Um guia passo a passo para o isolamento e análise da superfície foliar e RNA apoplástico usando rosetas de Arabidopsis

Resumo

Descrevemos um método simples, mas altamente reprodutível, para isolar o RNA extracelular da superfície da folha e do apoplasto de plantas de Arabidopsis.

Resumo

A superfície das folhas das plantas e o espaço intercelular dentro das folhas (o apoplasto) servem como interfaces chave para a troca molecular entre as plantas e seus micróbios que interagem. Em trabalhos anteriores, demonstramos a presença de uma gama diversificada de espécies de RNA no apoplasto de rosetas de Arabidopsis. Mais recentemente, nossas descobertas revelaram que as plantas Arabidopsis também secretam ativamente RNA em suas superfícies foliares. Para investigar isso, desenvolvemos um método altamente reprodutível para coletar a lavagem da superfície da folha (LSW) e o fluido de lavagem apoplástico (AWF) do mesmo conjunto de plantas de Arabidopsis. Além disso, exploramos uma técnica não invasiva envolvendo swab da superfície foliar (LSS), que nos permitiu coletar RNA esfregando suavemente a superfície da folha com palitos estéreis com ponta de algodão. Para minimizar o risco de contaminação microbiana, filtramos as frações LSW, AWF e LSS antes de isolar o RNA extracelular (exRNA). Ao analisar o exRNA purificado usando eletroforese em gel de RNA desnaturante, observamos uma gama diversificada de espécies de RNA longas e pequenas em amostras de RNA LSW, LSS e AWF. Quantificação adicional e análise comparativa entre amostras de exRNA e condições experimentais foram realizadas usando o software de acesso livre ImageJ. Este protocolo fornece uma abordagem eficiente e econômica para isolar e analisar pequenas quantidades de exRNA das folhas das plantas. Essas preparações de RNA podem ser caracterizadas por meio de sequenciamento e outras análises moleculares, oferecendo insights sobre os papéis dinâmicos do exRNA nas interações planta-micróbio.

Introdução

As folhas são colonizadas por uma variedade de micróbios, incluindo bactérias, fungos, oomicetos e protistas, que podem ajudar a proteger as plantas de estressores bióticos e abióticos, promovendo o crescimento e o desenvolvimento das plantas 1,2,3,4. A folha da planta tem dois compartimentos principais para hospedar seus micróbios que interagem: epífito (superfície da folha) e endofítico (apoplasto)². A superfície da folha é protegida por uma camada de cutícula hidrofóbica, que evita a perda de água e inclui componentes como cera e cutina. A superfície superior da folha (adaxial) geralmente inclui células epidérmicas especializadas semelhantes a pêlos chamadas tricomas, que protegem contra a luz ultravioleta, regulam a temperatura e servem como impedimentos à herbivoria. Em contraste, o apoplasto facilita a troca de gás e água para a fotossíntese e fornece um ambiente úmido propício à colonização microbiana⁵. Apesar dessas diferenças, ambos os compartimentos foliares favorecem certos micróbios, sendo as redes microbianas epífitas mais complexas em termos de diversidade em comparação com as redes microbianas endofíticas⁵. Como a composição dessas comunidades microbianas é regulada em cada compartimento extracelular permanece pouco compreendida. Especulamos que a estrutura da comunidade microbiana pode ser determinada, em parte, pelo RNA extracelular (exRNA) secretado pela planta hospedeira.

Em nosso estudo recente, relatamos a presença de diversas espécies de RNA na superfície da folha que diferem do RNA no apoplasto ou lisados celulares⁶. Embora a maioria das pesquisas sobre exRNAs em plantas tenha se concentrado em pequenos RNAs não codificantes, como microRNAs (miRNAs) e pequenos RNAs interferentes (siRNAs), menos atenção tem sido dada a outras espécies de RNA, como fragmentos derivados de rRNA e tRNA, que podem potencialmente regular processos celulares independentes da complementaridade de sequência, particularmente em espécies sem mecanismos de interferência de RNA ^{7,8, 9}.

O método que descrevemos aqui permite o isolamento sequencial de RNA da lavagem da superfície foliar (LSW) e do fluido de lavagem apoplástico (AWF) usando o mesmo conjunto de plantas Arabidopsis. Além disso, descrevemos uma técnica ortogonal não invasiva envolvendo um swab da superfície foliar (LSS), que permite a coleta de RNA esfregando suavemente a superfície da folha pulverizada com palitos estéreis com ponta de algodão⁶. Para minimizar o risco de contaminação microbiana, filtramos as frações LSW e AWF antes de isolar o RNA extracelular. Para avaliar a distribuição de quantidade e tamanho de amostras de exRNA, descrevemos um protocolo que emprega eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante combinada com análise de imagem usando o software de acesso livre ImageJ. Este protocolo fornece uma abordagem eficiente e econômica para isolar e analisar pequenas quantidades de exRNA. Essas preparações de RNA podem ser caracterizadas por meio de sequenciamento e análises moleculares, oferecendo insights sobre os papéis dinâmicos do RNA extracelular nas interações planta-micróbio.

O protocolo descrito abaixo difere do nosso protocolo descrito anteriormente para isolar RNA de vesículas extracelulares de plantas¹⁰. O protocolo atual não requer nenhuma etapa de ultracentrifugação e permite o isolamento do RNA do fluido de lavagem extracelular total, não apenas das vesículas extracelulares. Mais significativamente, ele fornece dois métodos ortogonais para isolar o RNA da superfície da folha. Até onde sabemos, o isolamento do RNA da superfície foliar não foi descrito antes de nossa recente publicação⁶.

Protocolo

1. Preparação e esterilização do tampão

1. Prepare o tampão de isolamento de vesículas (VIB) compreendendo 20 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES), pH 6,0, 2 mM de CaCl₂ e 0,01 M de NaCl em 1 L de água destilada.
   NOTA: Pequenos ajustes na concentração de NaCl no VIB foram feitos de 0,1 M a 0,01 M para mimetizar a concentração iônica do apoplasto foliar.
2. Autoclave o VIB por 20 min a 121 °C, ciclo líquido. Como alternativa, esterilize o VIB por filtro usando um filtro a vácuo de 0.45 μm.
   NOTA: Esta etapa é para garantir que o tampão seja estéril, pois qualquer contaminação microbiana pode levar à elicitação de plantas e, por sua vez, à variabilidade nos resultados. Este tampão pode ser armazenado à temperatura ambiente (sem abrir a tampa após a esterilização) para armazenamento de curto prazo ou a 4 °C para armazenamento de longo prazo.

2. Material vegetal e condição de crescimento

1. Semeie sementes de Arabidopsis thaliana Col-0 tipo selvagem (WT) em potes de plástico redondos de 4 polegadas contendo uma mistura de envasamento padrão. Após a semeadura, embeber as sementes com um fungicida biológico (600 mg/L), cobri-las com uma cúpula de plástico transparente e mantê-las a 4 °C no escuro por 3 dias para induzir a germinação síncrona.
2. Transfira os vasos com sementes para uma câmara de crescimento de dia curto com temperatura controlada ajustada a 24 ° C sob um fotoperíodo de 9 h de luz / 15 h escuro com densidade de fluxo de fótons fotossintéticos de 150 μmol · m ^{− 2} · s ^{− 1} no nível da planta (mistura de 50:50 de lâmpadas fluorescentes de 32 watts de espectro de 3.500 e 5.000 K).
3. Após cerca de 10 dias, transfira as mudas individuais para inserções de bandeja de 36 células contendo mistura de envasamento e cubra com uma cúpula de plástico transparente por 1-2 semanas.
   NOTA: Um experimento típico requer ~ 12-24 plantas saudáveis para cada genótipo / tratamento. Observou-se que as plantas com 6-7 semanas de idade produzem a quantidade ideal de LSW e AWF RNA com o menor risco de contaminação celular.
4. Dependendo da mistura de envasamento usada, regue as plantas a cada 10-15 dias para evitar estresse por seca ou inundação.

3. Coleta de RNA da superfície foliar

1. Método baseado em centrifugação (Leaf Surface Wash; LSW)
   1. Para cada replicação, use plantas de Arabidopsis de 6 a 7 semanas.
   2. Adicione Silwet-L77 (doravante referido como agente umectante) ao VIB estéril a uma concentração final de 0,001% (1 μL em 100 mL de VIB) antes de iniciar o isolamento de LSW.
      NOTA: Silwet-L77 é um agente umectante, que reduz a tensão superficial e permite que o tampão cubra as superfícies das folhas.
   3. Transfira 100 mL de VIB para um frasco de spray de 500 mL.
   4. Separe cuidadosamente as rosetas de Arabidopsis de suas raízes usando uma tesoura fina.
   5. Remova o excesso de sujeira do pecíolo usando uma escova macia.
   6. Coloque as rosetas em uma bandeja plana com a superfície abaxial voltada para cima.
   7. Pulverize a superfície abaxial com VIB + agente umectante usando cinco bombas do borrifador.
   8. Vire as rosetas com cuidado e borrife a superfície adaxial com VIB + agente umectante cinco vezes.
   9. Para recuperar LSW, coloque cuidadosamente as rosetas pulverizadas dentro de seringas sem agulha de 60 mL com orifícios na parte inferior (no máximo duas rosetas de 6 semanas podem caber por seringa) colocadas dentro de frascos de centrífuga de 250 mL. Enrole a seringa com parafilme ao redor do gargalo para suspender a ponta da seringa acima do fundo do frasco (consulte a Figura 1 para referência).
      NOTA: Para obter detalhes sobre como preparar as seringas de 60 mL com orifícios, consulte o protocolo^{publicado anteriormente 11}.
   10. Centrifugar os frascos carregados a 100 g durante 10 min a 4 °C (rotor JA-14).
   11. Filtrar o LSW através de um filtro de seringa de 0,22 μm e recolher o filtrado num tubo de centrifugação de 50 ml colocado sobre gelo.
       NOTA: Normalmente, 12 plantas produziriam cerca de 30 mL de LSW no final usando este protocolo. No entanto, esta é apenas uma estimativa baseada no número de pulverizações realizadas em cada etapa. Este volume é normalmente menor que o volume pulverizado, pois parte do tampão pulverizado é perdida durante o manuseio.
2. Método de swab de superfície foliar (LSS)
   1. Pulverize as rosetas destacadas com VIB + agente umectante conforme descrito na seção anterior (etapas 3.1.1-3.1.7).
   2. Para recuperar o LSS, esfregue as superfícies adaxial e abaxial usando bastões estéreis com ponta de algodão e pressione as pontas embebidas contra a parede interna de um tubo de centrifugação de 15 mL para espremer o líquido.
      NOTA: As amostras de LSS adaxial e abaxial podem ser coletadas em tubos separados com base na configuração experimental e no resultado esperado.
   3. Filtre as amostras de LSS através de um filtro de seringa de 0,22 μm em um tubo de centrifugação de 15 mL colocado em gelo.
      NOTA: Dependendo do número de plantas coletadas, volumes variados de LSS podem ser coletados por experimento.

Figura 1: Ferramentas usadas para lavagem da superfície da folha e isolamento do fluido de lavagem apoplástico. (A) Para coletar LSW e AWF, duas rosetas inteiras de Arabidopsis thaliana são colocadas em uma seringa de 60 mL com oito orifícios adicionais que são derretidos na extremidade da seringa com pinça aquecida para criar canais para a lavagem fluir. (B) Esta seringa sem agulha é então envolvida com parafilme na região do pescoço, conforme ilustrado. (C) Esta etapa permite que a seringa caiba em um frasco de centrífuga de 250 mL sem tocar no fundo do frasco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Coleta de fluido de lavagem apoplástico (AWF)

1. Coloque o mesmo conjunto de plantas usadas para isolamento LSW ou LSS em um béquer e enxágue-as suavemente duas vezes com água destilada.
2. Infiltre as rosetas a vácuo com VIB por 20 s da seguinte forma:
   NOTA: Embora o processo de infiltração a vácuo esteja bem descrito em um protocolo publicado anteriormente¹¹, ele foi reproduzido aqui para tornar o presente protocolo claro.
   1. Coloque cuidadosamente as rosetas em uma cafeteira francesa com 300-500 mL de VIB. Coloque a tampa na prensa francesa e abaixe suavemente o êmbolo até que as plantas estejam totalmente submersas.
   2. Coloque a prensa francesa com plantas e tampão em uma câmara de vácuo. Aplique um vácuo por 20 s usando uma bomba de vácuo. O tampão deve começar a ferver.
   3. Solte o vácuo e remova a prensa francesa da câmara de vácuo, retire a tampa e despeje o VIB em um copo de plástico separado de 500 mL. Retire as rosetas da prensa francesa.
      NOTA: O VIB pode ser reutilizado várias vezes no mesmo dia para um genótipo, mas uma vez usado para infiltração a vácuo, o VIB não deve ser armazenado para uso em outro dia.
   4. Remova o excesso de VIB das plantas agitando suavemente e escovando as folhas em uma toalha de papel.
3. Remova o excesso de tampão das superfícies das folhas com um suave papel mata-borrão.
4. Para coletar o fluido de lavagem apoplástico (AWF), coloque as rosetas dentro de seringas sem agulha de 60 mL colocadas dentro de frascos de centrífuga de 250 mL conforme descrito para coleta de LSW e centrifugue a 4 ° C por 30 min a 600 × g com aceleração lenta.
5. Filtrar o AWF agrupado através de um filtro de seringa de 0,22 μm e recolher o filtrado num tubo de centrífuga de 15 ml colocado sobre gelo.
   NOTA: Normalmente, 12 plantas produziriam cerca de 6 mL de AWF no final usando este protocolo. LSW, AWF e LSS filtrados podem ser usados imediatamente ou armazenados a -80 °C até uso posterior.
6. Registar o peso fresco (FW) das plantas utilizadas para cada réplica após o isolamento do AWF. Posteriormente, use essa leitura para normalizar a quantidade de RNA em cada amostra (Figura 2).

Figura 2: Ilustrações esquemáticas do protocolo e do método de swab da superfície foliar. (A) Ilustração esquemática do protocolo stepwise para o isolamento da lavagem da superfície foliar e do fluido de lavagem apoplástico usando rosetas de Arabidopsis. (B) Ilustração esquemática do método de swab da superfície da folha (LSS) para isolar o RNA da superfície da folha. Figuras adaptadas da Figura S1 e Figura S4 de Borniego et al., 2025⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Precipitação de RNA

1. Precipite o RNA misturando o volume necessário de AWF, LSW ou LSS com 0,1 volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 1,0 volume de isopropanol frio em um tubo de centrifugação de 15 mL.
2. Adicionar glicogénio (20 mg/ml stock) a uma concentração final de 20 μg/ml.
   NOTA: Certifique-se de que os tubos de centrífuga usados para precipitar o RNA possam ser centrifugados a uma alta velocidade de 13,000 × g. A quebra dos tubos nesta etapa pode levar à perda de amostras de RNA.
3. Incubar a mistura a -20 °C durante um mínimo de 1 h ou durante a noite.
4. Centrifugar os tubos a 13.000 × g durante 30 min a 4 °C (rotor JA-25.50).
5. Lave o pellet duas vezes com EtOH 70% gelado e deixe-o secar ao ar por no máximo 10 min.
6. Ressuspenda os pellets em 100 μL de água ultrapura sem DNase / RNase ou VIB e transfira o RNA para tubos de centrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: Após esta etapa, o RNA precipitado pode ser armazenado a -80 °C por até 2 semanas.

6. Isolamento de RNA à base de TRIzol

1. Adicione 1 mL de reagente de TRIzol a cada tubo e misture agitando em um rotador.
   CUIDADO: Para manusear o TRIzol, use-o em um exaustor, use luvas e proteção para os olhos.
2. Coloque os tubos em um rotador de mesa por 10 min em temperatura ambiente (RT).
3. Adicione 200 μL de clorofórmio a cada tubo, seguido por uma etapa de vórtice breve, mas vigorosa.
   CUIDADO: Para manusear clorofórmio, use-o em um exaustor, use luvas e proteção para os olhos.
4. Deixe os tubos em repouso em RT por cerca de 3 min e, em seguida, centrifugue a 13.000 × g por 15 min a 4 °C.
5. Transfira a fase aquosa para tubos de centrífuga de 1,5 mL marcados e adicione 10 μg de glicogênio livre de RNase e um volume de isopropanol frio.
   CUIDADO: Para resíduos de risco biológico gerados (como resíduos de fenol), colete solventes orgânicos em recipientes de resíduos designados de acordo com as diretrizes institucionais.
6. Incubar os tubos durante um máximo de 1 h a -20 °C.
   NOTA: Precipitar o RNA por mais de 1 h nesta etapa reduz a eficiência do isolamento do RNA e leva a uma concentração muito baixa de RNA.
7. Para granular o RNA, centrifugue os tubos a 13.000 × g por 20 min a 4 ° C.
8. Lave os grânulos de RNA duas vezes usando EtOH 70% gelado e deixe-os secar ao ar antes de ressuspender em 10-20 μL de água ultrapura sem DNase/RNase.
9. Armazene o RNA ressuspenso a -20 °C ou -80 °C para armazenamento de curto ou longo prazo, respectivamente.

7. Remoção da contaminação por fenol ou guanidina

1. Para remover a contaminação por fenol ou guanidina das amostras de RNA, execute uma ou duas precipitações em série com 96% de EtOH e acetato de amônio.
2. Adicione 1 μg de glicogênio a 10 μL de amostras de RNA e misture com 0,5 volume de acetato de amônio 7,5 M antes da adição de 2,5 volumes de 96-100% de EtOH.
   NOTA: A concentração final de EtOH deve ser de 70-75% em todo o volume nesta etapa.
3. Incubar a mistura a -80 °C durante 30 min e centrifugar a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C.
4. Lave o pellet de RNA duas vezes com 70% de EtOH e ressuspenda em 10 μL de água ultrapura livre de DNase/RNase.

8. Eletroforese em gel de RNA para quantificação e comparação

1. Prepare o mini gel (7.2 cm x 8.6 cm x 0.75 mm) contendo 10% ou 15% de poliacrilamida e ureia 7 M em 1x EDTA de ácido trisbórico (TBE, pH 8.4) usando solução de acrilamida/bis a 40%, 37.5:1. Alternativamente, um mini gel desnaturante comercial (15% TBE-Urea Gel) pode ser usado para executar as amostras de RNA.
2. Misture amostras de RNA (1: 1) com 2x tampão de carga desnaturante (95% formamida, 10 mM EDTA, 0,02% SDS, 0,02% azul de bromofenol e 0,01% xileno cianol), desnature a 65 ° C por 5 min e coloque imediatamente no gelo.
3. Resolva as amostras de RNA em 0,5x TBE executando tampão em RT a 220 V por aproximadamente 1 h e 15 min.
4. Para padrões de tamanho, use uma mistura 1:1 de ssRNA de baixo alcance e marcadores de escada de ssRNA de 14-30 nt.
5. Manchar o gel com 1x coloração de gel de ácido nucleico SYBR gold em 0,5x TBE por 10 min, lavar duas vezes com água destilada e obter imagens usando um sistema de imagem (Figura 3).
6. Para quantificar o RNA resolvido em cada pista, use o método de análise de gel descrito na documentação do ImageJ sob o subtítulo "Análise de gel": https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
7. Como 100 ng/μL de CL RNA são carregados todas as vezes para comparar o padrão de bandas entre amostras de CL e exRNA, estime a concentração de amostras de exRNA em relação ao CL RNA (Figura 4).

Figura 3: As folhas das plantas são revestidas com RNA diverso. 100 ng de RNA do lisado de células foliares (CL) e 2 μL de RNA isolado de AWF e LSW foram separados em um gel de poliacrilamida desnaturante a 15% e corados com coloração de ácido nucleico SYBR Gold para visualizar e comparar os padrões de bandas de RNA. Os padrões de tamanho de RNA são mostrados na faixa mais à esquerda. As medições de densitometria obtidas usando a análise de gel ImageJ são indicadas na parte inferior de cada pista e indicam a quantidade de RNA em relação ao RNA na faixa total do lisado de células foliares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Extração repetida de RNA LSW. O LSW foi isolado pela primeira vez usando VIB sem Silwet L-77 ou concentrações variáveis de Silwet L-77 (0,001% ou 0,01%). O isolamento repetido de LSW usando o mesmo conjunto de plantas de Arabidopsis pode ser empregado para enriquecer o RNA LSW usando VIB + Silwet L-77 (0,001%). L1, L2 e L3 denotam amostras de RNA isoladas usando LSW coletadas por meio de três rodadas sucessivas de centrifugação pós-pulverização do mesmo conjunto de plantas. O aumento da concentração do agente umectante de 0,001% para 0,01% não melhorou o isolamento do RNA LSW. As medições de densitometria obtidas usando a análise de gel ImageJ são indicadas na parte inferior de cada pista. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Método alternativo para quantificar o RNA usando um método baseado em placas de microtitulação

1. Prepare soluções de RNA padrão usando CL RNA em água ultrapura livre de RNase / DNase. Determine a faixa de concentração apropriada para os padrões com base na concentração prevista das amostras. Use as seguintes concentrações de RNA: 0, 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/μL e prepare um volume suficiente de cada padrão para permitir duas réplicas técnicas.
2. Prepare 1,5x coloração de gel de ácido nucleico SYBR Gold em 500 mM Tris HCl pH = 8.
   NOTA: O SYBR Gold depende do pH e tem uma sensibilidade de coloração ideal entre pH = 7,0 e 8,0.
3. Configuração da microplaca:
   1. Adicione 99 μL de dH₂O a cada poço.
   2. Adicione 1 μL de RNA a cada poço. Use 1 μL para amostras de RNA e padrões de RNA.
   3. Adicione 50 μL de 1,5x SYBR Gold a cada poço.
4. Defina os parâmetros no leitor de microplacas da seguinte forma:
   Agitar - Linear ou orbital: 0:03 (MM: SS)
   Leitura - Ponto final de fluorescência com comprimento de onda de excitação definido em 496 nm e comprimento de onda de emissão definido em 540 nm.
5. Construa uma linha de calibração usando os valores dos padrões. Usando a equação da linha de calibração, calcule as concentrações de RNA nas amostras.
   NOTA: Corantes alternativos podem ser usados para quantificar o RNA em amostras isoladas de TRIzol. Resultados semelhantes foram obtidos com o reagente de quantificação de RNA Ribo488. Um manual detalhado é fornecido pela empresa para este corante. Resumidamente, dilua o corante 1000x (1 a 1000) usando 200 mM Tris pH = 8. Em seguida, para fazer as medições, adicione 99 μL de dH₂O autoclavado a cada poço + 1 μL de RNA (amostra ou padrão) + 100 μL da diluição Ribo488, incube 5 min e quantifique a fluorescência usando um leitor de placas usando excitação de 480 nm e emissão de 520 nm. As curvas padrão obtidas usando os dois corantes de RNA são mostradas na Figura 5.

Figura 5: Curvas padrão obtidas usando um método de quantificação de RNA baseado em placa de microtitulação. Dois corantes de RNA diferentes, SYBR Gold (esquerda) e Ribo488 (direita) produzem resultados consistentes com duas réplicas técnicas por amostra. Qualquer um dos métodos pode ser usado para realizar a quantificação de RNA. No entanto, uma curva padrão deve ser obtida toda vez que o RNA precisar ser quantificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Uma visão geral esquemática do protocolo passo a passo descrito acima para isolar a lavagem da superfície foliar (LSW) e frações de lavagem apoplástica (AWF) de plantas de Arabidopsis é mostrada na Figura 2A. Este método permite a extração de LSW e AWF de apenas três a seis plantas por repetição, ao mesmo tempo em que produz consistentemente quantidades equivalentes de RNA de ambas as frações. Para medir a concentração de RNA em lisados celulares, utilizamos a espectrofotometria NanoDrop. No entanto, para as amostras de RNA derivadas de LSW, LSS e AWF, contamos com a quantificação densitométrica de géis de poliacrilamida corados com ouro SYBR. Esta etapa de quantificação é necessária porque as frações extracelulares contêm um contaminante desconhecido - provavelmente polissacarídeos - que às vezes podem copurificar e interferir nos métodos de quantificação de RNA baseados em absorbância, levando a uma superestimação da concentração de RNA. Para superar essa limitação, planejamos utilizar métodos de purificação de RNA não baseados em fenol em nosso trabalho futuro.

A análise de gel de RNA desnaturante revelou a presença de uma ampla gama de espécies de RNA em LSW e AWF, incluindo RNAs longos e pequenos (Figura 3). Notavelmente, quantidades equivalentes de RNA foram isoladas com sucesso da superfície foliar e das frações apoplásticas, com as quantidades de RNA normalizadas por peso fresco (FW) da planta. Surpreendentemente, os perfis de tamanho de RNA das frações LSW e AWF diferiram significativamente entre si e do perfil do RNA do lisado celular total (CL). Essas diferenças sugerem que as frações de exRNA não estão contaminadas com RNA celular. Dentre as três frações, o RNA apoplástico (AWF) exibiu a maior diversidade na distribuição de tamanho, sugerindo que o RNA apoplástico é mais degradado do que o RNA da superfície foliar.

Para examinar melhor a presença de RNA na superfície das folhas de Arabidopsis, empregamos cotonetes. Este método nos permitiu coletar separadamente e sequencialmente o RNA das superfícies foliares adaxial (superior) e abaxial (inferior)⁶. Essas análises revelaram que ambas as superfícies foliares continham quantidades semelhantes de RNA. Além disso, a capacidade de coletar RNA simplesmente absorvendo tampão da superfície da folha sem a necessidade de centrifugação apóia ainda mais a conclusão de que o RNA está de fato localizado na superfície da folha, em vez de ser extraído pelos estômatos durante a centrifugação.

Um ajuste primário que nos permitiu extrair uma quantidade abundante de RNA da superfície foliar foi a adição do agente umectante. Recuperamos quase duas vezes mais RNA ao adicionar agente umectante (a uma concentração muito baixa de 0,001%) ao VIB. Essa diferença na concentração de RNA obtida com e sem Silwet L-77 indica que o uso de um agente umectante melhora a dissolução do RNA na superfície da folha. No entanto, o aumento da concentração do agente umectante de 0,001% para 0,01% não melhorou o isolamento do RNA LSW (Figura 4). Notavelmente, repetir o isolamento do RNA LSW das mesmas folhas produziu RNA adicional (aproximadamente 63% da recuperação obtida na primeira lavagem), o que sugere que as folhas secretam RNA continuamente na superfície, com quase dois terços dele sendo substituídos dentro dos aproximadamente 30 minutos necessários para processar as folhas. Para aumentar a produção total de RNA LSW quando o material vegetal é limitante, é possível lavar as mesmas folhas várias vezes sucessivamente. No entanto, não recomendamos mais de três lavagens, pois o manuseio envolvido pode levar a danos cumulativos ao material foliar, conforme avaliado pela coloração verde do fluido de lavagem. Para esses experimentos, a concentração de RNA foi estimada usando análise de densitometria baseada em gel de RNA. No entanto, o método de quantificação de RNA baseado em placa de microtitulação descrito acima pode ser usado para quantificação precisa de RNA ao avaliar várias amostras de uma só vez (Figura 5).

Discussão

Este protocolo detalha como isolar a lavagem da superfície da folha (LSW), o swab da superfície da folha (LSS) e o fluido de lavagem apoplástico (AWF) de rosetas saudáveis de Arabidopsis, seguido de extração de RNA. As etapas críticas incluem a preparação e esterilização do VIB antes de realizar o experimento, o cultivo das plantas em condições controladas e o uso de Silwet-L77 para garantir o revestimento adequado da superfície da folha pelo VIB. Esses procedimentos devem produzir quantidades iguais de RNA de LSW e AWF normalizados pelo peso fresco da folha. A recuperação de RNA dessas frações extracelulares requer um manuseio cuidadoso, especialmente no que diz respeito aos pellets de RNA após as etapas de precipitação.

Embora o protocolo acima tenha sido otimizado para folhas de Arabidopsis, também o usamos com sucesso em outras espécies de plantas com apenas pequenas modificações. A extração de RNA da superfície foliar pode ser otimizada implementando dois ajustes primários: primeiro, conduzindo várias rodadas de isolamento LSW e, segundo, aumentando a concentração do agente umectante. Espécies de plantas que possuem superfícies foliares muito hidrofóbicas, como o arroz^12,13, podem exigir concentrações mais altas do agente umectante.

Além disso, descrevemos um método não invasivo para coletar RNA da superfície foliar usando swabs com ponta de algodão. Com este método de isolamento de RNA da superfície foliar, garantimos que o tubo de coleta seja colocado em um balde de gelo. Considerando que o RNA na superfície da folha é secretado e se acumula à temperatura ambiente, assumimos que ele permaneceria estável mesmo durante o processo de coleta. Também comparamos os padrões de bandas do LSW e do LSS RNA, e eles não mostram muita diferença em termos de degradação.

O protocolo acima usa o reagente TRIzol para purificar o RNA de LSW, LSS ou AWF. Este reagente emprega fenol para remover proteínas. Descobrimos, no entanto, que a purificação à base de TRIzol não remove polissacarídeos como a pectina, que são abundantes em LSW e AWF⁶. Essas moléculas copurificadoras podem causar problemas com a quantificação de RNA usando espectrofotometria ou fluorometria. Portanto, contamos com a análise de densitometria baseada em gel de RNA para avaliar as concentrações de exRNA. Atualmente, estamos investigando métodos de purificação baseados em coluna que devem fornecer uma melhor separação de RNA de polissacarídeos. No entanto, esses métodos geralmente limitam a recuperação de pequenos RNAs, pois a membrana de sílica é otimizada para ligar moléculas de RNA maiores que ~ 200 nucleotídeos. Pequenos RNAs podem passar pela membrana durante a ligação ou ser perdidos nas etapas de lavagem. Portanto, até agora, contamos apenas com o método baseado em TRIzol para uma recuperação mais abrangente de todos os tamanhos de RNA, incluindo RNAs pequenos, embora exija manuseio cuidadoso e separação de fases.

Além disso, ao realizar a análise de gel de RNA, não vemos fragmentos menores que 80 nt para amostras de RNA celular total em comparação com RNAs AWF e LSW, principalmente devido à baixa abundância em relação às grandes quantidades de rRNA e tRNA. A presença de bandas menores no AWF e LSW deve-se à degradação dos abundantes rRNAs e tRNAs, que ocorre naturalmente após a secreção de RNA no compartimento extracelular das plantas, e não é um artefato introduzido durante a coleta e manuseio das plantas, conforme confirmado por sequenciamento e análise de northern blot⁶.

Nosso método de isolamento de lavagem da superfície foliar é uma ferramenta versátil com potencial significativo para uma ampla gama de aplicações de pesquisa. Deve permitir o isolamento de biomoléculas da superfície da folha, como RNA, proteínas e outros metabólitos que podem ser centrais para a compreensão das interações entre plantas e micróbios. Se a identificação dos micróbios presentes em AWF e LSW for desejada, isso pode ser feito eliminando a filtração através do filtro de 0,22 μm.

As plantas interagem com uma ampla gama de micróbios, incluindo bactérias, fungos e vírus, que formam comunidades complexas em suas superfícies¹. Essas comunidades microbianas podem ter efeitos profundos no crescimento das plantas, resistência a doenças e aquisição de nutrientes ^2,3,4. Ao isolar e analisar a lavagem da superfície foliar usando esse método, os pesquisadores podem isolar exRNA, metabólitos microbianos, identificar comunidades microbianas presentes na superfície foliar e investigar como essas comunidades são reguladas em nível molecular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Marcador de escada de ssRNA de 14-30 nt	Takara	3416
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	VWR	20170-038
Seringa sem agulha de 10 mL	BD	303347
Tubos de falcão de 15 mL	VWR	89039-668
15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 10 poços/12 poços, 30 µ L/20 e micro; L	Bio-Rad	4566053 / 4566055
Inserções de bandeja de 36 células	Mercado de Folhas Verdadeiras
Solução de acrilamida e bisacrilamida a 40%, 37,5:1	Bio-Rad	1610148
Potes redondos de 4 polegadas	Mercado de Folhas Verdadeiras
Tubos de falcão de 50 mL	VWR	89039-656
Seringa sem agulha de 50 mL	BD	309653
96 bem placa de fundo preto	Grenier	655090
Acrodisc 0.22 μ Filtro de seringa M	Pall	4192
Acrodisc 0.45 μ Filtro de seringa M	Pall	4454
Persulfato de amônio (APS)	Sigma-Aldrich	Resposta 3678
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016
Clorofórmio (sem RNase)	Macron Química Fina	MK444110
Cúpulas de plástico transparente	Hummert Internacional	11 3348	Qualquer cúpula de plástico pode ser usada para cobrir as plantas e manter a umidade
Bastão com ponta de algodão grau médico	Uline	S-21102
Etanol (sem Rnase)	Laboratórios Decon, Inc.	2716GEA
Cafeteira French Press, 24 fl oz	Pico de Neve	CS-111
Bandeja de cultivo sem furos 10 x 20	Mercado de Folhas Verdadeiras
Balde de gelo	Schuett-Biotech, Spongex	3-680 052
Isopropanol	Thermo Científico	149320050
Rotor de ângulo fixo JA-14	Beckman Coulter; modelo: JA-14	339247
Kimwipes	KCWW, Kimberly-Clark	34120
Carga de ssRNA de baixo alcance	NEB	N0364S
Hidrato de MES	Sigma-Aldrich	M8250
Leitor de microplacas	BioTek	Sinergia H1
Milagre-Gro	Milagre-Gro	24-8-16	É um alimento vegetal para todos os fins. Dependendo da fonte de solo usada para cultivar as plantas, a aplicação pode ser ajustada.
Frasco de centifuge Nalgene 250 mL (sem tampa)	Nalgene	3120
Toalhas de papel
ParaFilm  Filme M Lab	Parafilme	S-25929
Copo de plástico (500 mL)	Uline	S-21658
Glicogênio livre de RNase (20 mg/mL)	Thermo Científico	R0561
RootShield Plus WP Fungicida Biológico	BioWorks	68539-9
Tesoura
Silwet L-77	Laboratórios Phytotech	S7777	Qualquer marca Silwet L-77 pode ser usada. No entanto, Silwet perde sua eficácia com o passar do tempo. É ideal substituí-lo uma vez por ano.
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653
Pincel de cabelo de nylon macio	NOS. Fornecimento de arte	Nº 6
Frasco de spray	Uline	S-7272	Qualquer frasco de spray pode ser usado, mas as configurações de spray devem estar no chuveiro.
Mistura de Cultivo Profissional Sungro	Sungro
Mistura de Propagação Sungro	Sungro
Mancha de gel de ácido nucleico SYBR Gold (10.000x concentrado em DMSO)	Thermo Científico	S11494
TEMED	Thermo Científico	17919
Reagente de TRIzol	Invitrogen	15596026
Água ultrapura sem Dnase/Rnase	Invitrogen	10977015
Ureia	Sigma-Aldrich	U5378
Câmara de vácuo, 0,20 pés cúbicos	SP Scienceware - Produtos Bel-Art - Instrumento HB	Rolamento F42031-0000
Bomba de vácuo, 3,5 CFM	Produtos de vácuo ideais	P101532
Balança	Escali	WBB480535	Este é apenas um exemplo. Qualquer balança pode ser usada.