Este protocolo descreve o método CTAB para extrair DNA de alta qualidade de micobactérias, superando desafios causados por suas paredes celulares resistentes e ricas em ácido micólico. O processo envolve digestão enzimática, lise celular com CTAB e purificação do DNA por meio de extração orgânica e precipitação de etanol. Esse método produz DNA adequado para estudos moleculares e é confiável para pesquisas micobacterianas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Extração de Ácido Desoxirribonucleico de Genoma Integral de Espécies de Mycobacterium via Técnica de Brometo de Cetiltrimetilamônio
Neste artigo
Resumo
Resumo
A extração eficiente e confiável de DNA é um passo fundamental na biologia molecular, fornecendo material genético de alta qualidade para aplicações posteriores, como PCR, sequenciamento e análises genômicas. No entanto, a composição única da parede celular das micobactérias, ricas em lipídios e ácidos micólicos, apresenta desafios significativos para o isolamento eficiente do DNA. O método do brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) é amplamente utilizado devido à sua eficiência na extração de DNA de alta pureza de espécies micobacterianas, incluindo cepas de crescimento rápido e lento. A técnica envolve a perturbação enzimática das células bacterianas usando lisozima e proteinase K, seguida pela lise dos componentes celulares usando CTAB, que se liga seletivamente e forma um complexo com polissacarídeos e proteínas. A purificação e concentração de DNA são alcançadas por extração com solvente orgânico e precipitação de etanol. De acordo com nossos dados, o protocolo CTAB produz altas quantidades de DNA (200 - 1000 ng/μL) com contaminação de alta qualidade e mínima, conforme comprovado pela eletroforese em gel e análise NanoDrop. O DNA extraído de diferentes espécies micobacterianas é de alta pureza e adequado para diversos estudos moleculares. Este estudo demonstra os passos procedimentais do método CTAB, destacando sua utilidade em superar os desafios únicos associados à extração de DNA micobacteriano.
Introdução
Extrair DNA de alta qualidade é uma etapa fundamental na biologia molecular, essencial para aplicações posteriores como PCR, sequenciamento do genoma completo e outros estudos genômicos. Para Mycobacterium, um gênero que inclui tanto espécies patogênicas, como Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), quanto espécies ambientais não patogênicas como Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), a extração de DNA pode ser desafiadora devido às suas paredes celulares espessas, ricas em lipídios ehidrofóbicas 1,2,3. Essa parede celular resistente exige o uso de métodos especializados de lise para desestabilizar as células e liberar efetivamente o DNA genômico.
O método do brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) provou ser confiável para isolar DNA de alta qualidade de várias espéciesmicobacterianas 4,5. O CTAB, um surfactante catiônico, liga-se a polissacarídeos e outros componentes celulares, facilitando sua remoção durante o processode extração 6. Mesmo com amostras difíceis, o protocolo baseado em CTAB garante o isolamento eficiente de DNA intacto e puro, especialmente quando combinado com lise enzimática, tratamento térmico e extrações com solventesorgânicos 7,8. O método CTAB desempenhou um papel crucial na extração eficiente de DNA de espécies micobacterianas, especificamente para pesquisas envolvendo sequenciamento de genomas completos, metagenômica e diagnóstico molecular, que requerem material de entrada de DNA puro e de altaqualidade 9,10. Comparado a outras técnicas de extração de DNA, como o batimento de contas ou kits comerciais, o protocolo CTAB apresentado aqui oferece uma vantagem distinta na preservação da integridade do DNA, um fator essencial para sequenciamento de leitura longa e aplicações epigenéticas. Embora estudos anteriores tenham relatado rendimentos de DNA menores com CTAB em comparação com métodos de perturbação mecânica, eles também enfatizam sua capacidade de minimizar o cisalhamento do DNA e manter a integridadedo DNA 11,12. Para resolver limitações de pureza e rendimento, o protocolo atual foi otimizado com tempos de incubação reduzidos e maior consistência entre diversos tipos de amostras. Esse aprimoramento foi apoiado por descobertas de Opperman et al., que demonstraram que DNA extraído por CTAB de culturas de Mycobacterium avium tinha concentração e qualidade suficientes para aplicações posteriores, como sequenciamento de rRNA 16S e ensaios de sonda de linha, apoiando ainda mais a aplicação do protocolo CTAB como uma ferramenta versátil e escalável para pesquisa micobacteriana, especialmente em estudos que requerem DNA genômico intacto para análises molecularesavançadas 13. Além disso, o sequenciamento de próxima geração (NGS) geralmente requer de 100 a 1000 ng de DNA genômicode alta qualidade 14 e, no caso do sequenciamento de leitura longa, como o sequenciamento PacBio, requer ≥5 μg de DNA15 de alta qualidade, portanto, quando grandes quantidades de DNA de alta qualidade e intacto são necessárias, o CTAB continua sendo um métodoeficaz 16.
Estabelecer metodologias eficientes, consistentes e eficazes de extração de DNA de microrganismos difíceis de lisar é necessário para garantir reprodutibilidade e confiabilidade em laboratórios, especialmente para identificação de cepas e estudosepidemiológicos 5,7. Este protocolo fornece detalhes para extrair DNA do genoma completo de micobactérias usando o método CTAB. O protocolo atual visa permitir que pesquisadores alcancem resultados consistentes e confiáveis em seus fluxos de trabalho de biologia molecular, abordando as armadilhas e superando os desafios impostos pela distinta parede celularmicobacteriana 17.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os resultados representativos foram gerados com a aprovação do comitê de ética REC: BES da Universidade de Stellenbosch (BES-2024-22504). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de suspensão em cultura micobacteriana
NOTA: Dependendo da espécie examinada, esta etapa deve ser realizada em um laboratório de nível de Biossegurança 2 (BSL-2) ou de nível 3 (BSL-3). O tempo de incubação e as condições da cultura também dependem das necessidades de crescimento das espécies micobacterianas devido às suas taxas de crescimento distintas e características fisiológicas.
- Prepare 5 mL ou 8 mL de cultura bacteriana em meio líquido Middlebrook 7H9 ou meio MGIT, respectivamente, suplementado com OADC e incube a 37 °C pelo período necessário para permitir o crescimento bacteriano. Micobactérias de crescimento lento requerem de 10 a 14 dias, enquanto micobactérias de crescimento rápido levam aproximadamente 2 a 5 dias.
NOTA: Uma suspensão de células micobacterianas pode ser preparada raspando um loop de colônias em água estéril duplamente destilada se a cultura inicial for feita de placas sólidas de ágar (por exemplo, ágar Middlebrook 7H10). - Despeje a cultura líquida em tubos de 15 mL.
- Elimine a cultura por calor a 80 °C por 1 hora em uma incubadora.
- No caso de Mycobacterium tuberculosis ou outras espécies patogênicas que necessitem de BSL-3, transfira as culturas mortas por calor para o laboratório de BSL-2.
2. Digestão da parede celular e extração de DNA
NOTA: Uma vez que a cultura é inativada por calor, os seguintes passos podem ser realizados com segurança em um laboratório de Biossegurança nível 2 (BSL-2). Se o objetivo é extração para sequenciamento de leitura longa ou aplicações alternativas que exigem DNA de alto peso molecular, certifique-se de utilizar pontas de pipeta de grande diâmetro e, nas etapas do vórtice, substitua o vórtice por inversão ou mistura de pipetas.
- Centrifuge o tubo de 15 mL a 3220 x g por 15-30 minutos em temperatura ambiente (RT). Descarte o supernadante transparente (certifique-se de que todo o material seja removido).
- Ressuspenda completamente o pellet de cultura em 300 μL de tampão Tris-EDTA (TE).
- Transfira o pellet ressuspenso para um tubo de 2 mL.
- Adicione 100 μL de lisozima (10 mg/mL) e misture pipetando para cima e para baixo 5 vezes, depois bata suavemente no tubo para garantir uma dispersão uniforme.
- Incube a mistura a 37 °C em uma incubadora rotativa durante a noite (~16 h; tempo de incubação menor pode reduzir a eficiência da lise e, assim, levar a um baixo rendimento de DNA).
- No dia seguinte, prepare uma mistura de 5 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 70 μL de SDS a 10%. Por exemplo, se houver cinco amostras, prepare 350 μL de SDS 10% e 25 μL de Proteinase K. Misture invertendo o tubo para evitar a formação de espuma.
- Adicione 75 μL da mistura a cada amostra.
- Misture por batida e incube a 65 °C por 10 minutos em uma incubadora ou bloco de aquecimento, com mistura intermitente por inversão.
- Adicione 100 μL de 5 M NaCl.
- Adicione 100 μL de solução pré-aquecida de CTAB/NaCl a 65 °C.
NOTA: Aqueça a solução CTAB/NaCl a 65 °C antes de garantir a precisão da pipeteação, considerando a viscosidade da substância em RT. - Misture batendo até que a solução fique leitosa.
- Incube a 65 °C por 10 minutos em incubadora ou bloco de aquecimento, com mistura intermitente por inversão.
- Adicione um volume igual (~ 675 μL) de solução de clorofórmio/isoamílico (24:1) a cada amostra e misture por batida.
NOTA: Realize esta etapa em uma exaustão, pois o clorofórmio é tóxico se inalado e requer manuseio cuidadoso. - Centrifuge as amostras a 12000 x g por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Aspire cuidadosamente 550-600 μL da fase aquosa (superior) em tubos estéreis de 1,5 mL e os rotule adequadamente.
NOTA: Cuidado para não mexer nas outras camadas. Se alguma camada for inadvertidamente interrompida, centrifuge o tubo novamente.
3. Precipitação e elução do DNA
- Adicione um volume igual (550-600 μL) de isopropanol gelado e misture invertendo os tubos.
NOTA: Se a concentração de DNA for alta, pode se formar precipitação branca durante a mistura. - Incube os tubos a -20 °C por 30 minutos a 1 hora.
NOTA: Tempos de incubação mais longos podem aumentar a precipitação de DNA18 , mas também podem levar à coprecipitação de sais. Assim, a incubação durante a noite pode ser realizada se se esperar uma baixa concentração de DNA. - Centrifuge na maior velocidade (~21130 x g) por 30 minutos em temperatura ambiente para pelletar o DNA insolúvel.
NOTA: Certifique-se de que a frente dos tubos 1.5 fique voltada para dentro no rotor da centrífuga. Nessa etapa, o DNA precipita na parte inferior e ao longo da parte posterior dos tubos. Isso é importante para evitar perturbar o pellet possivelmente invisível na próxima etapa. Um precipitado ou pellet branco pode ser visível se a concentração de DNA for alta. A ausência de um pellet não indica uma extração falhada; Prossiga com os passos restantes. - Aspire o sobrenadante pela frente do tubo sem perturbar o pellet de DNA ou decantá-lo rapidamente, garantindo que o pellet permaneça intacto.
NOTA: É melhor aspirar o sobrenadante se a cultura inicial for pequena e se esperar uma baixa concentração de DNA. - Adicione 1000 μL de etanol gelado a 75%.
- Misture invertendo os tubos várias vezes.
- Centrifuge a 12000 × g por 30 minutos (na mesma orientação do passo 3).
- Aspire ou decante todo o etanol sem perturbar o pellet.
NOTA: Os passos 5-8 podem ser repetidos se houver coprecipitação salina elevada. - Deixe os tubos secarem ao ar no RT durante a noite ou por pelo menos 30 minutos.
- Adicione 25-50 μL de tampão TE (pH 8) a cada tubo para ressuspender o DNA.
NOTA: O DNA pode ser ressuspenso em tampão Tris (10 mM, pH 8) ou em água sem nuclease se aplicações a jusante forem sensíveis à EDTA. - Deixe o pellet de DNA resuspender durante a noite a 4 °C.
- Armazene a 4 °C por 2-3 dias antes de realizar uma avaliação de controle de qualidade.
- Armazene a -80 °C por muito tempo.
4. Quantificação de DNA e controle de qualidade
NOTA: O controle de qualidade do DNA geralmente é realizado usando um espectrofotômetro de microvolume e eletroforese em gel. Um sistema de quantificação baseado em fluorescência também pode ser usado para quantificar o DNA extraído.
- Método do espectrofotômetro
- Meça a concentração de DNA e determine a qualidade seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: Uma amostra de DNA idealmente tem uma proporção de 260/280 entre 1,7 e 2,0. Um valor de 1,8 geralmente é considerado puro para DNA. Valores abaixo dessa faixa indicam contaminação por proteína residual, guanidina ou outros reagentes que absorvem fortemente em ou próximo a 280 nm. Uma proporção de 260/230 entre 2,0 e 2,2 é o ideal. Se a razão for menor do que o esperado, isso pode indicar a presença de contaminantes que absorvem a 230 nm, como EDTA, fenol e carboidratos. Verifique também os gráficos de absorção obtidos para a amostra.
- Meça a concentração de DNA e determine a qualidade seguindo as instruções do fabricante.
- Eletroforese em gel
- Realize a eletroforese em gelde agarose 19 para avaliar a integridade do DNA e determinar se ocorreu fragmentação ou degradação.
- Para visualizar o DNA no sistema de documentação do gel UV, use um gel de agarose a 1,0% contendo corante seguro para SYBR. Faça o gel funcionar a 80 V por 45 minutos.
NOTA: O objetivo é ter bandas claras, distintas e de alto peso molecular acima da faixa mais alta da escada de DNA. Use um buffer novo de 1× TAE toda vez.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Esse protocolo de extração de DNA usando o método CTAB (Figura 1) foi avaliado em várias espécies micobacterianas, como M. tuberculosis, M. abscessus e M. chelonea. O DNA foi extraído e comparado quanto ao rendimento, pureza e integridade do DNA extraído entre as amostras.
A concentração de DNA variou entre as espécies micobacterianas e variou entre 190-600 ng/μL e >1000 ng/μL em alguns casos, indicando ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Resultados representativos demonstram a utilidade do método CTAB na extração de DNA de espécies micobacterianas e no enfrentamento dos desafios associados à extração de DNA desses organismos. Micobactérias são bem conhecidas por suas paredes celulares complexas e ricas emlipídios 2. Os resultados atuais destacam vários aspectos críticos que contribuem para o sucesso dessa técnica, pois ela entrega DNA intacto de alta concentração e alta qualidade, que deve ser ade...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.
Agradecimentos
Os autores expressam sua sincera gratidão à equipe de genômica da TB: Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa e Rob M Warren, por suas contribuições para o desenvolvimento e otimização deste protocolo, bem como pelo apoio inestimável ao longo deste estudo. Esse trabalho e as pessoas envolvidas foram apoiados por bolsas e financiamento do Conselho Sul-Africano de Pesquisa Médica (SAMRC), Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) e Universidade de Stellenbosch (SU). Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise ou preparação do manuscrito.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pontas de pipeta de 1 mL | Qualquer fornecedor | ||
| 10 & micro; Pontas da pipeta em L | Qualquer fornecedor | ||
| Dodecilsulfato de Sódio 10% (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| Tubos de polipropileno de 15 mL | Qualquer fornecedor | ||
| Tubos de 2 ml e tubos de 1,5 ml | Qualquer fornecedor | ||
| 200 & micro; Pontas de pipeta l | Qualquer fornecedor | ||
| 2-PROPANOL, BIOREAGENTE, PARA B MOLECULAR & | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L | Armazene em -20 & deg; C |
| 37° Incubadora C | Qualquer fornecedor | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65&º; Incubadora C | Qualquer fornecedor | ||
| Gel de agarose | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Sistema de documentação em gel UV Bio-Rad, | BioRad | ||
| Centrífuga (para tubos de 15 ml de 50 ml) e Microfuge (para tubos de 2 ml) | Qualquer fornecedor | ||
| CLOROFÓRMIO PARA ANÁLISE EMPARTA ® ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Álcool clorofórmio/isoamílico (24:1) | Em uma exaustor, misture 384 ml de clorofórmio e 16 ml de álcool isoamílico | ||
| Solução CTAB/NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | Dissolva 4,1 g de NaCl em 80 ml de água destilada. Enquanto mexe, adicione 10 g de CTAB. Solução térmica a 65°Deg; Incubadora C. Ajuste o volume para 100 ml com água destilada. Armazene em temperatura ambiente por até 6 meses. |
| Escada de DNA 1 Kb | Thermo Fisher Scientific | ||
| ÁLCOOL ETÍLICO, PURO, 200 PROOF, PARA MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Misture 75 ml de etanol absoluto e 25 ml de água destilada |
| Lisozima (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Reconstitua a lisozima liofilizada (levada à temperatura ambiente) com água destilada para 10 mg/ml |
| Mídia Middlebrook 7H9 | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Siga as diretrizes do fabricante para preparar o meio líquido |
| ENRIQUECIMENTO MIDDLEBROOK OADC 6 x 100 ml F | BD | 212240 | |
| Mídia do Tubo Indicador de Crescimento de Micobactérias (MGIT) | BD | 245122 | |
| Sistema NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pipeta P10 | Qualquer fornecedor | ||
| Pipeta P1000 | Qualquer fornecedor | ||
| Pipeta P200 | Qualquer fornecedor | ||
| Proteinase K, recombuste, PCR grd 2x250mg & nbsp; | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Reconstitua o frasco da Proteinase K liofilizada com água destilada para 10 mg/ml. Congelar alíquotas em tubos de 2 ml a -20 & deg; C |
| Seguro para SYBR | Thermo Fisher Scientific | ||
| Filtro tampão Tris/EDTA (TE) pH 8,0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP ou 382499997 | |
| Vórtice | Qualquer fornecedor |
Referências
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
- Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
- Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
- Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
- Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
- Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
- Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
- Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
- Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
- Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
- Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
- Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
- Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
- Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
- Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
- Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
- Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
- Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
- Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
- Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
