Apresentamos um protocolo in vitro otimizado para a produção de partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 que imitam de perto o vírus autêntico. Essa abordagem permite a investigação dos mecanismos de infecção, montagem e saída viral sem as restrições de exigir um laboratório de nível 3 de biossegurança.
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Artigo de método
Produção de um sistema de partículas semelhante ao vírus SARS-CoV-2 para investigar os ciclos de vida virais in vitro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O método de partícula semelhante ao vírus da síndrome respiratória aguda grave do coronavírus 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) oferece uma ferramenta poderosa e acessível para estudar o ciclo de vida do SARS-CoV-2 sem a necessidade de laboratórios de nível de biossegurança 3 (BSL-3). Este sistema imita efetivamente os estágios críticos do ciclo de vida viral, incluindo montagem, empacotamento do genoma e saída, usando um repórter de luciferase fundido ao sinal T20 para detecção sensível e precisa da produção de partículas virais. As SC2-VLPs são geradas pela co-expressão de proteínas estruturais do SARS-CoV-2, incluindo membrana (M), nucleocapsídeo (N), envelope (E) e pico (S), juntamente com o sinal de empacotamento de RNA em células HEK-293T. Ao contrário dos sistemas tradicionais de partículas semelhantes a vírus, o método SC2-VLP garante quantificação precisa e maior fidelidade ao ciclo de vida viral natural. Além disso, em comparação com os métodos de pseudotipagem lentiviral, que se limitam a estudar a entrada viral por meio da incorporação da proteína S em partículas lentivirais baseadas no HIV, o sistema SC2-VLP fornece uma plataforma mais abrangente para explorar vários estágios da biologia do SARS-CoV-2. Embora esse método ignore os riscos de lidar com vírus vivos e expanda a acessibilidade. O método SC2-VLP representa um avanço significativo na pesquisa antiviral e no desenvolvimento de estratégias terapêuticas contra o SARS-CoV-2.
Introdução
A pandemia de COVID-19 emergiu como uma das crises globais de saúde mais devastadoras da história moderna, resultando em milhões de mortes em todo o mundo1. O vírus responsável, SARS-CoV-2, segue um ciclo de vida complexo que inclui estágios-chave, como infecção, replicação do genoma, montagem e saída. O processo de infecção começa quando a proteína spike viral (S) se liga ao receptor da célula hospedeira, a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2), facilitando a liberação do genoma viral na célula hospedeira 2,3. A RNA polimerase dependente de RNA viral (RdRp) então catalisa a replicação do RNA genômico. Este RNA, em complexo com a proteína do nucleocapsídeo (N), forma uma estrutura estável que é reconhecida pela proteína de membrana (M). A proteína M desempenha um papel central na montagem viral, recrutando o complexo RNA-N, S, e a proteína do envelope (E) 4 , 5 . Após a montagem, o vírion completa sua saída por meio de uma via de tráfego mediada por lisossomos não canônica6.
Em resposta à pandemia, recursos globais substanciais foram mobilizados para desenvolver vacinas, anticorpos neutralizantes e medicamentos antivirais. A avaliação dessas intervenções tem sido essencial para o avanço da pesquisa sobre o SARS-CoV-27. No entanto, o estudo do vírus vivo apresenta desafios logísticos significativos, pois os experimentos envolvendo o vírus devem ser conduzidos em laboratórios de Nível de Biossegurança 3 (BSL-3). A disponibilidade limitada de instalações BSL-3 restringiu o ritmo das pesquisas destinadas a entender e combater o SARS-CoV-2.
Para enfrentar esses desafios, dois grandes sistemas de partículas semelhantes a vírus (VLP) e pseudotipagem lentiviral - foram amplamente adotados na pesquisa de SARS-CoV-2, ambos os quais não requerem contenção BSL-38. O sistema VLP envolve a co-transfecção de células com genes que codificam proteínas estruturais virais, incluindo M, S, E e N, que juntas geram partículas semelhantes a vírus. Essas partículas imitam as propriedades estruturais e funcionais do vírus, tornando-as uma ferramenta valiosa para estudar processos-chave no ciclo de vida do SARS-CoV-2 e até mesmo um antígeno eficaz para o desenvolvimento de vacinas 9,10,11.
Por outro lado, o sistema de pseudotipagem lentiviral envolve a substituição da proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV) no lentivírus pela proteína SARS-CoV-2 S, permitindo a produção de partículas lentivirais que podem incorporar genes repórteres, como luciferase ou GFP. Esse sistema é particularmente útil para investigar anticorpos neutralizantes que bloqueiam a interação S-ACE212. No entanto, a pseudotipagem lentiviral não reflete a montagem ou saída viral do SARS-CoV-2 devido ao uso de proteínas estruturais do HIV, que medeiam a liberação de partículas na membrana plasmática.
Para superar essas limitações, Syed et al. identificaram recentemente o sinal de empacotamento do SARS-CoV-2 em seu genoma de RNA, o que demonstra a especificidade da proteína N em relação ao reconhecimento do genoma viral13. Ao fundir esse sinal de empacotamento aos genes repórteres, é possível incorporar eficientemente esses genes em partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 (SC2-VLPs)13. Essa estratégia não apenas replica os processos de montagem e saída do SARS-CoV-2, mas também permite a medição sensível das etapas de infecção. Neste estudo, apresentamos a metodologia experimental para o uso do sistema SC2-VLP e destacamos as principais considerações para a condução dessa abordagem.
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Protocolo
1. Geração de SC2-VLPs
- Semear ~ 3,0 × 106 células HEK-293T em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro com meio completo DMEM, suplementado com 10% v / v FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
NOTA: Para garantir alta eficiência de transfecção e produção ideal de SC2-VLP, as células HEK-293T devem ser mantidas em números de passagem baixos ~ 10. - Cultivar a célula HEK-293T a 37 °C, 5% de CO2 durante cerca de 24 h e verificar a confluência celular ao microscópio. Prossiga se ~ 70% confluente.
- Diluir 60 μL de PEI de 1 mg/mL para 200 μL com meio sem soro.
- Adicione 6,7 μg de plasmídeo N, 10 μg de plasmídeo Luc-T20, 0,016 μg de plasmídeo S e 3,3 μg de plasmídeo M-IRES-E em 200 μL de meio livre de soro (consulte o Arquivo Suplementar 1).
- Adicione suavemente o PEI diluído da etapa 1.3 à solução contendo plasmídeos que codificam as proteínas da estrutura viral da etapa 1.4 e incube em temperatura ambiente por 10 min. Esta é a solução de transfecção.
- Solte cuidadosamente a solução de transfecção da etapa 1.5 nas células HEK-293T e gire suavemente a placa de cultura de tecidos para uma mistura completa.
- Troque o meio de cultura celular 6 h após a infecção pelo meio completo DMEM e incube as células HEK-293T transfectadas a 37 ° C, 5% CO2 por 48 h.
- Colete o sobrenadante das células HEK-293T infectadas, que contém as SC2-VLPs, e filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 μm para remover os detritos celulares. Este é o meio SC2-VLP.
NOTA: Tentamos produzir SC2-VLPs em linhagens celulares HeLa, Vero E6 e Caco2, mas nenhum título viral mensurável foi obtido, indicando a especificidade do protocolo para células HEK-293T.
2. Exame da eficácia do SC2-VLP
NOTA: A linhagem celular HEK-293T expressando de forma estável ACE2 e TMPRSS2 foi estabelecida usando uma abordagem de transdução lentiviral 14,15. A expressão proteica de ACE2 e TMPRSS2 foi confirmada pela análise de western blot, seguindo um protocolo semelhante ao descrito na Etapa 3 (análise da composição SC2-VLP).
- Semeie 4,0 × 104 células HEK-293T com expressão estável de ACE2 e TMPRSS2 em uma placa de 96 poços e adicione 50 μL de meio SC2-VLP a partir da etapa 1.8.
- Incubar a placa de cultura de tecidos de 96 poços a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h.
- Remova o meio da placa de 96 poços e lave uma vez com 100 μL de tampão PBS a 37 ° C, contendo 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 e 1,8 mM de KH2PO4.
- Lise as células HEK-293T ACE2/TMPRSS2 com 20 μL de tampão de lise passivo, balançando suavemente a amostra por 15 min em um agitador orbital à temperatura ambiente.
NOTA: O tampão de lise contém 25 mM de Tris-fosfato (pH 7,8), 2 mM de DTT, 2 mM de ácido 1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetracético, 1,25 mg/mL de lisozima, 2,5 mg/mL de BSA, 10% de glicerol e 1% de Triton X-100). - Gire a placa de 96 poços a 4.000 × g por 15 min a 4 ° C em uma centrífuga de microplacas refrigerada e, em seguida, transfira imediatamente a placa para um banho de gelo.
- Pegue 100 μL de tampão de ensaio de luciferase reconstituída para uma placa branca opaca de 96 poços e adicione 20 μL de lisado da etapa 2.5. Misture-os brevemente pipetando para cima e para baixo 2-3x.
- Meça a luminescência usando um leitor de placas com os seguintes parâmetros: Modo de detecção: Luminescência; Faixa de comprimento de onda: espectro completo; Formato da placa: placa opaca padrão de 96 poços; Tempo de integração: 200 ms.
3. Exame da composição do SC2-VLP
- Adicione 1,36 mL de solução de PEG 8000, contendo 50% de PEG 8000 e 2,2% de NaCl, a 10 mL de meio SC2-VLP da etapa 1.8.
- Manter a mistura num agitador orbital e misturar lentamente a solução a 4 °C durante a noite.
- Centrifugue a solução a 4 °C, 2.000 × g por 30 min e colete o pellet SC2-VLP para análise de western blotting16.
NOTA: Para a análise de western blotting, todas as informações sobre os anticorpos são fornecidas na Tabela de Materiais.
4. Análise da localização subcelular de S e seus mutantes em células produtoras de SC2-VLP
- Semeie ~ 3,0 × 106 células HEK-293T uniformemente na placa de cultura com fundo de vidro com 15 mm de diâmetro e, em seguida, permita que as células adiram e cresçam até ~ 70% de confluência antes da transfecção.
- Repita o procedimento de transfecção conforme descrito nas etapas 1.3 a 1.7 e modifique apenas as quantidades de plasmídeo da seguinte forma: plasmídeo N: 1,3 μg, plasmídeo Luc-T20: 2 μg, plasmídeo S: 0,0032 μg e plasmídeo M-IRES-E: 0,66 μg.
- Lave suavemente a placa de cultura duas vezes com 1 mL de PBS gelado e, em seguida, adicione 1 mL de solução de fixação de paraformaldeído a 4% (PFA) à temperatura ambiente (RT) por 15 min.
- Lave as células por 2 x 5 min com 1 mL de PBS em RT e, em seguida, permeabilize as células adicionando 1 mL de Triton X-100 a 0,25% em RT por 10 min.
- Lave as células por 2 x 5 min com 1 mL de PBS em RT e, em seguida, adicione 1 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 5% em RT por 1 h para bloquear interações inespecíficas de anticorpos.
- Adicione ~ 200 μL de solução de anticorpo primário (o suficiente para cobrir o fundo do vidro) e incube a 4 ° C durante a noite.
NOTA: As soluções de anticorpos primários são preparadas diluindo em 5% de BSA dissolvido em PBS nas seguintes proporções de diluição: o anticorpo anti-S de camundongo a 1:200, o anticorpo anti-Sec61β de coelho a 1:200, o anticorpo anti-GM130 de coelho a 1:200 e o anticorpo anti-ERGIC53 de coelho a 1:200. A solução de BSA/PBS a 5% serviu como diluente e tampão de bloqueio para minimizar a ligação inespecífica durante os procedimentos subsequentes de coloração por imunofluorescência. - Remova a solução primária de anticorpos e lave as células por 3 x 5 min com 1 mL de PBS em RT.
- Adicione a solução de anticorpo secundário conjugado com fluorescência em RT por 1 h e, em seguida, lave as células por 3 x 5 min com 1 mL de PBS em RT.
NOTA Todas as etapas subsequentes devem ser executadas no escuro ou sob exposição mínima à luz para evitar o fotobranqueamento de conjugados fluorescentes e preservar a integridade do sinal. Dois tipos de anticorpos secundários conjugados com fluorescência, derivados de camundongos ou coelhos, são empregados para corar a proteína S ou as proteínas marcadoras de organelas celulares. - Corar os núcleos com solução de Hoechst 2,5 μg/mL em RT por 5 min e, em seguida, lavar as células por 3 x 5 min com 1 mL de PBS em RT.
- Observe a coloração da proteína S ou organela e adquira imagens usando um microscópio confocal com os seguintes parâmetros: Modo PMT definido para VBF (sem média, varredura sequencial de linha) com abertura autoconfocal. Para o canal 1 (FITC), use o laser de 488 nm a 25% de potência com emissão de 500 a 548 nm, HV 525 V, ganho de 1x e deslocamento de 5%. Para o canal 2 (Alexa Fluor 594), use o laser de 594 nm a 25% de potência com emissão de 610 a 670 nm, HV 500 V, ganho de 1x e deslocamento de 5%. Para o canal 3 (DAPI), use o laser de 405 nm a 25% de potência com emissão de 430 a 470 nm, HV 490 V, ganho 1x e deslocamento de 5%.
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Resultados
As etapas de saída e montagem do ciclo de vida do SARS-CoV-2 foram menos estudadas do que as etapas de infecção e replicação17,18. Antes do desenvolvimento do método SC2-VLP, esses processos só podiam ser investigados usando SARS-CoV-2 vivo, confinando a pesquisa aos laboratórios BSL-313. O fluxo de trabalho SC2-VLP, mostrado na Figura 1, descreve o protocolo experimental e ilustra os processos envolvidos ness...
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Discussão
Um método simples e eficaz para modelar o ciclo de vida do SARS-CoV-2 em sistemas de cultura de células, sem as restrições dos laboratórios BSL-3, representa um avanço fundamental para a pesquisa anti-SARS-CoV-2. O método SC2-VLP atende a essa necessidade, oferecendo uma plataforma robusta e acessível. Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado para o método SC2-VLP, descrevendo etapas experimentais críticas para a produção de SC2-VLPs. Além disso, destacamos sua versatilidade e apl...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo programa de fundos Startup da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM) (90011451310011). Estendemos nossa gratidão a todos os membros do laboratório do Dr. Ma no BUCM pela inestimável discussão e assistência com os experimentos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Albumina de soro bovino (BSA) | Tecnologia de sinalização celular | 9998S | |
| Microscópio de varredura a laser confocal | Olympus | FV3000 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Thermofisher | A5670402 | |
| cabra Anti-rato IgG H & L (Alexa Fluor 488) anticorpo | Invitrogen | A11001 | taxa de diluição: IF 1:1000 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 594) anticorpo | Abcam | ab150080 | taxa de diluição: IF 1:1000 |
| Linha celular HEK-293T | Infraestrutura Nacional de Recursos de Linha Celular (NICR) | NICR-293T-001 | Para garantir alta eficiência de transfecção e produção ótima de SC2-VLP, as células HEK-293T devem ser mantidas em números de passagem baixos (≤ P10). |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Concentração de trabalho: 2.5 μ g/mL |
| Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1500 | |
| Luc-T20 | Addgene | 177941 | |
| monoclonal anti-GAPDH Proteintech | 60004-1-Ig | : WB 1:20.000 | |
| Abclonal | A23771 | anti-S RBD monoclonal de camundongo | IF 1:200 |
| OptiMEM | Thermofisher | 31985070 | meio sem soro para transfecção |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | P3635 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermofisher | 15140122 | |
| Polietilenoimina (PEI) | Thermofisher | 43896.01 | |
| Tampão de lise passiva | Promega Promega | E1941 | |
| Relação de diluição anti-ACE2 policlonal de coelho | Proteintech | 21115-1-AP | : WB 1:1000 |
| anti-ERGIC53 policlonal de coelho | Proteintech | 13364-1-AP | : IF 1:200 |
| anti-GM130 policlonal de coelho Proteintech | 11308-1-AP | : IF 1:200 | |
| anti-S Abcam | ab272504 | WB 1:1000 | |
| Coelho policlonal anti-Sec61β | Proteintech | 15087-1-AP | : IF 1:200 |
| Coelho policlonal anti-TMPRSS2 | Abcam | ab109131 | taxa de diluição: WB 1:1000 |
| SARS-CoV-2 M-IRES-E plasmídeo | Addgene | 177938 | |
| SARS-CoV-2 N plasmídeo | Addgene | 177959 | |
| SARS-CoV-2 Nucleoproteína Coelho mAb | Abclonal | A21042 | taxa de diluição: WB 1:4000 |
| Plasmídeo S SARS-CoV-2 | Addgene | 177960 | |
| Anticorpo Secundário, HRP, IgG anti-rato de cabra (H+L) | Invitrogen | 31460 | : WB 1:5000 |
| Anticorpo Secundário, HRP, IgG anti-Coelho de cabra (H+L) | Invitrogen | 31430 | : WB 1:5000 |
| Leitor de placas SpectraMax i3x | Dispositivos moleculares | SpectraMax i3x |
Referências
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Reimpressões e permissões
