecem as contribuições do Dr. Chinnapong Wangnai e do Dr. Chakrit Tachaapaikoon, da Universidade de Tecnologia do Rei Mongkut, Thonburi (Tailândia), que forneceram videografia e suporte de campo para amostragem ambiental, respectivamente. Os autores também agradecem ao Dr. Jorge Armando Leiva Sanabria, da Universidade da Costa Rica - Guanacaste, por sua assistência na obtenção de licenças de amostragem de Parques Nacionais na Costa Rica e assistência na coleta de amostras das piscinas geotérmicas. Os autores também agradecem ao Sr. Enrique Marroquin, Jr. (Universidade da Califórnia Merced) e à Sra. Alexia Maceda (Universidade do Maine, Orono, ME, EUA), que ajudaram na amostragem na costa do sul da Califórnia e lagos no norte de Minnesota, respectivamente. Os autores agradecem e reconhecem o suporte técnico da Sra. Socheata Hour, que calculou os parâmetros de infecção para o conjunto de dados φSBL14-SWII.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bomba de transferência de aço inoxidável de 1 hp Utilitech, Charlotte, Carolina do Norte, EUAN/A
Tubos de 1,5 mlwww.eppendorf.com30123611
Concentrador de rotação Centricon Plus 70 10K NMWLwww.sigmaaldrich.comUFC701008
Frascos Erlenmeyer de 250 mL com defletores www.sigmaaldrich.comCLS4450250
Gerador Inversor de 3800-Watts WEN Products, West Dundee, IL, EUAWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
Balões Erlenmeyer de 500 mL com defletores www.sigmaaldrich.comCLS4450500
Jarros de água de 5 galões www.homedepot.comN/A
80 pés de comprimento, 0,5 " diâmetro, nylon https://facomex.mx/producto/combo/N/A
Um console central de 26 pés de profundidade V Sailfish 2660 com dois motores de popa Yamaha de 150 hp https://yamahaoutboards.com/N/A
Acetato de amónio (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Ácido bórico (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Centrífuga 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
Ácido cítrico (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Nitrato de cobalto (II) hexahidratado [Co (NO3) 2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Mangueira flexível de borracha resistente ao colapso swanhose.comCELTF58050
Sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Tubos de centrífuga Corning 50 mL www.sigmaaldrich.comCLS430291
Fosfato dipotássico (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Ácido etilenodiaminotetracético dissódico (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume e Espectrofotômetro e Florômetrowww.denovix.comN/A
Fita adesivawww.homedepot.comN/A
Tubos Eppendorfwww.sigmaaldrich.comEP022364120
Etanolwww.sigmaaldrich.com64175
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
Citrato de amônio férrico (C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Tubo de PVC azul Flex-plus www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - Incubadora Agitadora Empilhávelwww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Microscopia eletrônica Microscope_Transmission eletrônica de bancada (TEM)delongamerica.comN/A
Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Cloreto de manganês (II) tetrahidratado (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Âncora de Cogumelo Revestida em Vinil Preto/30 lbswww.homedepot.comN/A
Placas de Petri em poliestirenowww.sigmaaldrich.comPág. 5481
Copo filtrante de membrana de polietersulfona (PES) com 0,22 mmwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
Copo filtrante de membrana de polietersulfona (PES) com 0,45 mmwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
Xantogenato de etilo de potássio (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Carbonato de sódio (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Dodecil sulfato de sódio [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Molibdato de sódio di-hidratado (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Nitrato de sódio (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Aci tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanossulfónico (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Triton X-100www.sigmaaldrich.comT8787
Cloridrato de Trizma (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Bomba de vácuo/pressão Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, EUAEW-79204-00
Tubulação de vinil www.homedepot.comN/A
Sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

Referências

  1. Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
  2. Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Freshwater Cyanophages. , National University of Singapore. Doctoral dissertation (2022).
  3. Sime-Ngando, T. Environmental bacteriophages: viruses of microbes in aquatic ecosystems. Front Microbiol. 5, 355(2014).
  4. Sigee, D. C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. , John Wiley & Sons. (2005).
  5. Jacquet, S., Miki, T., Noble, R., Peduzzi, P., Wilhelm, S. Viruses in aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects for the future in the field of microbial oceanography and limnology. Adv Oceanography Limnol. 1 (1), 97-141 (2010).
  6. Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl Environ Microbiol. 71 (2), 629-635 (2005).
  7. Bhardwaj, A., et al. Cyanobacteria: a key player in nutrient cycling. Cyanobacteria. , 579-596 (2024).
  8. Douterelo, I., et al. Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems. Water Res. 65, 134-156 (2014).
  9. Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues. Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).
  10. Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).
  11. Atkinson, C. L., Capps, K. A., Rugenski, A. T., Vanni, M. J. Consumer-driven nutrient dynamics in freshwater ecosystems: From individuals to ecosystems. Biol Rev. 92 (4), 2003-2023 (2017).
  12. Mojica, K. D., Brussaard, C. P. Factors affecting virus dynamics and microbial host-virus interactions in marine environments. FEMS Microbiol Ecol. 89 (3), 495-515 (2014).
  13. Graham, E. B., et al. Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes. Front Microbiol. 7, 214(2016).
  14. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough. J General Virol. 102 (1), 001515(2021).
  15. Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections. Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).
  16. Ceballos, R. M., et al. Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments. Front Microbiol. 3, 295(2012).
  17. Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae. Front Microbiol. 11, 1218(2020).
  18. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  19. Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. Light respiration in Chlorella sorokiniana. J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).
  20. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. J Vis Exp. (111), e54001(2016).
  21. Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island. Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).
  22. Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).
  23. Tragin, M., Lopes dos Santos, A., Christen, R., Vaulot, D. Diversity and ecology of green microalgae in marine systems: an overview based on 18S rRNA gene sequences. Perspect. Phycol. 3 (3), 141-154 (2016).
  24. Uchida, H., et al. A coupled assay system for the lysis of cyanobacteria. Japanese J Water Treatment Biol. 34 (1), 67-75 (1998).
  25. Drummond, C. Characterization of Sulfolobus. Spindle-shaped Virus replication. , Portland State University. (2010).
  26. Flores, E., Wolk, C. P. Production, by filamentous, nitrogen-fixing cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains. Arch Microbiol. 145, 215-219 (1986).
  27. Wick, C., McCubbin, P. Characterization of purified MS2 bacteriophage by the physical counting methodology used in the integrated virus detection system (IVDS). Toxicol Methods. 9 (4), 245-252 (1999).
  28. Marei, E. M., Elbaz, R., Hammad, A. Induction of temperate cyanophages using heavy metal-copper. Int J Microbiol Res Rev. 5 (5), 472(2013).
  29. Bratchkova, A., Kroumov, A. D. Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity. Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).
  30. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence. Phage. 1 (1), 27-36 (2020).
  31. Omata, T., Murata, N. Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714. Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).
  32. Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).
  33. Grasso, C. R., et al. A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy. Toxins. 14 (6), 385(2022).
  34. Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance. Cyanobacteria. , 255-282 (2024).
  35. Cai, L., et al. Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene. ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).
  36. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

V rus de Cianobact riasDin mica V rus HospedeiroIsolamento de Bacteri fagosMicroscopia Eletr nica de Transmiss oEnsaio de PlacasDetermina o da Gama de HospedeirosSequenciamento de Alto RendimentoAn lise Filogen tica
Amostragem ambiental de micróbios fotossintéticos e seus vírus: do campo ao laboratório
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.