Ex Vivo Análise de molécula única da montagem do receptor de rianodina 2 no tecido cardíaco e neuronal

Resumo

Este estudo apresenta um método de imagem de molécula única baseado em vesículas que preserva a organização do receptor nativo, permitindo a quantificação precisa da estequiometria e amplas aplicações na montagem, função e pesquisa de doenças do receptor.

Resumo

Compreender a montagem do receptor é fundamental para elucidar os mecanismos subjacentes à sua função e regulação em processos fisiológicos. Embora os estudos tradicionais in vitro de molécula única dependam do isolamento de proteínas de sistemas de expressão heterólogos, eles geralmente não conseguem capturar a complexidade fisiológica in vivo envolvida na organização e montagem de proteínas de superfície celular. Este protocolo emprega Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (TIRFM) para estudar moléculas do Receptor de Rianodina 2 (RyR2) marcadas com GFP encapsuladas em vesículas em nanoescala. Essas vesículas, geradas a partir de órgãos rapidamente extraídos do animal, fornecem efetivamente um instantâneo do estado de montagem do receptor no momento da extração, permitindo uma análise detalhada da estequiometria da subunidade e da organização do receptor em resposta a mudanças no ambiente fisiológico do animal. Essa abordagem utiliza TIRFM e análise de fotobranqueamento passo a passo para fornecer uma leitura da estequiometria do receptor. Os receptores de imagem no nível de molécula única facilitam a detecção de heterogeneidade dentro das populações de receptores reunidas em um animal vivo e permitem o monitoramento das mudanças de montagem associadas aos estados de doença. Como resultado, este método oferece uma ferramenta poderosa para determinar a distribuição dos conjuntos de receptores e sua correlação com as mudanças em seu ambiente fisiológico.

Introdução

Os receptores de membrana desempenham papéis cruciais nos processos fisiológicos em todo o corpo humano¹. Uma função primária é mediar a comunicação entre as células por meio da transferência de estímulos extracelulares para iniciar eventos de sinalização intracelular. Devido ao seu papel fundamental na sinalização, quase 70% das terapêuticas existentes têm como alvo os receptores de membrana². Freqüentemente, são estruturas oligoméricas compostas por múltiplas subunidades montadas em formas heteroméricas com múltiplas estequiometrias ^3,4. Compreender como os receptores se organizam em complexos funcionais é fundamental para elucidar seus papéis na saúde e na doença ^5,6. Métodos bioquímicos tradicionais, como imunoprecipitação e western blotting, fornecem medições médias de conjunto, que obscurecem a heterogeneidade nas subpopulações de receptores⁷. Em contraste, as técnicas de molécula única permitem a observação direta de receptores individuais, permitindo a quantificação da heterogeneidade dentro das populações de receptores ^8,9,10. As técnicas de molécula única tornaram-se o padrão para quantificar a montagem do receptor de membrana, estequiometria e oligomerização ^11,12. Essa abordagem tem sido amplamente aplicada a muitos receptores de membrana fisiologicamente relevantes usando condições isoladas de proteína ou cultura de células. Os estudos de molécula única dependem principalmente de sistemas de expressão in vitro, onde as proteínas podem ser isoladas de um ambiente celular. No entanto, a complexidade dentro de um sistema vivo não é totalmente refletida nesses tipos de sistemas de expressão heterólogos.

Para superar essas limitações, desenvolvemos uma abordagem que isola e visualiza receptores de membrana em um estado fisiologicamente relevante, capturando-os dentro de nanovesículas derivadas diretamente de tecidos cardíacos e neuronais. Este método preserva efetivamente o estado de montagem do receptor no momento da formação da vesícula, permitindo a visualização direta da estequiometria da subunidade do receptor, que é um indicador fundamental da resposta do receptor em diferentes ambientes fisiológicos. Essa abordagem nos permite examinar a montagem estequiométrica de receptores de membrana que ocorrem com o complexo ambiente biológico em animais vivos sem exigir expressão ou reconstituição heteróloga. Ao empregar a Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (TIRFM), obtemos imagens de resolução de molécula única de receptores encapsulados em vesículas e extraímos traços de fotobranqueamento para determinar a composição da subunidade.

O TIRFM é adequado para imagens de proteínas de membrana de molécula única porque excita seletivamente fluoróforos dentro de ~ 150 nm da superfície do vidro, reduzindo a fluorescência de fundo das moléculas em solução ^3,10. Esse confinamento aumenta significativamente a relação sinal-ruído, permitindo a detecção precisa de complexos receptores de membrana individuais. Ao analisar o fotobranqueamento passo a passo de receptores marcados com fluorescência, podemos determinar diretamente a estequiometria de subunidades e avaliar a heterogeneidade potencial dentro das populações de receptores¹². Isso é particularmente relevante para o Receptor de Rianodina 2 (RyR2), um grande canal de liberação intracelular de Ca²⁺ que desempenha um papel crucial no acoplamento excitação-contração no coração, onde se monta apenas como um homo-tetrâmero, e na função sináptica no cérebro, onde sua montagem não foi estabelecida ^1,13,14. Dada a presença de múltiplas isoformas de RyR nos tecidos neuronais, ainda não está claro se o RyR2 forma complexos de tetrâmeros puramente homoméricos no cérebro, consistindo em quatro subunidades idênticas às do coração, ou se conjuntos heteroméricos com RyR1 ou RyR3 ocorrem in vivo 15,16,17,18.

Ao isolar vesículas de regiões específicas do coração e do cérebro, esse método permite a investigação de possíveis diferenças específicas do tecido na organização do RyR2. Aproveitamos as propriedades do RyR2 no tecido cardíaco, onde ele só pode formar homotetrâmeros, para fornecer uma base estatisticamente robusta para estequiometria de subunidade de molécula única ex vivo, e a montagem conhecida do tetrâmero serve como um controle para investigar montagens desconhecidas em outros órgãos. A capacidade de obter imagens de receptores em seu estado nativo, preservando suas interações fisiológicas, fornece uma estrutura robusta para estudar a montagem de receptores em diferentes órgãos e sob diferentes condições fisiológicas. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para isolamento de vesículas, imobilização e imagem de molécula única de RyR2 marcado com GFP, permitindo a caracterização precisa da estequiometria do receptor. Essa técnica não apenas avança nossa compreensão da organização do RyR2 nos tecidos cardíacos e neuronais, mas também oferece aplicações mais amplas para estudar a montagem e regulação do receptor em vários contextos fisiológicos e patológicos 19,20,21.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Perfusão transcárdica e extração de órgãos
   1. Anestesiar o mouse usando CO₂ até que a respiração cesse.
   2. Posicione o mouse em decúbito dorsal e prenda os membros.
   3. Faça uma incisão na linha média ao longo do abdômen e estenda lateralmente em direção à caixa torácica para expor a cavidade torácica.
   4. Insira cuidadosamente uma agulha no ventrículo esquerdo e atravesse o átrio direito para permitir a drenagem do perfuso.
   5. Para a preparação da vesícula, perfunda com frio 1x PBS até que o sistema circulatório esteja livre de sangue.
   6. Para criossecção, após a perfusão de PBS, continue a perfusão com paraformaldeído (PFA) a 4% para fixar os tecidos.
   7. Extraia cuidadosamente o coração e coloque-o imediatamente no gelo.
   8. Usando uma tesoura fina, corte cuidadosamente ao longo da linha média do couro cabeludo e retire a pele para expor o crânio.
   9. Faça uma incisão na base do crânio perto do forame magno.
   10. Usando uma pinça fina, abra cuidadosamente o crânio ao longo da fissura longitudinal, removendo fragmentos ósseos para expor o cérebro.
   11. Levante suavemente o cérebro usando uma pinça curva, cortando os nervos cranianos para extraí-lo totalmente intacto.
   12. Se usado para criosecção, pós-fixar o cérebro em PFA a 4% a 4 ° C por 24 h.
   13. Se usado para preparação de vesículas, coloque imediatamente o cérebro no gelo sem fixação para processamento posterior.
2. Crioseccionamento
   1. Remova o cérebro ou o coração do PFA a 4% e seque.
   2. Incorpore todo o órgão no composto OCT dentro de um criomolde.
   3. Congele o tecido embebido colocando o molde em um freezer a -80 °C até solidificar totalmente.
   4. Antes do seccionamento, equilibre a câmara do criostato e a cabeça da amostra a -20 °C.
   5. Transferir o bloco OCT congelado do congelador a -80 °C para a câmara de criostato e deixá-lo equilibrar durante 10 min.
   6. Limpe o mandril de amostra com etanol a 70%, seque-o e aplique uma fina camada de OCT como adesivo.
   7. Prenda o bloco OCT congelado no mandril, garantindo a orientação correta.
   8. Insira o mandril no suporte da amostra do criostato e ajuste a posição da lâmina.
   9. Apare o excesso de OCT até que a superfície do tecido fique exposta.
   10. Corte o tecido com 10 μm de espessura, coletando seções em lâminas de vidro.
   11. Depois de secar as seções ao ar livre em temperatura ambiente por 1 h, aplique o meio de montagem sobre as seções e coloque uma lamínula para selar a amostra.
   12. Deixe a mídia de montagem endurecer antes de armazenar as lâminas a 4 °C para geração de imagens.
3. Preparação de vesículas
   1. Preparação de vesículas cardíacas
      1. Extraia o coração após a perfusão transcárdica com 1x PBS e coloque-o no gelo.
      2. Usando um bisturi estéril, disseque aproximadamente 30 mg de músculo ventricular da parte inferior do coração.
      3. Transfira o tecido para um tubo de centrífuga contendo 4-5 mL de NaHCO₃ 10 mM com NaN₃ 5 mM para manter a integridade da vesícula.
      4. Homogeneizar o tecido usando um homogeneizador até que esteja totalmente lisado.
      5. Centrifugue o homogenato a 10.000 × g por 20 min para remover detritos grandes e coletar o sobrenadante.
      6. Realize a ultracentrifugação a 37.000 × g por 65 min, depois descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3-4 mL de tampão trismaleato 20 mM (pH 6,8) com 0,6 M KCl.
      7. Repita a ultracentrifugação a 37.000 × g por mais 65 min para remover a actomiosina solubibilizada.
      8. Ressuspenda o pellet final em 0,5 mL de tampão trismaleato 20 mM (pH 6,8) com 50 mM KCl para obter a solução de vesícula cardíaca e armazene-a a -80 ° C.
   2. Preparação da vesícula cerebral
      1. Extraia o cérebro após a perfusão transcárdica com 1x PBS e coloque-o no gelo.
      2. Corte o cérebro em seções de 1 mm usando uma matriz coronal de cérebro de camundongo de 1 mm.
      3. Identifique o terceiro e quarto cortes do bulbo olfatório e disseque cuidadosamente: 1) a camada cortical mais externa de ambos os hemisférios; 2) o hipocampo, localizado na região central da seção.
      4. Da extremidade posterior, isole o cerebelo fazendo um corte transversal em sua base.
      5. Agrupe as mesmas regiões cerebrais de cinco camundongos para garantir o rendimento adequado de vesículas.
      6. Homogeneizar o tecido imediatamente usando um homogeneizador Dounce em 2 mL de tampão de homogeneização a frio (0,32 M de sacarose, 10 mM HEPES, 2 mM de EDTA, inibidor de protease, pH 7,4).
      7. Adicione 3 mL de tampão de homogeneização adicional e centrifugue a 200 × g por 15 min para remover grandes fragmentos de tecido.
      8. Recolher o sobrenadante e centrifugar a 1.000 × g durante 15 min a 4 °C para remover a fracção nuclear.
      9. Centrifugue ainda o sobrenadante a 10.000 × g por 20 min a 4 ° C para remover as mitocôndrias.
      10. Ultracentrifugar o sobrenadante resultante a 100.000 × g durante 2 h a 4 °C para sedimentar as vesículas.
      11. Ressuspenda o sedimento final da vesícula em 1x PBS para obter a solução da vesícula cerebral e armazene-o a -80 °C.
4. Caracterização de nanovesículas via Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA)
   1. Monte a célula de detecção seguindo as instruções do fabricante.
   2. Ligue o instrumento e inicie o software compatível.
   3. Carregue uma seringa de 1 mL com água deionizada (DI) e lave manualmente a tubulação do sistema até que o fundo esteja livre de contaminantes.
   4. Prepare a amostra de nanovesícula diluindo-a em 1x PBS.
   5. Carregue ~ 1 mL da amostra de nanovesícula diluída em uma seringa limpa de 1 mL, garantindo que não haja bolhas de ar.
   6. Injete manualmente a amostra na célula de detecção e ajuste o foco até que as vesículas fiquem claramente visíveis.
   7. Prenda a seringa na bomba da seringa e ajuste a vazão para 200 μL/s no painel de hardware.
   8. No painel SOP , defina a duração da medição para 60 s, o número de ciclos para 5 e confirme se o controle de temperatura está habilitado e definido para 25 °C. Salve as configurações como um novo SOP clicando em Salvar SOP e nomeando o arquivo apropriadamente (por exemplo, "nanovesicle_standard.sop").
   9. No painel Capturar, defina as configurações do instrumento selecionando um nível de câmera de 13 e um limite de detecção inicial de 3.
   10. Clique em Executar e selecione o SOP salvo anteriormente. O software realizará automaticamente a medição de acordo com as configurações.
   11. Depois de concluído, clique em Analisar para processar cada vídeo. Ajuste o limite de detecção para garantir que todas as partículas estejam claramente visíveis e clique em Concluir após a conclusão da análise em lote. Exporte o resultado clicando em Exportar dados | Todas as medições e salve como um arquivo CSV para uso posterior.
   12. Depois de concluir o experimento, lave o sistema com ~ 2 mL de água DI até que não haja vesículas residuais.
   13. Injete ar através da tubulação para remover qualquer líquido restante, garantindo que o sistema esteja seco para o próximo uso.

2. Exames de imagem

1. Imagem confocal de criossecções de tecidos
   1. Ligue o microscópio confocal de varredura a laser e abra o software vinculado.
   2. Selecione a objetiva apropriada (20x ar ou 60x óleo) e carregue a lâmina de criossecção preparada no microscópio stage.
   3. Defina as configurações do laser para excitação GFP usando uma linha de laser de 488 nm com um filtro de emissão de 535/70 nm.
   4. Otimize os parâmetros de imagem, incluindo tamanho do orifício (28,9 μm), intensidade do laser (17%) e ganho do detector (15,3), para melhorar a relação sinal-ruído e minimizar o fotobranqueamento.
   5. Se necessário, adquira uma pilha Z definindo os planos focais superior e inferior e definindo o tamanho de passo apropriado (0,275 μm).
   6. Ative a costura automatizada de imagens com uma sobreposição de imagem de 15% ao adquirir imagens de grande área.
   7. Ajuste a resolução da imagem e aplique a média de quadros, se necessário, para reduzir o ruído de fundo.
   8. Capture imagens e salve-as no formato '.nd2' para análise posterior.
2. Imagem de fluorescência de reflexão interna total (TIRF)
   1. Imobilização de vesículas via método de ancoragem biocompatível para membrana (BAM)²²
      1. Limpar a loiça com fundo de vidro de 35 mm, sonicando-a em NaOH a 5 M durante 1 h a 45 °C, seguida de três enxaguamentos completos com água DI.
      2. Sonicar a loiça em HCl 0,1 M durante mais 1 h a 45 °C, seguida de três enxaguamentos adicionais com água DI.
      3. Trate a superfície de vidro limpa com 2% de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) em etanol por 30 min em temperatura ambiente para introduzir grupos funcionais de amina.
      4. Enxágue o prato 3x com água DI e etanol para remover o excesso de APTES e deixe secar.
      5. Incubar a placa com 100 μM de Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) em 1x PBS durante 10 min.
      6. Lave o prato com PBS para remover o reagente que não reagiu.
      7. Introduzir vesículas na concentração desejada e incubar durante 15 min para permitir a ligação das vesículas.
      8. Enxágue o prato suavemente com PBS para remover as vesículas não ligadas, garantindo que as vesículas imobilizadas permaneçam presas.
   2. Configuração e aquisição de imagens TIRF
      1. Ligue o microscópio de fluorescência invertida, a fonte de laser de 488 nm e a câmera EMCCD.
      2. Inicie o software Metamorph e CellSens para inicializar o controle de imagem.
      3. Limpe a objetiva de imersão em óleo 60x (1.49 NA APO) com metanol para remover poeira e óleo residual.
      4. Aplique uma pequena gota de óleo de imersão correspondente ao índice de refração (RI) na lente objetiva.
      5. Coloque a placa de vesícula preparada na platina do microscópio, certificando-se de que esteja centralizada para um alinhamento ideal.
      6. Ajuste o foco do feixe de laser centralizando o feixe de excitação no meio da abertura traseira da objetiva no modo de epifluorescência.
      7. Use o motor de passo para ajustar o ângulo de incidência do laser até que o ângulo crítico seja alcançado, garantindo total reflexão interna na superfície do vidro.
      8. Identifique o plano focal através do eixo Z, distinguindo: 1) o primeiro plano de foco, correspondente à superfície do fundo de vidro; 2) o segundo plano de foco, correspondente à superfície imobilizada pela vesícula.
      9. Quando as vesículas estiverem em foco, aplique o foco automático no CellSens para travar a posição da objetiva neste plano, evitando desvios durante a imagem.
      10. Desligue temporariamente o laser e mova a platina do microscópio para um novo campo de view que ainda não tenha sido exposto à luz de excitação.
      11. Comece a gravar ligando simultaneamente o laser, garantindo a captura de todo o processo de fotobranqueamento sem exposição prévia.
      12. Adquira imagens com os seguintes parâmetros: Tempo de exposição: 100 ms por fotograma, Modo de aquisição: 900 fotogramas contínuos por campo de visão, Definição de ganho: 1.400.
      13. Repita o processo para vários campos de exibição para garantir uma coleta de dados suficiente.
      14. Salve pilhas de imagens no formato TIFF para processamento posterior.

3. Processamento de imagem e análise de dados

1. Processamento de imagem confocal
   1. Abra as imagens confocais adquiridas no software vinculado.
   2. Ajuste as configurações da tabela de pesquisa (LUT) para otimizar o brilho e o contraste.
   3. Aplique os mesmos ajustes de LUT uniformemente em todas as imagens para manter a consistência visual.
2. Processamento de vídeo TIRF e análise de intensidade de fluorescência
   1. Processamento de vídeo para visualização
      1. Abra as pilhas de imagens TIRF adquiridas (formato TIFF) no ImageJ para visualização.
      2. Ajuste o brilho e o contraste para melhorar a clareza do sinal, garantindo que as vesículas fluorescentes sejam facilmente distinguíveis do fundo.
      3. Exporte imagens ajustadas para apresentação ou análise qualitativa adicional.
   2. Análise da etapa de fotobranqueamento
      1. Extraindo traços de tempo
         1. Abra o script MATLAB (consulte o Arquivo Suplementar 1) chamado "getTimeTraces.m" e execute-o. Na interface gráfica do usuário (GUI), clique em Carregar filme e selecione o arquivo de .tiff de imagem TIRF para importar a pilha de filmes de vesículas.
         2. Clique em Localizar picos para identificar automaticamente os sinais de fluorescência de molécula única. As regiões de sinal serão marcadas com círculos na janela de visualização.
         3. Clique em Preencher Dados. Isso exportará o rastreamento de intensidade de tempo para cada ponto em um arquivo .xlsx para análise downstream.
      2. Contagem manual de passos
         1. Execute o script "simpleGraph.m" (consulte Arquivo Suplementar 1) para iniciar a GUI, clique em Carregar Arquivos de Dados e selecione o arquivo .xlsx gerado na etapa 3.2.2.1.3.
         2. Inspecione as etapas de branqueamento de cada traço de tempo exibido no painel esquerdo. Certifique-se de que apenas traços que atendam aos seguintes critérios sejam aceitos para análise: 1) o traço de tempo contém pelo menos uma etapa de branqueamento distinta. 2) A duração de uma etapa é de pelo menos 1 s. 3) A diferença de intensidade entre os níveis de etapa é de pelo menos 3x o desvio padrão da intensidade pós-clareamento.
         3. À direita, localize o campo Etapa # e use os botões + ou - para inserir o número de etapas de fotobranqueamento para cada traço.
         4. Depois de concluir cada entrada, clique em Avançar para ir para o rastreamento a seguir. Depois que todos os rastreamentos forem processados, o software gerará e salvará automaticamente um arquivo .txt registrando a contagem de passos de cada rastreamento.
      3. Resumo da contagem de passos
         1. Execute o script "CombinedFiles.m" (consulte o Arquivo Suplementar 1) para abrir a GUI.
         2. Digite o nome desejado para a saída de resumo na caixa de texto.
         3. Clique em Combinar vários resultados do simpleGraph em um arquivo. No navegador de arquivos, selecione um ou mais arquivos de .txt desejados gerados na etapa 3.2.2.2.3. O script compilará automaticamente todos os dados de contagem de passos e gerará um arquivo .xlsx combinado resumindo a frequência de 1 passo, 2 passos,... Traços.

Resultados

Para confirmar a aplicabilidade desse método, primeiro verificamos a expressão e localização de GFP-RyR2 por imagem confocal de criossecções de tecido cardíaco e neuronal (Figura 1). O sinal de fluorescência no tecido cardíaco exibiu um padrão estriado transversal consistente com a localização esperada de RyR2 em cardiomiócitos, mas exibiu alta intensidade em certas regiões do cérebro, ou seja, córtex, hipocampo e cerebelo, indicando expressão específica da r...

Discussão

Este estudo estabelece um protocolo detalhado e reprodutível para encapsulamento ex vivo e imagem de molécula única de receptores de membrana usando RyR2 marcado com GFP como sistema modelo. O protocolo avança significativamente os métodos atuais, permitindo a análise estequiométrica de complexos receptores diretamente do tecido nativo, preservando o contexto fisiológico das proteínas de membrana. Em comparação com os sistemas tradicionais de expressão in vitro, essa abordagem m...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Prato de 35 mm | Nº 1.5 Lamínula | Diâmetro do Vidro de 14 mm	Mattek	P35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Moldes/Adaptadores Criomold Tissue-Tek Fisher	Scientific	NC9542860
APTES	Millipore Sigma	440140-100ML(	3-Aminopropil)trietoxissilano
Bio-Gen PRO200 Homogeneizador de Laboratório	Pro Scientific	1204B59
cellSENS	Olympus Scientific Solutions	n/a
Câmera EMCCD	Andor	n/a	iXon Ultra 897
Etanol absoluto ≥ 100% (v/v) USP para biologia molecular (200 provas)	VWR	71006-012
Leica CM1860	Leica	n/a	criostato
MetaMorph Advanced	Molecular Devices	n/a
Nanosight NS300 (com software Nanosight NTA)	Malvern Panalytical	n/a
Nikon AXR Microscópio Confocal Invertido	Nikon	n/a
Microscópio de fluorescência invertida motorizado com foco automático Olympus IX83	Olympus	n/a	TIRFM
Paraformaldeído 4% em PBS reagente fixador pronto para uso	VWR	76221-378
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 20x, grau ultrapuro	VWR	97062-950
hidróxido de sódio, contas, grau de reagente	VWR	97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +	NOF America Corporation	n/a	Oleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Composto Tecel-Tek O.C.T. Sakura		M71484
VectaMount AQ Meio de Montagem Aquosa	Vector Laboratories	H-5501-60