Artigo de método

Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

DOI:

10.3791/68384

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20 de junho de 2025

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1ICFO-Institut de Ciències Fotòniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Ophthalmology Group, Hospital Universitari Vall d'Hebron, Vall d'Hebron Institut de Recerca (VHIR)

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo combina limpeza óptica e imunomarcação para imagens confocais de volume total de organoides retinianos de montagem total. Ele preserva a estrutura 3D, permitindo a visualização detalhada das principais vias neuronais, melhorando o estudo da maturação da retina, organização espacial e suas potenciais aplicações na modelagem de doenças e medicina personalizada.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os organoides retinianos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos são estruturas 3D intrincadas que imitam a retina humana, oferecendo uma plataforma poderosa para estudar o desenvolvimento da retina, mecanismos de doenças e possíveis estratégias terapêuticas. Além disso, como são derivados de pacientes, estão se tornando cada vez mais populares, pois são uma grande promessa como ferramenta para a medicina personalizada. Ao contrário das culturas de células 2D convencionais, os organoides da retina preservam a arquitetura 3D nativa da retina, permitindo uma representação mais realista e permitindo estudos mais fisiologicamente relevantes. No entanto, sua complexidade estrutural, alta densidade celular e composição diversificada apresentam desafios significativos para a caracterização.

Para enfrentar esses desafios e aprimorar nossa compreensão da maturação dos organoides da retina, preservando o contexto 3D, combinamos métodos de limpeza óptica com imunomarcação para visualizar toda a estrutura dos organoides de montagem inteira com microscopia confocal. Para isso, empregamos um método de clareamento compatível com objetivas de baixa e alta abertura numérica, facilitando a obtenção de imagens de volume total e capturando certas regiões de interesse com resolução celular. Usando essa abordagem, identificamos a morfologia e distribuição em 3D das três principais vias de neurônios responsáveis pela transmissão da informação visual: fotorreceptores de cone e bastonete, células bipolares e ganglionares. Nossas descobertas lançam mais luz sobre as técnicas de visualização para abordar a organização espacial das células da retina dentro do organoide.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoides da retina

Os organoides retinianos são estruturas 3D complexas que imitam a retina humana, oferecendo uma plataforma valiosa para estudar o desenvolvimento da retina, os mecanismos da doença e as possíveis estratégias terapêuticas1. Eles mantêm a arquitetura 3D natural da retina, demonstram fidelidade transcriptômica e competência funcional, reproduzindo fototransdução e conectividade sináptica2. Além disso, eles imitam de perto o desenvolvimento in vivo 3,4, permitindo uma representação mais realista em comparação com as culturas de células planas. Em estudos anteriores, Isla-Magrané et al. estabeleceram um protocolo de duas etapas para obter organoides multioculares derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) para modelar características celulares do olho humano em desenvolvimento 5,6. Devido à escassez de tecido fetal, a pesquisa do desenvolvimento do olho humano tem se restringido a estudos anatômicos.

Os organoides retinianos obtidos com este protocolo exibiram camadas adequadas e continham todos os principais subtipos de células da retina, como fotorreceptores, células bipolares, células ganglionares, células amácrinas e horizontais e macroglia, juntamente com as principais características morfológicas e organização espacial e conexões corretas. Os modelos organoides, embora sejam uma solução potencial, apresentam variabilidade significativa, dificultando a obtenção de resultados consistentes. Portanto, há uma necessidade premente de empregar uma variedade de tecnologias avançadas em modelos humanos mais confiáveis. Até o momento, esses organoides foram estudados apenas por meio de cortes histológicos, pois sua complexa composição celular, densidade e tamanho dificultam a penetração da luz, resultando em baixo desempenho de imagens ópticas em camadas mais profundas, limitando assim a análise abrangente.

Imagens de montagem completa

As técnicas histológicas tradicionais, que envolvem seccionamento e coloração de tecidos fixos, podem fornecer informações detalhadas sobre regiões específicas, mas não conseguem capturar a arquitetura geral e as relações espaciais dentro de todo o organoide. Para superar essa limitação, a imagem de montagem total surge como uma ferramenta valiosa para estudar organoides da retina. A imagem de montagem total permite a visualização de todo o organoide em sua forma 3D intacta, preservando a distribuição espacial dos tipos de células e componentes da matriz extracelular. Essa abordagem é particularmente benéfica para investigar a composição celular dentro e entre organoides, fornecendo uma compreensão mais completa de seus processos de desenvolvimento e organização funcional. No entanto, devido à sua densidade celular e compactação, os organoides retinianos são opacos (Figura 1, não esclarecida). A opacidade inerente das amostras causa espalhamento de luz, o que dificulta a visualização detalhada das estruturas internas usando microscopia. Aqui, as técnicas de limpeza óptica surgem como uma ferramenta poderosa.

Técnicas de limpeza óptica

A limpeza óptica refere-se a tratamentos físico-químicos que tornam transparentes as amostras biológicas espessas, homogeneizando os gradientes do índice de refração (IR) do tecido para corresponder aos do agente de limpeza e removendo substâncias absorventes de luz7. Esses métodos reduzem drasticamente a dispersão da luz e aumentam a transparência. Essa transformação nos permite ver através de todo o organoide da retina, permitindo uma análise abrangente de sua intrincada organização celular e morfologia por meio de técnicas de imagem de montagem total. Na prática, isso é conseguido impregnando a amostra com uma substância de alto RI e removendo lipídios e pigmentos.

Diferentes métodos de limpeza estão disponíveis, diferindo em vários aspectos (por exemplo, grau de transparência, compatibilidade com técnicas microscópicas, espécimes e moléculas fluorescentes, viabilidade, duração), mas nenhum se destaca como o melhor protocolo comum8. Eles são classificados em quatro grupos principais: (1) imersão simples, (2) hidrofóbica à base de solvente orgânico, (3) à base de hiperidratação e (4) à base de transformação de tecido ou incorporação de hidrogel, conforme bem resumido por Avilov et al7. Todos os métodos incluem uma etapa para a correspondência do IR, geralmente mergulhando a amostra em uma solução que corresponda ao IR médio do tecido. Nos métodos hidrofóbicos, os lipídios e a água são removidos mergulhando a amostra em uma concentração crescente de solvente orgânico (como metanol ou propanol).

O protocolo apresentado é um método otimizado que integra limpeza óptica com imunomarcação para facilitar a visualização 3D de organoides retinianos com microscopia confocal, permitindo imagens de volume total e preservando a integridade estrutural. Essa abordagem permite a identificação dos principais tipos de células da retina dentro do organoide, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para investigar a maturação do organoide da retina e a organização espacial em um contexto fisiologicamente relevante.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de anticorpos secundários fluorescentes feitos por medida

NOTA: Esta abordagem serve como uma alternativa ao uso de anticorpos fluorescentes comerciais (consulte a discussão sobre as vantagens da preparação de anticorpos secundários fluorescentes). Além disso, este protocolo pode ser usado para conjugar fluoróforos a anticorpos primários caso a imunofluorescência direta seja realizada e o anticorpo primário fluorescente não esteja disponível comercialmente. Controlar a proporção de fluoróforo-anticorpo ajustando a quantidade de fluoróforo na reação de marcação produz anticorpos conjugados mais brilhantes. No entanto, os anticorpos secundários feitos sob medida são menos estáveis e a concentração do conjugado resultante é 10 vezes menor do que a dos anticorpos fluorescentes comerciais. Esse protocolo é adaptado do trabalho descrito por Bálint et al9.

  1. Dissolver 1 mg do fluoróforo em DMSO anidro e alíquota em tubos para obter 0,02 mg de fluoróforo por tubo final. Remova todo o DMSO usando um concentrador de vácuo de velocidade, funcionando por 1 h e 30 min. Armazenar alíquotas a -20 ºC protegidas da luz. Para Alexa Fluor 405, o H2O ultrapuro é o solvente apropriado para fazer alíquotas.
  2. Para realizar a reação de marcação, dissolva uma alíquota do fluoróforo em 1-10 μL de DMSO (ou H2O ultrapuro para Alexa Fluor 405).
    NOTA: A quantidade exata de DMSO é determinada por meio de testes anteriores de conjugação de controle. Esses testes são realizados quando um novo lote de um fluoróforo deve ser usado (ou quando um lote de fluoróforo anterior se esgota) ou quando um novo fluoróforo é usado pela primeira vez na conjugação. O teste de conjugação de controle envolve a realização de reações de marcação com quantidades variáveis de fluoróforo para determinar a proporção ideal de fluoróforo-anticorpo no conjugado. No nosso caso, a proporção ideal normalmente fica entre 3 μL e 5 μL.
  3. Incube 50 μL de IgG secundário (ou primário), 6 μL de NaHCO3 1 M e 1-5 μL de fluoróforo por 40 min à temperatura ambiente (RT) em uma plataforma de balanço, protegida da luz.
  4. Enquanto a reação está progredindo, prepare as colunas de exclusão do tamanho da purificação removendo suas tampas e deixando o tampão passar. Equilibre a coluna (uma para cada reação de marcação) executando 3 x 2-3 mL de PBS através da coluna. Caso a última etapa de equilíbrio termine antes do término da incubação, coloque as tampas de volta para evitar que sequem e espere até que a reação de rotulagem termine.
    NOTA: As colunas de exclusão do tamanho da purificação funcionam por gravidade. Certifique-se de que a coluna não seque em nenhum momento, ou a reação de purificação não funcionará corretamente.
  5. Quando a reação terminar (etapa 1.3), adicione 140 μL de PBS à reação de marcação para tornar o volume de aproximadamente 200 μL e vorticá-lo. Adicione esta solução ao centro da coluna, permita que a amostra entre na coluna e, após a última gota ter eluido, empurre adicionando 550 μL de PBS. Quando o líquido parar de cair, eluir adicionando 300 μL de PBS e coletar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  6. Calcular a concentração de anticorpos e as proporções de rotulagem medindo a absorvância da amostra a 280 nm e a absorbância dos fluoróforos utilizados. Aplicar a Lei de Beer-Lambert para determinar a concentração (em molaridade) da seguinte forma:
    figure-protocol-1
    Onde A representa a absorbância, ε o coeficiente de extinção molar e CF280 é uma medida da absorbância que o fluoróforo específico tem a 280 nm que serve como fator de correção. Então, a concentração do anticorpo é:
    figure-protocol-2
    E a proporção de rotulagem é:
    figure-protocol-3
  7. Conservar os anticorpos marcados a 4 ºC, protegidos da luz, até 6 meses.

2. Marcação de imunofluorescência

  1. Fixe os organoides com paraformaldeído (PFA) a 4% em RT por 45 min.
    NOTA: OPCIONAL: Incubar os organoides com uma solução de recuperação de antígenos (etapas 2.2 e 2.3) para aumentar a imunorreatividade dos antígenos.
  2. Preparar 40 ml de solução de recuperação de antigénio misturando 0,117 mg de citrato de sódio tribásico di-hidratado em H2O ultrapuro e ajustar para pH 9.
  3. Incubar os organoides com a solução de recuperação de antigénios com agitação ligeira (30 rpm) a 60 °C durante 1 h.
  4. Permeabilize os organoides com PBST (PBS com 1% de Triton X-100) com leve agitação em RT por 4 h.
  5. Bloqueie os organoides com solução de bloqueio (albumina de soro bovino (BSA) a 2% com Triton X-100 a 0,1%) em RT durante a noite (ou mais de 1 dia).
    NOTA: As concentrações de anticorpos primários e secundários dependem do anticorpo específico. Para imunofluorescência de amostras de montagem total, usamos uma concentração mais alta em comparação com amostras seccionadas. Incubamos o anticorpo primário a 10 μg/mL que, na maioria dos casos, corresponde a 1:100 do estoque (Tabela 1). Incubamos nossos anticorpos secundários personalizados a 20-50 μg/mL.
  6. Incubar os organoides com os anticorpos primários diluídos em solução de lavagem (0,1% BSA com 0,1% Triton X-100) a 4 °C durante 2 dias com agitação ligeira.
  7. Lave os organoides por 3 x 15 min em solução de lavagem com agitação suave em RT.
  8. Incubar os organoides com os anticorpos secundários diluídos em solução de lavagem a 4 °C durante 2 dias com agitação ligeira.
  9. Lave os organoides por 3 x 15 min em solução de lavagem com agitação suave em RT.
    NOTA: Após a imunomarcação, os corantes fluorescentes de escolha podem ser incubados. Normalmente usamos marcadores de núcleos fluorescentes, como DAPI (1:1.000) e DRAQ5 (1:500), ou faloidina (1:100) para visualizar a rede de filamentos de actina.
  10. Incubar os organoides com os corantes fluorescentes diluídos em solução de lavagem em RT durante 1 h com agitação suave.
  11. Lave os organoides por 3 x 15 min em solução de lavagem com agitação suave em RT.

3. Limpeza óptica com FluoClear BABB

NOTA: 1-Propanol pode comprometer recipientes de plástico, principalmente para exposição a longo prazo. Para estar seguro, use recipientes de vidro.

  1. Etapa de desidratação
    1. Preparar soluções de 1-propanol em H2O ultrapuro nas percentagens indicadas (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) e depois ajustar para pH 9,5 com trimetilamina.
      CUIDADO: A trietilamina é tóxica se inalada. Trabalhe sob uma coifa. As soluções podem ser reutilizadas se armazenadas adequadamente (recipiente bem fechado). Ajuste o pH antes de usar.
    2. Incubar as amostras com o gradiente crescente de soluções de 1-propanol (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) durante 2 h cada a 30 °C com agitação ligeira.
    3. Incubar as amostras com 100% de 1-propanol durante a noite a 30 °C com agitação suave.
  2. Etapa de limpeza
    CUIDADO: BABB é uma potente mistura de solventes conhecida por sua capacidade de dissolver ou danificar significativamente muitos plásticos. Por segurança, use recipientes de vidro com tampas compatíveis e trabalhe dentro de uma hotte.
    1. Prepare o BABB misturando álcool benzílico (BA) e benzoato de benzila (BB) na proporção de 1:2.
    2. Mergulhe as amostras em BABB em RT durante a noite.
    3. Antes de criar imagens, atualize o BABB.
      NOTA: Para organoides de ~ 1 mm de diâmetro, o BABB induz um efeito de limpeza que é evidente em dezenas de minutos. Dependendo do tamanho e da natureza da amostra, o grau de limpeza pode ser diferente e/ou exigir um tempo de exposição mais longo à solução de limpeza. Recomendamos adquirir imagens antes e depois da imersão em BABB para melhorar o protocolo de limpeza.
    4. Armazene as amostras limpas de BABB com solução de BABB a longo prazo a 4 °C. Proteja da luz para preservar a fluorescência.

4. Aquisição de imagem de montagem total

  1. Usando uma pipeta de vidro, posicione o organoide em uma placa de Petri com fundo de vidro com uma gota de BABB. Certifique-se de que a amostra entre em contato com a superfície da lamínula.
    CUIDADO: Tome cuidado para que a gota de BABB contendo a amostra não entre em contato com as bordas plásticas do prato, ou derreterá o plástico, comprometendo a amostra e a qualidade da imagem.
  2. Usando um microscópio de varredura a laser confocal invertido equipado com objetivas de baixa e alta ampliação, adquira imagens de pilha Z para obter uma visão 3D completa da amostra com detalhes celulares.
    NOTA: Para este estudo, foram utilizadas uma objetiva de ar de abertura numérica (NA) de 10x 0,4 e uma objetiva de 63x NA 1,4, com um tamanho de passo de 3,5 μm e 1 μm, respectivamente.

5. Processamento de imagem

  1. Recalibre o tamanho do passo da aquisição da pilha Z considerando a incompatibilidade do índice de refração (RI) entre a solução de limpeza e o meio de imersão.
    1. Calcule o tamanho do passo recalibrado da seguinte forma:
      figure-protocol-4
      Para uma amostra incorporada em BABB, fotografada com uma objetiva aérea com um tamanho de passo de 3,5 μm, será a seguinte:
      figure-protocol-5
    2. Usando o ImageJ, altere a profundidade do voxel (clique em Imagem | Propriedades...) para o tamanho da etapa recalculado.
  2. Crie projeções de imagem da pilha Z.
    1. Usando o ImageJ, inspecione a pilha Z em profundidade (clique em Imagem | Pilhas | Vistas ortogonais). As vistas XY, XZ e YZ do organoide retiniano aparecerão.
    2. Salve as regiões de interesse desejadas (clique em Arquivo | Salvar como...).
  3. Crie uma animação da renderização 3D da pilha Z usando software de processamento (consulte a Tabela de materiais).
    1. Selecione os canais a serem visualizados ativando suas caixas de seleção.
    2. Ajuste os planos Z para visualizar o interior da amostra (ative Recorte na caixa de seleção).
    3. Grave a animação usando o Editor de filmes (ative o Editor de filmes na caixa de seleção). Arraste e solte, aumente e diminua o zoom diretamente usando o mouse. Clique em Adicionar para incluir um clipe diferente para a animação. Se estiver ajustando os planos Z, ative a opção Planos de recorte (clique em Configurações... | marque a caixa Recortar planos ).

Resultados

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figure-results-1
Figura 1: Comparação de três métodos de limpeza. Esquerda: Imagens de campo claro de (A) amostras não limpas e (BD) limpas. Direita: pilha Z com vistas ortogonais xz e yz de 90 organoides retinianos DIV corados com o marcador nuclear DRAQ5 (amarelo) adquirido com um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma objetiva de ar de 10x (RI = 1,00). (A) Organoide retiniano não limpo (N = 3). Os organoides retinianos fixados por PFA não são transparentes o suficiente para visualização 3D. (B) Organoide depurado com frutose/glicerol (N = 3). (C) Organoide limpo por ECi (N = 3). (D) Organoide aprovado por FluoClear BABB (N = 3). Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: BF = campo claro; CLSM = microscópio confocal de varredura a laser; IR = índice de refração; PFA = paraformaldeído; ECi = cinamato de etilo; BABB = álcool benzílico/benzoato de benzilo; DIV = dias in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Comparação de métodos de limpeza óptica para estudos de imunofluorescência em organoides neurorretinianos

Aqui, apresentamos os resultados de três métodos de limpeza para demonstrar a eficácia do FluoClear BABB para tornar transparentes os organoides da retina. Na Figura 1, observamos organoides retinianos limpos com frutose/glicerol (Figura 1B), ECi (Figura 1C) e FluoClear BABB (Figura 1D). Os métodos de clareamento testados foram escolhidos porque todos foram comprovados10,11 como compatíveis com a coloração por imunofluorescência e preservam a fluorescência de proteínas endógenas (por exemplo, GFP presente em GCaMPs).

A frutose/glicerol12 é um protocolo de limpeza por imersão simples e não tóxico que não requer desidratação, reduzindo significativamente o tempo de processamento em comparação com outros métodos. Foi relatado que é eficiente para a transparência de organoides derivados de vários tecidos: câncer de vias aéreas, rim, fígado e mama humana12.

ECi (Ethyl Cinnamate)11 é um sabor alimentar aprovado pela FDA e aditivo para cosméticos13,14, é considerado inofensivo e provou ser um excelente reagente de limpeza para tecidos de mamíferos. É conhecido por sua capacidade de limpeza rápida e distorção mínima do tecido. É classificado como um método de limpeza hidrofóbico, mas em comparação com os solventes à base de BABB, não é tóxico e preserva a fluorescência das proteínas fluorescentes por mais tempo (por até 14 dias). Como é comum na maioria dos protocolos de limpeza, o ECi requer uma etapa prévia de desidratação. Para obter os melhores resultados, esta etapa é alcançada mergulhando a amostra em soluções com concentrações de álcool progressivamente crescentes. Como o ECi não é prejudicial, uma vez que a amostra é limpa, ela pode ser manipulada com segurança e armazenada em recipientes de plástico. No entanto, as etapas de desidratação são realizadas com 1-propanol, um solvente orgânico que deve ser manipulado sob uma capela e armazenado em recipientes de vidro.

O FluoClear BABB10 é uma forma variante de um protocolo hidrofóbico baseado em álcool benzílico/benzoato de benzila (BABB) como solução de correspondência de índice de refração. É conhecido por ser muito tóxico e corrosivo, por isso precisa ser manuseado com cuidado. O FluoClear BABB foi descrito como uma versão melhorada que preserva GFP e RFP melhor do que as versões anteriores e permite o uso de 1-propanol ou terc-butanol como agentes de desidratação.

Para avaliar o desempenho dos três métodos de clareamento, fotografamos os planos Z com um microscópio confocal equipado com uma objetiva aérea NA0,4 de 10x, fornecendo um grande campo de visão (FoV) de 2,5 x 2,5 x 2,56 mm para capturar todo o volume do organoide retiniano. Utilizamos organoides retinianos em estágio intermediário de maturação (90 dias in vitro (DIV)) que contêm todos os neurônios retinianos (células ganglionares, células bipolares e fotorreceptores), atingindo a densidade e compactação celular e, portanto, sendo opacos. Conforme explicado na introdução, a limpeza óptica é alcançada quando o RI é combinado em todo o objeto a ser fotografado. Assim, os meios de imersão utilizados para a geração de imagens terão um impacto drástico na transparência alcançada. A Tabela 2 detalha o IR do meio de imersão e as soluções de limpeza testadas.

SoluçãoÍndice de refração
Meios de imersãoAr1
Água1.33
Glicerol1.45
Óleo1.51
Soluções de compensaçãoFrutose/Glicerol1.468
Eci1.558
FluoClear BABB1.56

Tabela 2: Índice de refração (IR) dos meios de imersão mais utilizados para microscopia de luz e as metodologias de clareamento óptico testadas para clareamento de organoides retinianos. Abreviatura: RI = índice de refração.

Comparando as imagens confocais resultantes (Figura 1, painel direito), o tratamento com frutose/glicerol resultou na menor melhora na transparência, limitando a visualização das camadas retinianas e impedindo a visualização do núcleo organoide. A ECi obteve melhor transparência, permitindo a visualização das camadas da retina, mas ainda limitada a visualização do núcleo organoide da retina devido ao espalhamento de luz que dificultou a detecção de fluorescência das partes internas da amostra. O FluoClear BABB proporcionou a maior melhoria na transparência, permitindo a visualização clara do núcleo e do córtex do organoide retiniano em resolução mais alta com intensidade de fluorescência semelhante.

Vale ressaltar que os protocolos ECi e FluoClear BABB induziram um encolhimento notável da amostra, conforme ilustrado pelas imagens de campo claro correspondentes de cada organoide retiniano limpo (Figura 1, painel esquerdo). O encolhimento da amostra é devido às etapas anteriores de desidratação que removem a água, e é por isso que o protocolo Frutose/Glicerol não encolhe a amostra. Esse encolhimento, no entanto, apresenta uma oportunidade única para uma exploração mais profunda. Embora comprima o tamanho geral do organoide e potencialmente subestime as distâncias internas, também aumenta a compacidade. Essa compactação isotrópica, relativamente uniforme em todas as direções, nos permite alavancar objetivas de alta ampliação com poder de resolução superior (devido ao seu NA maior) que, de outra forma, só obteriam imagens da camada celular mais externa devido às suas distâncias de trabalho (WD) mais curtas. Por exemplo, uma objetiva de ar 10x NA 0,4 oferece um WD de 2,53 mm, enquanto uma objetiva de óleo 63x NA 1,4 com resolução significativamente melhor tem um WD de apenas 0,14 mm. Ao utilizar organoides mais compactos e limpos com BABB, podemos efetivamente superar essa limitação e obter imagens de alta resolução de estruturas mais profundas, como a camada de células ganglionares localizada no interior do organoide (Figura 2).

figure-results-2
Figura 2: Reconstruções 3D de um organoide retiniano (200 DIV) limpo com FluoClear BABB fotografado com um microscópio confocal de varredura a laser. O microscópio foi equipado com uma objetiva de ar (A) 10x NA 0,4 e (B) uma objetiva de óleo 63x NA 1,5. A limpeza e a imagem permitem a visualização de todo o organoide e, ao mesmo tempo, a imagem com detalhes finos de algumas regiões de interesse. DRAQ5 (núcleos), opsina B+GR (cones) e TUJ1 (neurônios). Abreviaturas: DIV = dias in vitro; BABB = álcool benzílico/benzoato de benzilo; NA = abertura numérica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em conclusão, nossa escolha para limpeza foi o FluoClear BABB, pois oferecia visualização superior de todo o organoide da retina com alta resolução e relação sinal-ruído. É importante ressaltar que o encolhimento induzido por BABB, compactando o organoide isotropicamente. Essa compactação nos permitiu alavancar objetivas de alta ampliação para exploração detalhada de estruturas mais profundas. Finalmente, a compatibilidade do BABB com objetivas de imersão em óleo garantiu dispersão mínima de luz e imagens de alta qualidade em ampliações.

Identificação e distribuição espaço-temporal das células da retina dentro dos organoides ao longo da maturação

Seguindo a metodologia aqui detalhada, e empregando imagens de montagem total em organoides imunomarcados com os anticorpos específicos detalhados na Tabela 1, estudamos como a neurorretina é moldada a partir de organoides em diferentes pontos de maturação, desde os estágios iniciais de desenvolvimento (40 DIV) até os estágios mais maduros (até 250 DIV), exibindo uma estrutura 3D bem definida. Essa abordagem nos permitiu visualizar a formação e organização de vários componentes da retina descritos nesta seção.

AnticorpoEspecificidadeAlvosLocalização em Retina[ ]final (diluição)Anfitrião#RRDI
Anti-GFPGFPGFPCélulas positivas para GCaMP6s10 μg/mL (1:1.000)ChAB_300798
Chx10Homeobox 2 do hipotálamo ventromedial, (Vsx2)Fator de transcriçãoNeuroblastos e células bipolares10 μg/mL (1:2)MsAB_10842442
Opsina BOpsina azulSegmento externo de cones azuisCones azuis10 μg/mL (1:100)RbAB_177457
Opsina RGOpsina verde e vermelhoSegmento externo de cones verdes e vermelhosCones verdes e vermelhos10 μg/mL (1:100)ChAB_11213279
RECOVRecuperandoProteína de ligação ao cálcioFotorreceptores10 μg/mL (1:100)RbAB_2253622
RHO (RET-P1)RhodopsinSegmento externo das hastesHastes63 μg/mL (1:100)MsAB_260838
TUJ1Beta-tubulina classe III específica para neurôniosIsoforma de tubulina beta-IIINeurônios50 μg/mL (1:200)MsAB_2315514

Tabela 1: Anticorpos primários testados em organoides retinianos de diferentes estágios de maturação. Abreviaturas: Frango = Ch; Mouse = Ms; Coelho = Rb.

A imunomarcação com diferentes marcadores permitiu a identificação das células conformadas a essa estrutura estratificada. TUJ1 é uma beta-tubulina de classe III específica para neurônios (Tabela 1), normalmente usada em amostras seccionadas para marcar células ganglionares da retina (RGCs)15 devido à sua abundância. TUJ1 está presente em todos os neurônios da retina16 e desde os estágios iniciais da diferenciação neural17. A expressão de TUJ1 foi encontrada em todos os estágios de maturação no córtex do organoide, permitindo o acompanhamento da organização das células da retina em camadas. Na Figura 3, podemos observar que nos estágios iniciais de desenvolvimento (40 DIV), o TUJ1 é uniformemente distribuído em uma camada única, fina e uniforme. A partir de 90 DIV, a região apical do organoide torna-se mais densa e compacta, pois é povoada por muito mais células que se acumulam na região apical. A 170 DIV, o organoide da retina adquiriu uma estrutura retiniana estratificada em 3D com uma camada apical discreta. A 200 DIV, podemos ver que existem outros corpos celulares que se estendem por longas projeções, que são muito menos numerosas, encontradas mais profundamente dentro do organoide. Finalmente, a 250 DIV, a estrutura em três camadas nucleares é evidente, correspondendo a: (1) a camada nuclear externa (ONL) conformada por fotorreceptores maduros, (2) a camada nuclear interna (INL) povoada principalmente por células bipolares e (3) a camada de células ganglionares (GCL) formada por RGCs, conforme indicado na Figura 3 (canto inferior direito).

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Figura 3: Organização dos neurônios após a maturação dos organoides retinianos em uma estrutura estratificada por camadas. Projeções Z-stack de imagens confocais de organoides retinianos limpos com FluoClear BABB corados com TUJ1. A 40 DIV, não há estruturas em camadas formadas. A partir de 170 DIV, a neurorretina se estratifica em camadas. As camadas nucleares da retina são indicadas: ONL, INL e GCL (pontas de setas amarelas). Barras de escala = 25 μm (esquerda) e 10 μm (direita). Abreviaturas: BABB = álcool benzílico/benzoato de benzila; DIV = dias in vitro; ONL = camada nuclear externa, INL = camada nuclear interna; GCL = camada de células ganglionares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Com essa metodologia, também poderíamos relatar a montagem de feixes de axônios. Como visto nas regiões ampliadas (Figura 4), observamos feixes de fibras que se estendem do núcleo interno do organoide em direção à periferia, projetando-se em direção a regiões distantes (até 1 mm). Curiosamente, a formação dessas fibras ocorreu em diferentes estágios de maturação. À medida que o organoide cresce, as fibras engrossam, ficam mais complexas e coletam mais projeções celulares (Figura 4 [250 DIV] e Vídeo Suplementar S1). Os RGCs são as primeiras células a se diferenciar durante o desenvolvimento da retina e, portanto, podem organizar suas projeções desde os estágios iniciais de desenvolvimento. Os RGCs podem iniciar a extensão dos neuritos antes mesmo de estabelecer sua posição final dentro do organoide. Nossos achados se alinham com relatos anteriores18 que demonstram a formação de uma estrutura semelhante ao nervo óptico em co-culturas de organoides retinianos e cerebrais.

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Figura 4: Montagem de projeções neuronais em vários estágios de maturação. As fibras se estendem dos planos internos do organoide da retina em direção à periferia. A formação dessas fibras ocorreu em diferentes estágios de maturação, de 40 DIV até o ponto de maturação mais antigo estudado (250 DIV). Barras de escala = 25 μm (linha superior) e 100 μm (linha inferior). Abreviaturas: DIV = dias in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No local apical dos organoides da retina, alguns fotorreceptores amadurecem em bastonetes, que contêm rodopsina nos segmentos externos para detectar visão monocromática em condições de pouca luz, enquanto outros amadurecem em cones, que expressam opsinas azuis, verdes e vermelhas e são responsáveis pela visão colorida e de alta acuidade em condições de luz intensa. A Figura 5 (topo) ilustra a população de fotorreceptores de cone dentro do organoide retiniano que expressavam opsinas azuis e/ou verdes/vermelhas (OPSINA B e GR, Tabela 1). Essas células exibem uma morfologia alongada com as diferentes opsinas distribuídas por todo o corpo celular, excluindo o núcleo. Notavelmente, a ponta externa dessas células parece mais brilhante, potencialmente se assemelhando ao segmento externo do fotorreceptor que contém os discos. Para visualizar os cones azuis e verdes/vermelhos usando um único canal para detecção de fluorescência, anticorpos secundários contra opsina azul (OPSINA B, coelho) e opsina verde/vermelha (OPSINA GR, frango) foram marcados com o mesmo fluoróforo, otimizando o uso do canal e simplificando o processo de imagem, evitando sobreposição espectral. Um subconjunto de células fotorreceptoras na Figura 5 (abaixo) expressou rodopsina (RHO, Tabela 1 e Vídeo Suplementar S2), indicando inequivocamente sua identidade como bastonetes. Esses bastonetes compartilham a morfologia alongada descrita anteriormente, com o núcleo posicionado centralmente e o corpo celular rico em opsina orientado para a periferia do organoide.

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Figura 5: Organoides retinianos de estágios posteriores de desenvolvimento. Superior: cones maduros, inferior: hastes. Projeção Z de imagens confocais de organoides retinianos limpos com FluoClear BABB corados com TUJ1 (neurônios), DRAQ5 (núcleos), opsina-B + GR (cones) e RHO (bastonetes). Desenhos esquemáticos são mostrados para referência. Barras de escala = 100 μm (esquerda) e 10 μm (direita). Abreviaturas: DIV = dias in vitro; BABB = álcool benzílico/benzoato de benzilo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As células bipolares e sua distribuição espaço-temporal foram identificadas rastreando a expressão de Chx10 (também conhecida como Vsx2) ao longo de 250 DIV de maturação (Figura 6). Chx10 (Tabela 1) é um fator de transcrição crítico para a proliferação de células progenitoras e determinação de células bipolares na retina em desenvolvimento19,20. Como um gene homeobox, é expresso nos estágios iniciais de desenvolvimento em neuroblastos e, na retina madura, é encontrado exclusivamente em células bipolares. A Figura 6 demonstra a distribuição de células positivas para Chx10 dentro do organoide em desenvolvimento. Inicialmente, numerosas células positivas para Chx10 são observadas estendendo-se da periferia neurorretiniana em direção ao centro. À medida que o organoide amadurece, essas células se tornam menos abundantes e se mudam para o INL, onde residem as células bipolares.

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Figura 6: Expressão de Chx10 acima de 250 DIV de maturação. Imagens confocais de projeção Z de um organoide retiniano limpo com FluoClear BABB corado com DRAQ5 (núcleos) e Chx10 (neuroblastos e células bipolares maduras). Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: DIV = dias in vitro; BABB = álcool benzílico/benzoato de benzilo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalmente, demonstramos que a GFP endógena dos marcadores de cálcio GCaMP é preservada após a limpeza com esta metodologia. Na Figura 7, podemos observar a neurorretina de 70 organoides retinianos DIV infectados com Ad5-CMV-GCaMP6s e imunomarcados com anti-GFP (Tabela 1) para aumentar a fluorescência após fixação de longo prazo.

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Figura 7: GCaMP endógeno preservado no método de limpeza FluoClear BABB. Um organoide retiniano de 70 DIV infectado com Ad5-CMV-GCaMP6s imunomarcado com anti-GFP (células que expressam GCaMP), Chx10 (neuroblastos e células bipolares em estágio inicial) e DRAQ5 (núcleos). Barras de escala = 100 μm (esquerda) e 25 μm (direita). Abreviaturas: BABB = álcool benzílico/benzoato de benzila; DIV = dias in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar S1: Reconstrução 3D de um organoide retiniano apresentando um conjunto de projeções neuronais. Projeção Z de imagens confocais de organoides retinianos limpos com FluoClear BABB a 250 DIV corados com TUJ1 (neurônios) representados em roxo e DRAQ5 (núcleos) em amarelo. Abreviaturas: BABB = álcool benzílico/benzoato de benzila; DIV = dias in vitro. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar S2: Reconstrução 3D dos bastonetes alinhados na superfície de um organoide retiniano em estágios finais de desenvolvimento (200 DIV). Projeção Z de imagens confocais de organoides retinianos limpos com FluoClear BABB a 200 DIV corados com RECOV (fotorreceptores) representados em verde e RHO (bastonetes) em roxo. Abreviaturas: DIV = dias in vitro; BABB = álcool benzílico/benzoato de benzilo. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

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O protocolo aqui descrito facilita o estudo da distribuição espaço-temporal das células formadoras do organoide retiniano em diferentes estágios de maturação, preservando sua arquitetura 3D natural, aspecto crítico para a compreensão desses modelos no contexto da futura medicina personalizada. Ele fornece uma visão detalhada da arquitetura da retina no nível de camadas distintas e tipos de células individuais, permitindo a visualização de estruturas subcelulares, preservando o contexto 3D global.

A alternativa à imagem de montagem total é o pós-processamento da amostra para a realização de imagens em seções convencionais (parafinadas ou criopreservadas). Embora o seccionamento forneça informações valiosas sobre a localização de proteínas e estruturas, esses dados são restritos a um único plano, limitando a compreensão das conexões celulares espaciais. Como resultado, características como a proporção de cones e bastonetes ou a formação de feixes axonais em regiões específicas podem não ser representadas com precisão, complicando a interpretação em três dimensões. Os organoides da retina são altamente heterogêneos, com diferentes regiões potencialmente contendo diferentes tipos de células e/ou exibindo vários graus de complexidade e diferenciação. A imagem de montagem completa resolve esse problema, pois permite analisar gradientes de heterogeneidade globalmente sem depender da seleção de um subconjunto de seções que podem não representar a totalidade da amostra.

A microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM)21,22,23 pode ser usada como uma alternativa à microscopia confocal de varredura a laser. No LSFM, a amostra é iluminada com uma fina folha de luz de alguns mícrons de espessura, e toda a fluorescência gerada a partir da seção óptica iluminada é detectada usando uma câmera. LSFM é uma técnica de detecção baseada em campo amplo que representa uma estratégia altamente eficiente para visualização rápida de grandes volumes (amostras em escala de centímetros) com efeitos mínimos de fotobranqueamento e fototoxicidade. No entanto, os organoides podem exibir aberração esférica significativa porque a luz que passa pelas superfícies curvas é refratada de forma diferente dependendo do ângulo de incidência. Nesses experimentos, essa distorção produziu uma perda de foco, levando ao desfoque e comprometendo a resolução de estruturas mais profundas. Para imagens de nossos organoides retinianos (aproximadamente 1 mm de diâmetro), a microscopia confocal de varredura a laser provou ser a abordagem mais eficaz.

Este protocolo é adaptado às nossas necessidades experimentais. Ele pode ser usado como um guia inicial para pesquisadores que se aventuram em imagens de montagem total de organoides retinianos opticamente limpos e deve ser adaptado se eles forem diferentes. Nesta seção, as etapas críticas, modificações e limitações da metodologia são descritas em detalhes.

Um passo crítico é a decisão sobre o protocolo de compensação. Muitos critérios precisam ser considerados. Primeiro, considere a tipologia da amostra. Limpar ossos não é o mesmo que limpar o tecido cerebral, assim como limpar organoides da retina difere de limpar organoides gástricos, pois cada um requer uma abordagem distinta. Para visualizar organoides limpos de um tipo diferente, é essencial revisar a literatura para identificar protocolos que foram otimizados especificamente para a amostra de interesse. A frutose/glicerol é um método de limpeza rápido e não tóxico que provou ser útil para limpar organoides derivados de diferentes tecidos (organoides de vias aéreas humanas, cólon, rim, fígado e tumor de mama e organoides de glândulas mamárias de camundongos)12 , mas não era adequado para tornar os organoides da retina humana transparentes. Até onde sabemos, nenhum estudo relata a aplicação de frutose/glicerol no tecido/organoide neural. Portanto, concluímos que este método de clareamento não é apropriado para clarear tecidos neurais. Mais investigações são necessárias para elucidar as razões subjacentes a essa incompatibilidade.

Outro fator crítico a ser considerado é o FoV necessário, pois afeta diretamente a estratégia de imagem e a escolha dos componentes ópticos. Grandes FoVs são normalmente alcançados com objetivas de baixa ampliação, que geralmente são projetadas para uso sem meios de imersão (por exemplo, ar, RI = 1,00). Essas objetivas experimentam uma incompatibilidade de RI maior ao criar imagens de amostras limpas por BABB (RI = 1,56), levando a mudanças no foco de profundidade que devem ser corrigidas durante o pós-processamento. Em contraste, as objetivas de imersão em óleo (RI = 1,51) apresentam menos incompatibilidade de RI com soluções de limpeza como BABB (RI = 1,56) e, portanto, não requerem recalibração.

Métodos simples de imersão geralmente não atingem alta transparência e não são adequados para adquirir imagens de alta qualidade de amostras de montagem inteira. Os protocolos de limpeza de tecidos influenciam a resolução efetiva por meio de inchaço ou encolhimento das amostras. Dependendo do objetivo do experimento, o inchaço ou o encolhimento podem ser benéficos. Protocolos que expandem a amostra podem melhorar a resolução de detalhes finos no mesmo sistema óptico incapaz de mostrar os mesmos detalhes antes. O encolhimento pode ser desejado para visualizar amostras grandes que, de outra forma, não caberiam na câmara de amostra ou se ajustariam às distâncias de trabalho objetivas. No entanto, como o encolhimento comprime a amostra e pode distorcer as distâncias internas, essa técnica não é adequada para avaliação dimensional ou medição precisa de distâncias intercelulares.

Outro fator importante a ser considerado é a compatibilidade com proteínas fluorescentes. A maioria dos protocolos baseados em solventes orgânicos extingue as proteínas fluorescentes, pois requerem altas temperaturas ou degradam as proteínas fluorescentes enquanto são incorporadas com soluções correspondentes a RI. Felizmente, a maioria dos métodos é compatível com técnicas de imunomarcação. No entanto, a compatibilidade de cada epítopo deve ser confirmada experimentalmente.

Além disso, a penetração de grandes moléculas de IgG através do tecido pode ser obstruída, diminuindo a eficiência da coloração e limitando a visualização da estrutura alvo na superfície da amostra. A coloração de amostras inteiras com anticorpos pode levar vários dias (ou até semanas), dependendo do tamanho e da natureza da amostra, aumentando substancialmente a duração do protocolo.

Por fim, a compatibilidade com o instrumento óptico é obrigatória. A maioria dos métodos à base de solvente orgânico (exceto ECi) são muito corrosivos e não quimicamente compatíveis com câmaras de amostra comerciais e objetivas de imersão. Além disso, algumas soluções de limpeza têm um RI que não corresponde ao alcance exigido pelos objetivos disponíveis (geralmente água).

Existem algumas etapas no protocolo que precisam de atenção especial. O FluoClear BABB, como método de limpeza hidrofóbico, requer uma etapa prévia de desidratação. O pH desempenha um papel importante na preservação da fluorescência de proteínas endógenas, como a GFP. Então, é crucial garantir que as soluções alcoólicas tenham o pH devidamente ajustado. A desidratação é a chave para a limpeza completa. Os melhores resultados são alcançados incubando as amostras com um gradiente crescente de soluções alcoólicas.

O tamanho da amostra desempenha um papel importante ao permitir que os anticorpos atinjam seus alvos específicos. Os anticorpos podem não penetrar de forma homogênea e ficar retidos na parte externa de sua amostra. Se isso ocorrer, considere mudar para outro tipo de detergente (Tween-20 ou Saponina), aumentando a concentração e o tempo de incubação do detergente e dos anticorpos. Se esses ajustes forem insuficientes, estratégias alternativas podem melhorar a permeabilização de anticorpos. Para imunomarcação de montagem total de grandes amostras (escala centimétrica), os pesquisadores descobriram que o SDS pode facilitar a penetração mais profunda de anticorpos24. O SDS induz uma perda parcial da estrutura terciária dos anticorpos, linearizando efetivamente a proteína e permitindo que ela penetre mais profundamente no tecido. Em seguida, a lavagem do SDS restaura as propriedades de ligação ao antígeno dos anticorpos, permitindo uma coloração mais uniforme dos tecidos mais espessos e reduzindo o gradiente comumente observado de marcação mais forte na superfície da amostra.

A preparação de seus próprios anticorpos secundários fluorescentes oferece várias vantagens, pois proporciona maior flexibilidade no design da imunomarcação, permitindo a seleção da combinação específica de fluoróforo-anticorpo secundário, aumentando o número de cores que podem ser usadas na mesma amostra. Além disso, a proporção de fluoróforo para anticorpo pode ser ajustada, de modo que geralmente são mais brilhantes. No entanto, alguns aspectos devem ser considerados. Os anticorpos secundários feitos sob medida são geralmente menos estáveis do que os disponíveis comercialmente e devem ser usados frescos. A maioria mantém sua afinidade com o ligante por 3-6 meses a 4 ° C, mas a estabilidade precisa ser determinada experimentalmente, pois algumas combinações podem se degradar mais rapidamente. Além disso, alguns pares anticorpo-fluoróforo podem alterar a afinidade do anticorpo por seu epítopo, resultando em marcação inespecífica parcial ou completa. Para garantir a confiabilidade, é aconselhável primeiro testar anticorpos secundários personalizados usando controles, como células em cultura, antes de aplicá-los a amostras experimentais.

Este protocolo otimizado integra limpeza óptica com imunomarcação para facilitar a imagem confocal de organoides retinianos de montagem inteira. Ele preserva a integridade estrutural e permite a identificação dos principais tipos de células da retina dentro do organoide. Assim, o protocolo fornece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para investigar a maturação e a organização espacial dos organoides da retina.

Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Angel Sandoval, Eric Calatayud, Gustavo Castro-Olvera, Marta Martin e Alina Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) por seu apoio técnico. As entidades financiadoras que apoiaram este trabalho são a Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministério de Economia e Competitividade - Programa Severo Ochoa para Centros de Excelência em P&D (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades - Agencia Estatal de Investigación (PID2021-122807OB-C31 e PID21-122807OB-C32); Instituto de Salud Carlos III (PI22/01747); Fundación La ONCE; Generalitat de Catalunya por meio do programa CERCA; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nº 871124); e Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x NA0.40 objetiva DRYLeicaHC PL APO CS2-
63x objetiva NA1.40 OILLeicaHC PL APO CS2-
anticorpo anti-GFPAbcamAB13970-
Álcool benzílico (BA)Sigma Aldrich13162-
Benzoato de benzilo (BB)Sigma AldrichW213802-
placa de Petri de vidro inferiorMatTekP35G-1.5-14-C-
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma AldrichRolamento A7030-
anticorpo Chx10Sta Cruz BiotechSC-365519-
Colunas de filtragem de gel Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25Sigma Aldrich17-0853-02-
DAPISigma AldrichD9542-
DMSOSigma AldrichD8418-
DRAQ5Thermofisher62251-
Corante (ácido carboxílico, éster succinimidílico)Invitrogen ou Abberior--
ImageJ/Fiji NIH  v1.50i-
Microscópio confocal invertido de varredura a laserMicrossistemas LeicaTCS SP8 STED 3X-FALCON-
Software de processamento 3D LAS XMicrossistemas Leica--
mQ H2O--Água ultrapura do sistema de purificação de água Synergy
NaHCO3Acros Orgânicos424270010-
IgG secundária não marcadaJackson Imunopesquisa--
Anticorpo azul de opsinaMillipore   AB5407 -
Anticorpo Opsin RGMilliporeAB5745 -
Paraformaldeído (PFA) 4%Termocientífico J199943-K2-
Solução PBSGibco18912-014-
Sondas de marcação de faloidinaThermofisher--
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco 10010023-
anticorpo RECOVMilliporeAB5585-I -
RHO (RET-P1) anticorpoSigma AldrichO4886 -
Citrato de sódio tribásico di-hidratado Sigma AldrichC8532-
Tritão X-100Sigma AldrichT8787-
TUJ1 anticorpoCovance MMS-435P -

Referências

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