Este protocolo descreve o método CTAB para extrair DNA de alta qualidade de micobactérias, superando desafios causados por suas paredes celulares resistentes e ricas em ácido micólico. O processo envolve digestão enzimática, lise celular com CTAB e purificação do DNA por meio de extração orgânica e precipitação de etanol. Esse método produz DNA adequado para estudos moleculares e é confiável para pesquisas micobacterianas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Extração de Ácido Desoxirribonucleico de Genoma Integral de Espécies de Mycobacterium via Técnica de Brometo de Cetiltrimetilamônio
Neste artigo
Resumo
Resumo
A extração eficiente e confiável de DNA é um passo fundamental na biologia molecular, fornecendo material genético de alta qualidade para aplicações posteriores, como PCR, sequenciamento e análises genômicas. No entanto, a composição única da parede celular das micobactérias, ricas em lipídios e ácidos micólicos, apresenta desafios significativos para o isolamento eficiente do DNA. O método do brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) é amplamente utilizado devido à sua eficiência na extração de DNA de alta pureza de espécies micobacterianas, incluindo cepas de crescimento rápido e lento. A técnica envolve a perturbação enzimática das células bacterianas usando lisozima e proteinase K, seguida pela lise dos componentes celulares usando CTAB, que se liga seletivamente e forma um complexo com polissacarídeos e proteínas. A purificação e concentração de DNA são alcançadas por extração com solvente orgânico e precipitação de etanol. De acordo com nossos dados, o protocolo CTAB produz altas quantidades de DNA (200 - 1000 ng/μL) com contaminação de alta qualidade e mínima, conforme comprovado pela eletroforese em gel e análise NanoDrop. O DNA extraído de diferentes espécies micobacterianas é de alta pureza e adequado para diversos estudos moleculares. Este estudo demonstra os passos procedimentais do método CTAB, destacando sua utilidade em superar os desafios únicos associados à extração de DNA micobacteriano.
Introdução
Extrair DNA de alta qualidade é uma etapa fundamental na biologia molecular, essencial para aplicações posteriores como PCR, sequenciamento do genoma completo e outros estudos genômicos. Para Mycobacterium, um gênero que inclui tanto espécies patogênicas, como Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), quanto espécies ambientais não patogênicas como Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), a extração de DNA pode ser desafiadora devido às suas paredes celulares espessas, ricas em lipídios ehidrofóbicas 1,2,3
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os resultados representativos foram gerados com a aprovação do comitê de ética REC: BES da Universidade de Stellenbosch (BES-2024-22504). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de suspensão em cultura micobacteriana
NOTA: Dependendo da espécie examinada, esta etapa deve ser realizada em um laboratório de nível de Biossegurança 2 (BSL-2) ou de nível 3 (BSL-3). O tempo de incubação e as condições da cultura também dependem das necessidades de crescimento das espécies micobacterianas devido às su....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Esse protocolo de extração de DNA usando o método CTAB (Figura 1) foi avaliado em várias espécies micobacterianas, como M. tuberculosis, M. abscessus e M. chelonea. O DNA foi extraído e comparado quanto ao rendimento, pureza e integridade do DNA extraído entre as amostras.
A concentração de DNA variou entre as espécies micobacterianas e variou entre 190-600 ng/μL e >1000 ng/μL em alguns casos, indicando .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Resultados representativos demonstram a utilidade do método CTAB na extração de DNA de espécies micobacterianas e no enfrentamento dos desafios associados à extração de DNA desses organismos. Micobactérias são bem conhecidas por suas paredes celulares complexas e ricas emlipídios 2. Os resultados atuais destacam vários aspectos críticos que contribuem para o sucesso dessa técnica, pois ela entrega DNA intacto de alta concentração e alta qualidade, que deve ser ade.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.
Agradecimentos
Os autores expressam sua sincera gratidão à equipe de genômica da TB: Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa e Rob M Warren, por suas contribuições para o desenvolvimento e otimização deste protocolo, bem como pelo apoio inestimável ao longo deste estudo. Esse trabalho e as pessoas envolvidas foram apoiados por bolsas e financiamento do Conselho Sul-Africano de Pesquisa Médica (SAMRC), Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) e Universidade de Stellenbosch (SU). Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise ou preparação do manuscrito.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pontas de pipeta de 1 mL | Qualquer fornecedor | ||
| 10 & micro; Pontas da pipeta em L | Qualquer fornecedor | ||
| Dodecilsulfato de Sódio 10% (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| Tubos de polipropileno de 15 mL | Qualquer fornecedor | ||
| Tubos de 2 ml e tubos de 1,5 ml | Qualquer fornecedor | ||
| 200 & micro; Pontas de pipeta l | Qualquer fornecedor | ||
| 2-PROPANOL, BIOREAGENTE, PARA B MOLECULAR & | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L | Armazene em -20 & deg; C |
| 37° Incubadora C | Qualquer fornecedor | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65&º; Incubadora C | Qualquer fornecedor | ||
| Gel de agarose | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Sistema de documentação em gel UV Bio-Rad, | BioRad | ||
| Centrífuga (para tubos de 15 ml de 50 ml) e Microfuge (para tubos de 2 ml) | Qualquer fornecedor | ||
| CLOROFÓRMIO PARA ANÁLISE EMPARTA ® ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Álcool clorofórmio/isoamílico (24:1) | Em uma exaustor, misture 384 ml de clorofórmio e 16 ml de álcool isoamílico | ||
| Solução CTAB/NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | Dissolva 4,1 g de NaCl em 80 ml de água destilada. Enquanto mexe, adicione 10 g de CTAB. Solução térmica a 65°Deg; Incubadora C. Ajuste o volume para 100 ml com água destilada. Armazene em temperatura ambiente por até 6 meses. |
| Escada de DNA 1 Kb | Thermo Fisher Scientific | ||
| ÁLCOOL ETÍLICO, PURO, 200 PROOF, PARA MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Misture 75 ml de etanol absoluto e 25 ml de água destilada |
| Lisozima (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Reconstitua a lisozima liofilizada (levada à temperatura ambiente) com água destilada para 10 mg/ml |
| Mídia Middlebrook 7H9 | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Siga as diretrizes do fabricante para preparar o meio líquido |
| ENRIQUECIMENTO MIDDLEBROOK OADC 6 x 100 ml F | BD | 212240 | |
| Mídia do Tubo Indicador de Crescimento de Micobactérias (MGIT) | BD | 245122 | |
| Sistema NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pipeta P10 | Qualquer fornecedor | ||
| Pipeta P1000 | Qualquer fornecedor | ||
| Pipeta P200 | Qualquer fornecedor | ||
| Proteinase K, recombuste, PCR grd 2x250mg & nbsp; | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Reconstitua o frasco da Proteinase K liofilizada com água destilada para 10 mg/ml. Congelar alíquotas em tubos de 2 ml a -20 & deg; C |
| Seguro para SYBR | Thermo Fisher Scientific | ||
| Filtro tampão Tris/EDTA (TE) pH 8,0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP ou 382499997 | |
| Vórtice | Qualquer fornecedor |
Referências
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
