Um sistema de expressão dupla baseado em complementação GFP para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de Drosophila vivas

Summary

Descrevemos um protocolo para medir contatos entre células em camadas epiteliais adjacentes em discos imaginários de asas de Drosophila vivos usando uma abordagem baseada em reconstituição GFP.

Abstract

O crescimento e a padronização do tecido embrionário são amplamente controlados por sinais trocados localmente entre as populações de células dentro dos próprios tecidos. Os citonemas são um tipo de filopódios de sinalização identificados pela primeira vez em Drosophila que conectam e medeiam a troca entre células produtoras e receptoras de sinais. No disco imaginal da asa de Drosophila em desenvolvimento, os citonemas estão envolvidos na troca de sinal entre populações distintas de células dentro do epitélio do disco propriamente dito (DP), que formará a asa adulta, bem como entre células DP e células em tecidos adjacentes associados ao disco. Os citonemas fazem sinapse com as células-alvo para formar contatos íntimos com a membrana.

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar o contato mediado por citonema entre células DP e células do epitélio da membrana peripodial adjacente (PerM), que é separado das células DP pelo lúmen do disco, usando uma abordagem de reconstituição GFP em discos de asas vivas. Usando os sistemas GAL4-UAS e LexA-LexAop, fragmentos complementares de split-GFP (spGFP1-10, spGFP11), cada um fundido ao domínio transmembrana de CD4, são expressos em ambos os lados do lúmen do disco. A imagem da fluorescência GFP reconstituída em preparações de discos de asa viva por microscopia confocal é então usada para gerar pilhas de imagens a partir das quais a fluorescência GFP reconstituída pode ser localizada e quantificada. Usando este sistema, é possível co-expressar transgenes codificadores de proteínas ou interferência de RNA em células produtoras de citonemas ou células-alvo para avaliar seu efeito nos contatos celulares DP-PerM. Este sistema, facilmente adaptável a outros tecidos, permite assim a identificação de fatores importantes para a formação ou função do citonemo.

Introduction

O desenvolvimento dos tecidos embrionários é controlado por células localizadas em "centros organizadores" que sinalizam para células distantes dentro de um tecido, controlando suas decisões de proliferar (ou seja, crescer e se dividir) ou adotar destinos específicos¹. Essa sinalização não autônoma celular é mediada por ligantes produzidos pela organização de células centrais que formam gradientes de concentração através dos tecidos e provocam respostas dependentes da concentração. Em muitos casos, esses ligantes são entregues ou captados por meio de longos filopódios de sinalização baseados em actina chamados ....

Protocol

O driver nubbin-GAL4 é usado para expressar CD4-spGFP1-10 especificamente na região da bolsa da asa do DP ( Figura 1A ). O driver PerM-LexA²¹ é usado para expressar CD4-spGFP11 especificamente no PerM (Figura 1A). Esses dois sistemas de expressão são independentes um do outro, permitindo a expressão simultânea e específica de diferentes transgenes em DP e PerM (Figura 1B,C).

O esquema genético básico envolve o cruzamento de moscas para gerar larvas do genótipo nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA....

Results

Para testar a utilidade do procedimento GRASP para medir contatos entre células DP e PerM, examinamos discos de asa de quatro genótipos diferentes: discos de controle negativo do tipo selvagem (genótipo: w¹¹¹⁸) que exibirão apenas níveis de fundo de autofluorescência no canal GFP; discos expressando o CD4-spGFP1-10 na camada DP, mas sem o transgene CD4-spGFP11, que mostrará o nível de fluorescência produzido apenas por GFP1-10 (que esperávamos ser insignificante, já que GFP1-10 não deve fluorescer

Discussion

Os citonemas desempenham um papel importante na distribuição dos ligantes, controlando o crescimento e a organização dos tecidos em desenvolvimento. A troca de sinal ocorre onde as pontas dos citonemas fazem contatos íntimos da membrana com seus alvos. Neste protocolo, descrevemos um método simples para analisar contatos mediados por citonemas entre camadas epiteliais no disco da asa usando a técnica GRASP.

A técnica apresentada aqui requer, no mínimo, quatro .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio de dissecção Discovery V12	Zeiss		microscópio de dissecção
Fórceps Dumont #55, dicas de biologia	Ferramentas de Belas Ciências	11255-20	pinça de dissecação
EP-Slik (slik20358)	BDSC	Panneton et al. 2015	estirpe de mosca para expressar Slik
FIJI		Schindelin J. et al. (2012)	software de análise de imagens
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	coloração nuclear de imagem ao vivo
LexAop-CD4-spGFP11	BDSC	93018	Linhagem de mosca
Microscópio confocal LSM 700	Zeiss		microscópio confocal
nub-GAL4	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (BDSC)	86108	Linhagem de mosca
PerM-LexA		Rambaud, Joseph et al., 2025	Linhagem de mosca
Placa de spot de vidro PYREX de 9 depressõesvender	Ciências da Vida da Corning	7220-85	para coletar e lavar larvas
Drosophila de Schneider Medium	ThermoFisher Scientific	21720024	meio de imagem ao vivo
Espaçadores de imagem SecureSeal, 8 poços, 0,12 mm de espessura	Grace Bio-Labs	654008	Espaçador
Kit de elastômero de silicone SYLGARD 184	Silgard	3097358-1004	para fazer placas de dissecação
UAS-CD4-spGFP1-10	BDSC	93017	Linhagem de mosca
Preto Zen	Zeiss		software de aquisição