Method Article

Microscopia eletrônica de transmissão como técnica de visualização para análise da plasticidade sináptica circadiana no córtex de barril de camundongo

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresentado descreve o uso de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para quantificar as mudanças circadianas no córtex do barril de camundongos, focando principalmente no número de sinapses e na morfologia da coluna dendrítica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Examinar a plasticidade sináptica circadiana requer alojar camundongos sob diferentes condições de iluminação (ciclo claro/escuro, LD 12:12, e escuridão constante, DD), fornecendo acesso a rodas de corrida e sacrificando-as em quatro pontos de tempo definidos dentro de 24 horas - no início e meio do dia/dia subjetivo e no início e meio da noite/noite subjetiva. Os cérebros são então devidamente fixados para microscopia eletrônica de transmissão (TEM). O córtex do barril, com sua organização somatotópica precisa, fornece um modelo ideal para tal análise. Para obter a área cerebral necessária, os cérebros são cortados tangencialmente com um vibratoma e, em seguida, as seções contendo o córtex do barril são selecionadas e incorporadas em resina Polybed. A partir dos blocos preparados contendo os barris selecionados, são cortadas seções ultrafinas consecutivas. A densidade sináptica, excitatória e inibitória, é analisada a partir de micrografias eletrônicas usando o método de dissecção estereológica. Além disso, as imagens TEM são usadas para reconstruções 3D de espinhas dendríticas. Mudanças na forma das espinhas dendríticas indicam remodelação dos neurônios durante o dia. O número de sinapses excitatórias atinge o pico durante o sono (dia) em camundongos, enquanto as sinapses inibitórias atingem o pico durante sua fase de atividade (no meio da noite).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os ritmos circadianos são gerados por relógios circadianos em quase todos os processos de um organismo. Em animais e humanos, eles foram detectados nos níveis molecular, celular e de organismo inteiro, bem como em seu comportamento. O sistema circadiano de um organismo consiste no relógio circadiano principal (marcapasso) e relógios periféricos. Todos os relógios circadianos geram oscilações circadianas por meio da expressão cíclica dos genes do relógio, que são controlados por suas proteínas. O mecanismo molecular do relógio gera ritmos circadianos com um período de ~ 1 dia (maior ou menor que 24 h), mas em condições dia/noite, o período de ritmos endógenos é sincronizado com 24 h. Muitos ritmos circadianos foram detectados na fisiologia do sistema nervoso de invertebrados e vertebrados; No entanto, alguns estudos mostraram que eles também estão presentes na plasticidade sináptica e neuronal, ou seja, alterações no número e na estrutura das sinapses e dendritos 1,2,3,4.

O córtex somatossensorial de camundongos fornece um excelente local para estudar a plasticidade sináptica ao longo do dia devido à sua organização bem definida e ligação direta com a atividade locomotora animal 5,6,7,8,9. Na camada IV do córtex somatossensorial, existem estruturas neurais distintas (barris) que são altamente perceptíveis mesmo em um cérebro não corado10,11. Seu arranjo reflete a morfologia e a organização dos bigodes no focinho do animal, permitindo o mapeamento preciso dos estímulos sensoriais. Os barris grandes são organizados em cinco fileiras regulares, cada uma contendo entre quatro e sete barris. As fileiras de barris que correspondem a grandes bigodes são marcadas com letras maiúsculas de A a E e representam os bigodes dispostos da área dos olhos para baixo ao longo do focinho. Cada barril consiste em duas áreas principais: a cavidade, a parte central preenchida com neurópilo e a parede chamada de lado, que é dominada pelos corpos das células estreladas. Os barris são separados uns dos outros por áreas de menor densidade celular, chamadas septos. Cada barril recebe impulsos de um bigode específico localizado no lado contralateral do focinho do animal10,12.

A divisão em barris específicos, dispostos em fileiras regulares, permite a identificação rápida e fácil da área selecionada10,13. A seleção de barris da linha B para análise das mudanças circadianas é baseada em estudos de plasticidade dependente da atividade 14,15,16,17. A linha B é caracterizada por limites somatotópicos bem definidos e contém apenas quatro grandes barris distintos, simplificando sua localização nas amostras. Devido à sua posição central, a atividade neuronal da linha B está correlacionada com comportamentos naturais de camundongos, como exploração ambiental e atividade locomotora. Para a contagem de sinapses em espinhas dendríticas e hastes, é importante selecionar as partes centrais dos barris, onde os corpos celulares são esparsos 12,15,18.

A imuno-histoquímica combinada com a imagem de microscopia confocal é uma técnica que desempenhou um papel crucial no esclarecimento dos principais mecanismos da plasticidade sináptica em camundongos. Embora o uso da microscopia confocal forneça imagens de alta resolução com fluorescência de fundo reduzida e maior clareza da estrutura celular, ela sofre de fotobranqueamento e requer preparação complexa de amostras, o que pode alterar o estado dos tecidos biológicos. Sua dependência de marcadores fluorescentes pode limitar os tipos de proteínas que podem ser estudadas simultaneamente devido à sua sobreposição. A microscopia de imunofluorescência confocal fornece um meio de rotular proteínas específicas, seus níveis de expressão e localização associada à atividade sináptica usando anticorpos para detectar antígenos-alvo em seções de tecido fixas. Embora este método ofereça especificidade e flexibilidade para estudar várias proteínas envolvidas na neurotransmissão, ele é limitado por sua incapacidade de fornecer dados em tempo real sobre processos dinâmicos devido à etapa de fixação envolvida. A inconsistência na ligação do anticorpo também pode resultar em resultados não confiáveis 19,20,21.

O uso de microscopia eletrônica em vez de métodos de imunofluorescência com microscopia de luz permite uma resolução significativamente maior e maior precisão tanto na seleção da localização quanto na distinção das estruturas neurais. As seções de microscopia eletrônica de transmissão serial (TEM) ajudam a visualizar a estrutura sináptica no nível ultraestrutural e têm a vantagem de serem usadas para estudar a formação ou eliminação de sinapses. O MET permite que os pesquisadores analisem as propriedades físicas das sinapses e as mudanças na densidade e estrutura que são chamadas de plasticidade das sinapses. Embora a preparação da amostra e a imagem sejam trabalhosas, o MET fornece uma compreensão mais detalhada das mudanças que acontecem durante o aprendizado, a formação da memória e o processamento de informações sensoriais e durante o dia, o ano e a idade do animal.

Nosso método visa investigar a dinâmica circadiana da densidade e morfologia sináptica usando uma abordagem baseada em um mínimo de quatro pontos de tempo combinada com o método de dissecção estereológica baseado em imagens TEM seriais. O método de dissector estereológico permite uma estimativa confiável do número de sinapses, mesmo quando se usa apenas algumas seções seriais ultrafinas 22,23,24,25,26. A organização somatotópica bem definida do córtex do barril garante a seleção anatômica precisa dos locais de estudo, enquanto o MET serial permite a diferenciação dos tipos de sinapses (excitatórias e inibitórias) e suas localizações (nas espinhas dendríticas e nas hastes). Este método fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores que investigam a neuroplasticidade diurna e circadiana, permitindo a exploração de como fatores ambientais e internos influenciam a dinâmica sináptica. Os componentes individuais do nosso método permitem sua aplicação para análise de alterações de neuroplasticidade em uma gama muito mais ampla de estudos, não necessariamente limitados a mudanças relacionadas ao circadiano.

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Protocol

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Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo comitê de ética institucional apropriado e conduzidos de acordo com a Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho sobre a proteção dos animais utilizados para fins científicos, bem como com os regulamentos nacionais. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de animais usados.

1. Preparação de tecidos cerebrais

  1. Sacrifique camundongos em quatro pontos de tempo diferentes a cada 6 h durante um ciclo de 24 horas, em condições de claro/escuro (LD 12:12) e escuridão constante (DD) (Figura 1). Nas condições LD 12:12, consulte Zeitgeber Time (ZT), onde ZT0 corresponde ao início da fase clara e ZT12 ao início da fase escura. Na escuridão constante, consulte o Tempo Circadiano (CT), onde CT0 representa o início do dia subjetivo e CT12 denota o início da noite subjetiva.
    NOTA: Os pontos de tempo são ZT0/CT0 (início do dia, dia subjetivo), ZT6/CT6 (meio do dia, dia subjetivo), ZT12/CT12 (início da noite, noite subjetiva) e ZT18/CT18 (meio da noite, noite subjetiva).
  2. Perfundir e fixar cérebros de camundongos com 2,5% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4).
  3. Remova cada cérebro do crânio e deixe-o em uma solução fixadora (glutaraldeído a 2,5% e paraformaldeído a 2% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4) por 24 h a 4 ° C.
  4. Para preparar o cérebro para a secção, corte o cerebelo e divida o cérebro em dois hemisférios (Figura 2A, B).
  5. Escolha um hemisfério (direito ou esquerdo) e oriente-o de forma que as seções sejam cortadas tangencialmente ao córtex do barril. Monte o hemisfério selecionado no mandril de vibratomo e cole-o firmemente (Figura 2C).
  6. Corte seções com 60 μm de espessura (velocidade da seção do vibrato: 7,10 e frequência: 5,00) (Figura 2D) e, em seguida, transfira as seções para a mistura de tampão fosfato 0,1 M e solução fixadora (proporção 1:5).
  7. Examine as seções sob um microscópio óptico com ampliação de 4x e colete apenas aquelas com o córtex de campo de barril visível para a próxima etapa (Figura 2E). Use a corrediça côncava para garantir que a seção permaneça constantemente no líquido.

2. Fixação e seccionamento do cérebro

  1. Use um pincel e transfira suavemente os tecidos para uma pequena placa de Petri de vidro. Em seguida, enxágue as seções cerebrais no tampão de cacodilato 0,1 M (BC, pH 7,4) por 3 x 5 min.
  2. Fixe seções em tetróxido de ósmio a 1% (OsO4) em 0,1 M BC com ferricianeto de potássio a 1,5% e deixe a +4 ° C por 1 h.
    NOTA: Prepare a solução de OsO4 imediatamente antes de usar, pois o OsO4 é instável e sua atividade diminui com o tempo.
  3. Seções pós-fixadas em OsO4 a 1% em solução de 0,1 M BC por 1 h à temperatura ambiente.
    NOTA: Execute todas essas etapas usando luvas de proteção e sob a coifa com ventilação que funcione bem, pois o OsO4 é muito tóxico.
    Os resíduos devem ser mantidos em uma garrafa separada com tampa hermética. Não permita que o produto entre nos ralos.
  4. Após a fixação, enxágue as seções em água destilada por 2 x 5 min.
  5. Na próxima etapa, incubar seções cerebrais por 40 min na solução de etanol a 70% contendo acetato de uranila a 1%. Após a mistura, use uma seringa com filtro (25 mm) e despeje lentamente 2 mL da solução em cada placa de Petri com os tecidos.
  6. Desidratar tecidos em concentrações crescentes de álcool: etanol 70%, 80% e 90% por 5 min cada e etanol 100%, 3 x 5 min cada.
    NOTA: É possível deixar os tecidos em etanol a 70% durante a noite a +4 °C.
  7. Lave os lenços em óxido de propileno 2 x 10 min.
    NOTA: O óxido de propileno é um produto químico altamente corrosivo; Use-o com cuidado enquanto usa luvas de proteção e trabalha sob a hotte. Usar um recipiente de vidro (placa de Petri de vidro) é crucial para esta etapa.
    O óxido de propileno é um líquido e vapor extremamente inflamável. Os resíduos devem ser mantidos em um recipiente de vidro separado e bem fechado. Não deixe o produto entrar nos ralos; existe o risco de explosão.
  8. Substitua o óxido de propileno por uma mistura de resina Polybed e óxido de propileno (proporção de 1:1). Despeje pelo menos 2 mL da solução em cada placa de Petri com as seções, cubra com uma tampa e incube por 40 min.
  9. Finalmente, incorpore seções cerebrais na mistura de resina Polybed e óxido de propileno (proporção de 3:1). Use pelo menos 2 mL da mistura por placa de Petri, cubra e deixe por 1,5 h.
    NOTA: Certifique-se de que os tecidos estejam totalmente imersos e certifique-se de que não estejam flutuando acima do líquido.
  10. Corte o filme Aclar em pedaços que correspondam ao tamanho de uma lâmina de vidro. Usando uma pipeta de plástico, aplique um pequeno volume de resina no filme Aclar e transfira as seções cerebrais da placa de Petri para a resina com um pincel. Incorpore cada seção entre dois filmes Aclar e incube por 48 h em um forno a 65 ° C para polimerizar.

3. Imagem e seccionamento do córtex do barril

  1. Fotografe seções cerebrais com ampliação objetiva de 2x com um microscópio óptico (Figura 2F).
  2. Colete todas as imagens e importe-as para o software gráfico.
    1. Para abrir imagens, clique em Arquivo |Abra e selecione as imagens usando Shift |Aberto. As imagens serão abertas em janelas separadas.
    2. Comece a empilhar imagens do córtex (a menor parte) e continue até que todas as seções estejam alinhadas corretamente.
    3. Clique com o botão direito do mouse na Camada 1 |Camada duplicada em cada imagem. Na caixa de diálogo, insira o número da imagem como o nome, escolha uma imagem como o arquivo de destino e clique em OK. Repita essas etapas para todas as imagens, duplicando-as no mesmo arquivo de destino.
    4. Alinhe as imagens para reconstruir o campo do barril, garantindo a ordem anatômica adequada. Use a ferramenta Mover para posicionar cada camada manualmente e clique em Editar |Transformar |Girar ou inverter para ajustar a orientação, se necessário. Para ajustar o alinhamento, use Editar | Transformar | Distorcer e mover os cantos da imagem para corresponder às estruturas anatômicas de forma independente. Para facilitar o alinhamento, defina o modo de mesclagem da camada superior como Sobreposição no painel Camadas .
    5. Compare pontos de referência anatômicos, como contornos de barris e vasos sanguíneos, para garantir o posicionamento correto. Para salvar a pilha, clique em Arquivo |Salvar como, nomeie o arquivo e escolha seu formato (PSD ou TIFF); em seguida, clique em OK.
  3. Revise as várias seções que contêm o campo de barril sequencialmente, identificando barris visíveis em cada seção.
  4. Contorne manualmente cada barril visível em uma camada comum adicional, garantindo a reconstrução de todo o campo do barril. Para criar uma camada extra, clique em Camada |Novo |Camada, nomeie a camada e clique em OK. Selecione a Ferramenta Pincel na barra de ferramentas e, na nova camada, desenhe manualmente cada barril visível.
    1. Para maior precisão, use o zoom e ajuste o tamanho do pincel conforme necessário. Para aumentar e diminuir o zoom da imagem, use a Ferramenta Zoom ou pressione Ctrl + "+" / Ctrl + "-". Para alterar o tamanho do pincel, clique com o botão direito do mouse na tela enquanto a ferramenta Pincel estiver ativa e mova o controle deslizante Tamanho .
  5. Identifique o cano selecionado com base nesta reconstrução.
  6. Encontre o barril selecionado sob o microscópio óptico com base no padrão do campo do barril (cinco fileiras, cada uma com quatro a sete barris) e no arranjo dos vasos sanguíneos que indicam sua localização dentro do campo do barril.
  7. Em cada seção com um córtex de barril visível, identifique o barril selecionado sob um estereomicroscópio e corte-o junto com o adjacente usando uma lâmina de barbear.
  8. Remova o pequeno pedaço da seção, cole-o em um bloco de resina e guarde-o para secar. Mais tarde, apare o excesso de resina ao redor do tecido.
    NOTA: Certifique-se de colocar o pedaço de tecido plano na superfície da resina.
  9. Use um ultramicrótomo e uma faca de diamante para cortar seções consecutivas ultrafinas (3-6 seções, 65 nm de espessura) (Figura 3A) e colete em grades de níquel revestidas com formvar e ranhura única (2 x 0,75 mm).
  10. Depois de seco, contraste as amostras com acetato de uranila a 2% por 3 min e citrato de chumbo a 0,03% por 1,5 min.
    NOTA: Para contrastar, é importante lavar as grades algumas vezes e deixá-las secar completamente após cada etapa. Use seringas com filtros para acetato de uranila e citrato de chumbo.
  11. Tire imagens consecutivas da cavidade do barril selecionado (por exemplo, B2) sob um MET (tensão de aceleração de 80 kV em ampliações de 4K ou 8K, dependendo da área e do volume necessários para a análise.
    NOTA: Normalmente, é analisado pelo menos um volume total de 100 μm3 por animal.

4. Análise de imagem

NOTA: A criação e o alinhamento de pilhas de imagens TEM podem ser feitos da mesma maneira usando software livre (como o GIMP) e comercial (por exemplo, Photoshop). As reconstruções também podem ser realizadas da mesma maneira usando software comercial (por exemplo, 3D Studio Max) e programas totalmente gratuitos, como o Blender.

  1. Para estimar a densidade das sinapses, empilhe um mínimo de três imagens MET no software gráfico (Figura 6). Quanto maior o número de imagens seriais, maior a precisão dos cálculos.
    1. Para abrir imagens, clique em Arquivo |Abra e selecione as imagens usando Shift |Aberto; As imagens serão abertas em janelas separadas.
    2. Para cada imagem, clique com o botão direito do mouse na Camada 1 |Duplicar camada. Na caixa de diálogo, insira o número da imagem como nome, escolha uma imagem como destino e clique em OK. Repita as mesmas etapas para todas as imagens e duplique-as no mesmo destino.
    3. Para salvar a pilha, clique em Arquivo |Salvar como, nomeie o arquivo, escolha seu formato (PSD ou TIFF) e clique em OK.
  2. Para alinhar imagens TEM, selecione a camada superior da imagem e defina o modo de mesclagem como Sobreposição no painel Camadas . Usar Editar |Transformar |Girar ou a ferramenta Inverter para ajustar a orientação da imagem. Use a ferramenta Mover para alinhar estruturas.
    1. Para ajustes mais precisos, use Editar |Transformar | Distorcer para mover os cantos da imagem de forma independente. Para aumentar a precisão, mantenha pressionada a tecla Ctrl e arraste pontos de vértice individuais. Use mudanças no tamanho e na forma das mitocôndrias e bainhas de mielina axonal entre imagens sucessivas de MET para verificar a sequência correta das imagens.
  3. Use um método de dissecção para contar sinapses.
    1. Adicione camada à pilha de imagens EM clicando em Camada |Novo |Camada |ESTÁ BEM. Certifique-se de que a nova camada seja transparente (sem preenchimento de plano de fundo).
    2. Para definir a área de análise, clique em Camada |Novo |Camada |ESTÁ BEM; em seguida, selecione a Ferramenta Retângulo , vá para Camada |Estilo de Camada |Traço, defina a cor, a espessura (Tamanho) e a posição do traço (Interno recomendado), clique em OK e desenhe um retângulo. Selecione Preenchimento: 0%. Marque todas as sinapses presentes nas imagens MET que não cruzam duas bordas selecionadas adjacentes do retângulo (por exemplo, a direita e a parte inferior ou a parte superior e a esquerda).
    3. Adicione uma nova camada para anotações clicando em Camada |Novo |Camada |ESTÁ BEM. Use a Ferramenta Pincel para marcar sinapses na nova camada. Use a ferramenta Zoom e a ferramenta manual para uma marcação precisa.
    4. Escolha uma cor para marcar as sinapses excitatórias e outra diferente para as sinapses inibitórias. Para alterar a cor, clique na caixa de cores do primeiro plano na barra de ferramentas, selecione uma cor na janela Seletor de cores e clique em OK.
  4. Se as imagens MET contiverem estruturas grandes (por exemplo, fibras nervosas mielinizadas, dendritos grandes ou partes do corpo celular), use uma grade com vários quadrados. Isso permite a exclusão de quaisquer quadrados que estejam totalmente ocupados por grandes estruturas.
    1. Adicione uma nova camada transparente clicando em Camada |Novo |Camada |ESTÁ BEM. Ative a visualização em grade clicando em Exibir |Mostrar |Grade e habilite o ajuste à grade clicando em Exibir |Ajustar para |Grade.
    2. Defina o espaçamento da grade clicando em Editar |Preferências |Guias, Grade & Fatias. Selecione a ferramenta Linha , defina o modo como Forma ou Pixels, defina a espessura da linha (por exemplo, 1 px) e desenhe linhas verticais e horizontais ao longo da grade visível para cobrir toda a área da imagem.
  5. Defina as seções "superior" e "inferior" para cada pilha de imagens. Conte apenas as sinapses que estão ausentes na última imagem, mas presentes nas imagens anteriores. Isso permite a identificação precisa das sinapses sem superestimar seu número.
  6. Use a escala na imagem e calcule o volume da amostra (pilha de imagens TEM). Meça a área onde as sinapses são contadas e multiplique pelo número de imagens MET na pilha e pela espessura das seções ultrafinas.
  7. Divida o número de sinapses por volume para determinar a densidade de sinapses por unidade de volume.
  8. Use todas as imagens MET contendo uma espinha dendrítica (geralmente 10-12 micrografias eletrônicas consecutivas) para reconstruir uma espinha dendrítica e as sinapses que ela forma.
    1. Abra a pilha de imagens no software gráfico. Selecione a ferramenta Corte , marque a área que contém a espinha dendrítica na pilha e pressione Enter. A área selecionada será cortada em todas as camadas visíveis. Torne apenas um visível de cada vez, oculte outras camadas usando o ícone de olho no painel Camadas .
    2. Salve cada imagem cortada separadamente clicando em Arquivo |Salvar como, nomeie o arquivo, escolha um formato (JPG recomendado) e clique em OK. Repita para cada camada na pilha.
      NOTA: Antes de transferir as imagens para um software de reconstrução 3D, é melhor primeiro marcar os elementos que estão sendo reconstruídos com cores.
    3. Adicione uma nova camada para anotação clicando em Camada | Novo |Camada | ESTÁ BEM.
    4. Defina a opacidade da camada para 30-50% no painel Camadas .
    5. Selecione a Ferramenta Pincel , escolha uma cor diferente para cada estrutura (por exemplo, espinha dendrítica, sinapse) e marque os elementos. Trabalhe apenas na nova camada para preservar a imagem original. Quando terminar, mescle a camada de anotação com a imagem, clique com o botão direito do mouse na camada superior e mescle para baixo. Repita essas etapas para cada imagem TEM contendo uma seção transversal da coluna dendrítica.
  9. Transfira as imagens TEM com seções transversais visíveis da coluna dendrítica para o software de reconstrução 3D. Para excluir o objeto Cube padrão, clique com o botão direito do mouse no objeto e exclua. Para alinhar a perspectiva da viewport antes de carregar imagens, clique em Z no Gizmo de navegação ou pressione Numpad 7. Para fazer upload de imagens, clique em Adicionar |Imagem |Referência, selecione a primeira imagem e clique duas vezes nela para confirmar. Repita para cada imagem, garantindo que a perspectiva da janela de visualização permaneça consistente por toda parte.1
    NOTA: Para girar a vista, segure o botão do meio do mouse e mova o mouse ou use o Gizmo de navegação. Para deslocar a exibição, mantenha pressionada a tecla Shift + botão do meio do mouse, mova o mouse ou use Mover a exibição.
  10. Disponha as imagens MET na distância apropriada, levando em consideração a espessura das seções ultrafinas (Figura 4A). Para posicionar a última imagem TEM ao longo do eixo Z, clique na imagem, clique em Propriedades do objeto (barra lateral direita) e insira o valor em Localização Z. As imagens agora podem ser distribuídas entre a primeira e a última imagem. Para distribuí-los, selecione todas as imagens, pressione N para abrir o painel N e clique na guia Editar (no painel N) | Dist Z.
    NOTA: Antes de fazer qualquer ajuste, alinhe a perspectiva da viewport e clique em Z no Gizmo de navegação ou pressione Numpad 7.
    A ferramenta Distribuir deve estar habilitada para distribuir as imagens. Para ativá-lo, vá para Editar | Preferências | Obtenha extensões, pesquise "Distribuir" e clique em Instalar. Uma vez ativada, a ferramenta Distribuir permanece ativa entre as sessões e não precisa ser reativada, desde que a mesma versão do programa seja usada.
  11. Contorne manualmente a forma da espinha dendrítica em cada imagem usando uma única curva por imagem TEM (Figura 4B, C).
    1. Certifique-se de que apenas a primeira imagem TEM esteja visível. Na Coleção de cenas, oculte todos os outros objetos usando o ícone de olho . Para criar uma curva base para o contorno, clique em Adicionar |Curva |Círculo. Mova o objeto BézierCircle, segure G, mova o mouse e clique para aceitar as alterações.
    2. Para corresponder ao tamanho do perfil da coluna dendrítica, dimensione o objeto, segure S, mova o mouse e clique. Entre na guia Modelagem com o objeto BézierCircle selecionado. Alinhe a perspectiva da viewport novamente e clique em Z no Gizmo de navegação ou pressione Numpad 7.
    3. Para ajustar a forma da curva, selecione um ponto de controle, mantenha pressionado G, mova o mouse e clique.
    4. Para ajustar a direção e a resistência das alças, selecione um ponto da alça, pressione G para mover ou S para dimensionar e clique para confirmar. Repita para cada ponto.
    5. Para adicionar um novo ponto de controle, selecione dois pontos de controle existentes, mantenha pressionada a tecla Shift e clique em cada ponto, clique com o botão direito do mouse e selecione Subdividir. Quando a curva corresponder suficientemente ao limite do perfil da coluna dendrítica, entre na guia Layout , clique com o botão direito do mouse no objeto BézierCircle e em Duplicate Object e clique sem mover o mouse. Crie o mesmo número de cópias do BézierCircle que as imagens TEM usadas para reconstrução. Alinhe-as com as imagens MET organizadas usando a ferramenta Distribuir como na etapa 4.10.
    6. Ajuste cada curva BézierCircle na guia Modelagem para corresponder ao perfil da coluna dendrítica em cada imagem. Certifique-se de que apenas o objeto BézierCircle editado no momento e a imagem TEM correspondente estejam visíveis por vez.
      NOTA: Todas as ações de clique com o botão direito do mouse necessárias para determinadas etapas devem ser executadas dentro do limite da cena. As curvas sucessivas devem corresponder aos limites de seções consecutivas da coluna dendrítica e conter o mesmo número de pontos de controle.
  12. Conecte linhas adjacentes usando a função de reconstrução 3D para formar uma superfície contínua e criar a forma 3D final (Figura 4D).
    1. Certifique-se de que apenas os objetos BézierCircle estejam visíveis. Na Coleção de cenas, oculte todos os outros objetos usando o ícone de olho na barra lateral.
    2. Para criar o objeto de espinha dendrítica, vá para a guia Layout , selecione todos os objetos BézierCircle, clique com o botão direito do mouse e clique em Unir. Converta o objeto unido em uma malha clicando com o botão direito do mouse e selecionando Converter em |Malha.
    3. Para conectar as arestas do objeto unido, entre na guia Modelagem , pressione 2 para entrar no modo de seleção de aresta |Selecione |Todos |clique com o botão direito do mouse |Loops de borda de ponte.
    4. Para preencher a lacuna na parte superior do objeto, desmarque tudo clicando ao lado do objeto, segure Alt e clique em uma seção de borda da borda superior, clique com o botão direito do mouse, selecione Extrusão de bordas, arraste para cima no eixo Z, pressione S e mova o mouse para reduzir o novo loop de borda, clique para aceitar a alteração. Enquanto o novo contorno de aresta ainda estiver selecionado, clique com o botão direito do mouse e selecione Nova face a partir de arestas. Preencha a lacuna inferior usando o mesmo método.
    5. Para suavizar o objeto, entre na guia Layout , clique com o botão direito do mouse e selecione Sombrear suave. Para suavizar ainda mais a forma, vá para Modificadores (barra lateral direita) |Adicionar modificador |Gerar |Superfície de subdivisão. Defina os níveis de Viewport e Render com o mesmo valor (recomendado 1).
  13. Repita as etapas 4.11-4.12 para reconstrução de sinapses (Figura 4E, F).
  14. Atribua uma cor a cada estrutura e use a função de renderização para preparar a imagem final (Figura 4G,H). Vá para o menu Sombreamento da viewport e selecione Renderizado para visualizar as alterações do material. Selecione o objeto a ser colorido e clique em Material (barra lateral direita) |Novo |ajustar cor base.
    1. Para refinar a aparência do material, ajuste os controles deslizantes Rugosidade ou Metálico conforme necessário. Use este método para atribuir uma cor distinta a cada estrutura.
    2. Para ajustar a iluminação da cena, clique no objeto Luz, segure G e mova o mouse para reposicioná-lo. Para alterar a intensidade da luz, vá para Dados (barra lateral direita) e ajuste o valor de Potência .
    3. Para posicionar a câmera, oriente a viewport para ficar de frente para a lombada reconstruída como ela deve aparecer na imagem final, pressione Ctrl + Alt + Numpad 0. Selecione o quadro visível da câmera, segure G e mova o mouse para reposicioná-lo, se necessário.
    4. Para se preparar para a renderização, vá para a Saída (barra lateral direita), altere os valores de Resolução X e Y para corresponder à imagem desejada. Para melhorar a qualidade da imagem, vá para Renderizar (barra lateral direita) |Renderizar, ajustar o valor de Amostras para entre 120 e 250. Para um plano de fundo transparente, vá para Renderizar |Filme |marque Transparente. Para renderizar a imagem, pressione F12 ou vá para Renderizar (menu superior) |Renderizar imagem.

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Results

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Para aplicar adequadamente nosso método à análise das mudanças sinápticas circadianas, é necessário começar selecionando pelo menos quatro pontos de tempo em intervalos iguais, com dois pontos para cada fase da atividade dos animais (a cada 6 h). Nesses pontos de tempo designados, os animais são sacrificados e seus cérebros são coletados. Essa abordagem permite a identificação de padrões diários ou circadianos de plasticidade sináptica e os vincula a mudanças na atividade locomotora dos animais (Figu...

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Discussion

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Aqui, apresentamos a metodologia usada para estudar a plasticidade circadiana das sinapses e a reconstrução das espinhas dendríticas no córtex barril de camundongos. Para garantir resultados confiáveis, o estudo da plasticidade circadiana deve incluir pelo menos quatro pontos no tempo. Nossa pesquisa mostrou que os dados de dois pontos de tempo - um durante a fase de repouso (dia) e outro durante a fase de atividade (noite) - forneceram informações sobre as diferenças diárias entre as fa...

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Disclosures

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgements

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Este trabalho é apoiado por doações do Centro Nacional de Ciências da Polônia, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 para EP e da Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica, nr N41/DBS/001129 para MJ.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Filme AclarÁgar científicoAGL4458
Software BlenderVersão: v. 2.91.2
Ácido cacodílico, sal de sódio tri-hidratadoPoliciências01131-100
Corrediça côncavaMenzel9.161 151
Faca de diamante Diatomáceo15-EUAÂngulo da faca: Ultra 45°  
Câmera digital Nikon DXM 1200 F
Hidrogenofosfato dissódico dodecahidratadoPOLO799280115
Resina de incorporaçãoPoliciências08792-1Formulação Luft 
EtanolPol-AuraPA-11-0004
Software GIMPVersão: v 3.0.4
Citrato de chumboTAABL018
Microscopia de luz Nikon Optiphot
Tetróxido de ósmio Policiências0223C-10Cristalino (99,95%)
Pincel
Software Photoshopversão: CS5
Ferricianeto de potássioSigmaaldrichPág. 8131
Óxido de propileno Sigmaaldrich82320puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
Grades de slot únicoÁgar científicoAGG25252 x 0,75 mm ou 2 x 1 mm
Cloreto de sódio Chempur117941206
Dihidrogenofosfato de sódio di-hidratadoChempur117991808
Microscópio estéreopzo
Filtro de seringa BiosensBS25PES045
TEM JoelJEM-2100
UltramicrótomoLeicaUC7
Acetato de uraniloLachema
VibratomoLeicaVT1000 S

References

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