Descrevemos um protocolo para medir contatos entre células em camadas epiteliais adjacentes em discos imaginários de asas de Drosophila vivos usando uma abordagem baseada em reconstituição GFP.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Um sistema de expressão dupla baseado em complementação GFP para avaliar o contato célula-célula mediado por citonemas em discos imaginais de asas de Drosophila vivas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O crescimento e a padronização do tecido embrionário são amplamente controlados por sinais trocados localmente entre as populações de células dentro dos próprios tecidos. Os citonemas são um tipo de filopódios de sinalização identificados pela primeira vez em Drosophila que conectam e medeiam a troca entre células produtoras e receptoras de sinais. No disco imaginal da asa de Drosophila em desenvolvimento, os citonemas estão envolvidos na troca de sinal entre populações distintas de células dentro do epitélio do disco propriamente dito (DP), que formará a asa adulta, bem como entre células DP e células em tecidos adjacentes associados ao disco. Os citonemas fazem sinapse com as células-alvo para formar contatos íntimos com a membrana.
Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar o contato mediado por citonema entre células DP e células do epitélio da membrana peripodial adjacente (PerM), que é separado das células DP pelo lúmen do disco, usando uma abordagem de reconstituição GFP em discos de asas vivas. Usando os sistemas GAL4-UAS e LexA-LexAop, fragmentos complementares de split-GFP (spGFP1-10, spGFP11), cada um fundido ao domínio transmembrana de CD4, são expressos em ambos os lados do lúmen do disco. A imagem da fluorescência GFP reconstituída em preparações de discos de asa viva por microscopia confocal é então usada para gerar pilhas de imagens a partir das quais a fluorescência GFP reconstituída pode ser localizada e quantificada. Usando este sistema, é possível co-expressar transgenes codificadores de proteínas ou interferência de RNA em células produtoras de citonemas ou células-alvo para avaliar seu efeito nos contatos celulares DP-PerM. Este sistema, facilmente adaptável a outros tecidos, permite assim a identificação de fatores importantes para a formação ou função do citonemo.
Introdução
O desenvolvimento dos tecidos embrionários é controlado por células localizadas em "centros organizadores" que sinalizam para células distantes dentro de um tecido, controlando suas decisões de proliferar (ou seja, crescer e se dividir) ou adotar destinos específicos1. Essa sinalização não autônoma celular é mediada por ligantes produzidos pela organização de células centrais que formam gradientes de concentração através dos tecidos e provocam respostas dependentes da concentração. Em muitos casos, esses ligantes são entregues ou captados por meio de longos filopódios de sinalização baseados em actina chamados citonemas que conectam células que enviam e recebem sinais nos tecidos 2,3. Descobertos pela primeira vezno disco imaginário 4 da asa de Drosophila, os citonemas também foram identificados em mamíferos e outros vertebrados 5,6,7,8,9. Uma melhor compreensão do papel dos citonemas na sinalização não autônoma celular, enquanto em um estágio inicial, é crucial para decifrar como as células se comunicam para se organizar em tecidos e como essas linhas de comunicação são modificadas em várias condições patológicas, incluindo malformações de desenvolvimento e câncer.
Os citonemas podem se estender das células-fonte para entregar ligantes às células-alvo ou das células-alvo para receber ligantes próximos às suas fontes 2,3. Os citonemas fazem contatos íntimos com seus alvos, onde se acredita que formem estruturas semelhantes a sinapses, onde a transferência de ligantes pode ocorrer 3,10,11. Esse contato pode ocorrer entre as pontas dos citonemas fonte e alvo ou entre os citonemas e os corpos celulares3. Embora não seja extensivamente caracterizada, a adesão celular por meio de moléculas de adesão ou por meio de interações receptor-ligante é, em alguns casos, necessária para a ativação adequada de eventos de sinalização a jusante12 , 13 , 14 , tornando este um aspecto importante da biologia do citonema.
Vários estudos aplicaram a técnica "GFP reconstitution across synaptic partners" (GRASP) à análise de contatos de citonemas. Esse método foi desenvolvido para identificar e mapear parceiros sinápticos em sistemas nervosos complexos15. Baseia-se na expressão dos dois fragmentos complementares de split-GFP (spGFP1-10 e spGFP11), cada um fundido à região extracelular de um domínio transmembrana (por exemplo, de CD4), em diferentes populações de células. Se as membranas plasmáticas das células dessas duas populações entrarem em contato direto, isso aproxima os domínios complementares do spGFP, levando à reconstituição da fluorescência do GFP. Essa abordagem tem sido usada em Drosophila para identificar a existência de contatos de citonemos entre células dentro do disco da asa e entre o disco da asa e outros tecidos intimamente opostos 12,16,17,18,19,20,21.
Este artigo descreve a aplicação do GRASP à caracterização de contatos entre duas camadas epiteliais morfologicamente distintas do disco imaginal da asa de Drosophila, o disco propriamente dito (DP) e a membrana peripodial (PerM). Essas camadas epiteliais formam um saco ao redor de um lúmen central, com as células DP colunares pseudoestratificadas localizadas de um lado e as células PerM escamosas do outro, ambas com suas membranas apicais voltadas para dentro em direção ao lúmen (Figura 1A). Há algumas evidências de sinalização translumenal entre as duas camadas 22,23,24,25, e recentemente documentamos a sinalização do DP para controlar a proliferação de células PerM que é mediada por citonemos apicais no DP21. Este protocolo envolve o uso dos sistemas de expressão de transgenes GAL4 / UAS e LexA / LexAop para expressar fragmentos complementares de spGFP fundido a CD4 nas membranas das células DP e PerM. Ele usa fluorescência GFP reconstituída para ler o contato da membrana entre as duas populações de células.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O driver nubbin-GAL4 é usado para expressar CD4-spGFP1-10 especificamente na região da bolsa da asa do DP ( Figura 1A ). O driver PerM-LexA21 é usado para expressar CD4-spGFP11 especificamente no PerM (Figura 1A). Esses dois sistemas de expressão são independentes um do outro, permitindo a expressão simultânea e específica de diferentes transgenes em DP e PerM (Figura 1B,C).
O esquema genético básico envolve o cruzamento de moscas para gerar larvas do genótipo nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Como controle negativo, deixamos de fora o transgene LexAop-CD4-spGFP11 . Outros transgenes (por exemplo, RNA de fita dupla codificador de proteínas) podem ser expressos conforme desejado na camada DP (sob o controle de sequências UAS ) ou no PerM (sob o controle do operador LexA).
Este é um protocolo de imagem ao vivo que não pode ser interrompido. A preparação do material é estimada em ~10 min. As dissecções não devem ser realizadas por mais de 20 minutos de cada vez antes da aquisição de imagens. A imagem leva ~ 30 min e não deve durar mais de ~ 1 h. Para várias condições ou um grande número de amostras, o procedimento deve ser realizado em várias rodadas para garantir os melhores resultados.
1. Preparação do material
- Antes da dissecação, limpe uma pinça, uma placa de depressão de vidro de 9 poços (ou outro recipiente adequado para coletar e limpar larvas) e uma placa de Petri reutilizável revestida de Sylgard (silicone) usada para dissecação com etanol a 70%.
- Prepare as lâminas do microscópio realizando uma lavagem com etanol a 70% e, em seguida, colando um espaçador de imagem na lâmina seca. Corte os poços individuais da tira de 8 poços com uma tesoura e corte ao meio (Figura 2A). Remova o suporte protetor de um lado de cada metade e cole espaçadores na lâmina, ligeiramente espaçados para criar um espaço protegido no meio onde os discos serão colocados (Figura 2B).
NOTA: Em nossa experiência, isso simplifica a montagem da amostra, pois o volume preciso do meio transferido para a lâmina é menos crítico. Qualquer pequeno excesso de volume simplesmente fluirá pela abertura após a aplicação da lamínula. Como imageamos por apenas um tempo relativamente curto (geralmente ~ 1 h), não tivemos problemas com a secagem média. - Descongele o meio de imagem ao vivo (meio Drosophila de Schneider não suplementado armazenado em alíquotas congeladas de 10 mL) e mantenha-o prontamente acessível em um balde de gelo.
- Em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, misture 1,5 mL de meio com 20 μL de 200 μg / mL Hoechst 33342 (concentração final de 2,7 μg / mL). Mantenha o tubo no gelo.
NOTA: Esta forma específica de corante Hoechst é usada porque é altamente permeável à membrana. CUIDADO: Luvas devem ser usadas ao manusear Hoechst 33342. As ferramentas devem ser lavadas após o uso.
2. Dissecção do disco da asa e preparação da corrediça
- Após o cruzamento genético e a criação a 25 ° C, pegue as larvas errantes de terceiro ínstar do tubo e lave-as em meio frio de imagem viva em uma placa de depressão de vidro de 9 poços.
NOTA: Os citonemas são muito frágeis. Nos passos seguintes, deve-se ter o cuidado de manipular os tecidos ao redor dos discos, tentando evitar o contato direto entre os discos e as ferramentas de dissecção. Preparamos três ou quatro larvas de cada vez, pois é inevitável danificar alguns discos, e isso só pode se tornar perceptível durante as etapas de imagem. - Sob o microscópio de dissecação, transfira as larvas para uma gota de meio de imagem ao vivo em uma placa de Petri revestida de silicone e comece a dissecar usando duas pinças de dissecação. Para fazer isso, primeiro segure a cabeça e a parte anterior do corpo com firmeza, beliscando as larvas com um par de pinças a cerca de um terço do comprimento do corpo (do anterior). Usando o segundo par de pinças, aperte o corpo logo posterior à primeira pinça. Em seguida, puxe a parte posterior das larvas para isolar a "metade" anterior.
- Inverta a metade anterior prendendo-a com uma pinça de cada lado da extremidade cortada e empurrando a cabeça com o outro par (como virar uma meia do avesso), para expor as estruturas internas, incluindo discos imaginários, traqueia, glândulas salivares, corpo gorduroso e intestino.
- Remova cuidadosamente as glândulas salivares, o corpo gorduroso e o intestino, tomando cuidado para não perturbar os troncos laterais da traqueia, que devem revestir e proteger os discos das asas.
- Use uma pinça para transferir cuidadosamente as metades anteriores limpas com discos de asa anexados para uma gota de meio de imagem ao vivo limpo com Hoechst, colocado entre os espaçadores em uma lâmina preparada (Figura 2C). Isole os discos das asas do resto dos tecidos, dissecando-os suavemente para longe dos ramos finos da traqueia que se conectam ao disco, usando uma lâmina da pinça de dissecação ou um fio fino de tungstênio preso a um porta-agulha de dissecação. Descarte o resto da carcaça.
- Oriente os discos usando uma lâmina da pinça de dissecação ou agulha de dissecação de fio de tungstênio. Devido à sua forma achatada em forma de lágrima, os discos das asas cairão com o DP ou o PerM voltados para cima. Para este protocolo, oriente todos os discos com o lado PerM para cima.
- Ajuste o volume do meio para preencher o poço inteiramente, um pouco acima do nível do espaçador de imagem, adicionando ou removendo o meio conforme necessário. Remova o suporte protetor da parte superior de cada metade do espaçador de imagem e, em seguida, abaixe cuidadosamente uma lamínula sobre a amostra. Pressione suavemente a lamínula onde ela entra em contato com os espaçadores de imagem (por exemplo, com a extremidade arredondada da pinça de dissecação) para garantir que a lamínula adira ao espaçador.
NOTA: O nível médio deve estar ligeiramente acima da altura do espaçador para evitar a retenção de bolhas de ar, mas não tão alto a ponto de gerar um fluxo significativo quando a lamínula for abaixada.
3. Exames de imagem
- Amostras de imagens à temperatura ambiente usando um microscópio confocal (laser de íons argônio com comprimento de onda de 488 nm para GFP, laser UV com comprimento de onda de 350 nm para Hoechst) equipado com uma lente de imersão em óleo de 40x/1,30 NA e software de microscopia. Adquira pilhas de imagens com tamanho de passo de 1 μm que vão desde logo acima do nível mais alto do PerM (onde a fluorescência de Hoechst diminui) até o lado basal do DP, o que geralmente resulta em mais de 100 imagens por pilha. Adquira pilhas de imagens repetidas para gerar filmes timelapse.
NOTA: Criamos uma imagem de um slide por não mais do que ~ 1-2 h. - Para as configurações do software do microscópio, adquira imagens usando codificação de 8 bits, média de linha de 2, ganho do detector geralmente entre 650 e 750 e faixas de canal separadas para reduzir o sangramento do sinal. Use configurações idênticas de laser e detector para todas as condições, predeterminadas pela realização de testes em cada condição com antecedência.
NOTA: Com ampliação de 40x, nossas imagens têm uma resolução de 5,0386 pixels por μm (tamanho do pixel: 0,1985 x 0,1985 μm2). Em nossa configuração, as configurações ideais do microscópio confocal incluíam a maior intensidade de laser possível (sem danificar o tecido) para capturar o máximo de sinal possível, ao mesmo tempo em que produziam pouca ou nenhuma saturação; e o menor ruído possível, conforme avaliado em controles negativos, obtido pela redução do deslocamento do detector e da velocidade de aquisição (se necessário). Geralmente usamos menos de 5% da potência do laser e da velocidade máxima do cabeçote de varredura ('9' nas configurações do software Zen). Uma única pilha de imagens normalmente leva ~ 1 min 45 s para ser adquirida, e as imagens são tiradas a cada 2-3 min para análises de lapso de tempo.
4. Análise de imagem
- Pilhas de projetos usando a função de projeção de intensidade máxima do pacote de software ImageJ (clique na imagem | Pilhas | Z, selecione Intensidade máxima no menu).
- Nas imagens MIP, determine a área da bolsa da asa com base no padrão de dobramento do disco da asa (usando o canal Hoechst) usando a seleção de polígonos. Use a mesma seleção no canal GFP com a função Clear Outside ( clique em Edit | Limpar fora) para definir cada valor de pixel externo como 0.
- Nas imagens MIP, use o canal Hoechst para limpar as imagens GFP, removendo especificamente quaisquer pontos artefactuais que apareçam em ambos os canais, definindo o valor de pixel em questão como 0 (clique em Seleção de polígono e, em seguida, Editar | limpar).
- Nas imagens MIP limpas, use a função Histograma (clique em Analisar | Histograma | List) para obter e copiar a lista de todos os valores de pixel em uma tabela em uma planilha.
- Defina um valor limite com base na análise do sinal de fundo em controles negativos (e depois verificado em outras amostras; veja a discussão).
- Calcule a porcentagem de superfície positiva para GFP usando a seguinte fórmula:
% GFP-superfície positiva =
× 100 - Normalize os dados no final dividindo cada valor pela média da condição de referência (que é definida como 1).
NOTA: Pixel válido = pixel com um valor ≥ 1, ignorando efetivamente qualquer pixel excluído cujo valor foi definido como 0. Valores de pixel de 0 não ocorrem naturalmente. - Para determinar onde nos discos o sinal GFP reconstituído se localiza, use refatias XZ de pilhas de imagens para observar o eixo apicobasal do epitélio do disco. Execute as refatias em Fiji sem interpolação e aumente a altura da imagem no eixo Z usando a função Escala com interpolação bilinear para melhorar a visibilidade.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para testar a utilidade do procedimento GRASP para medir contatos entre células DP e PerM, examinamos discos de asa de quatro genótipos diferentes: discos de controle negativo do tipo selvagem (genótipo: w1118) que exibirão apenas níveis de fundo de autofluorescência no canal GFP; discos expressando o CD4-spGFP1-10 na camada DP, mas sem o transgene CD4-spGFP11, que mostrará o nível de fluorescência produzido apenas por GFP1-10 (que esperávamos ser insignificante, já que GFP1-10 não deve fluorescer
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os citonemas desempenham um papel importante na distribuição dos ligantes, controlando o crescimento e a organização dos tecidos em desenvolvimento. A troca de sinal ocorre onde as pontas dos citonemas fazem contatos íntimos da membrana com seus alvos. Neste protocolo, descrevemos um método simples para analisar contatos mediados por citonemas entre camadas epiteliais no disco da asa usando a técnica GRASP.
A técnica apresentada aqui requer, no mínimo, quatro ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do CIHR (PJT-162109) para D.H. M.J. recebeu uma bolsa de doutorado da Fundação Institut de Recherches Cliniques de Montréal e do Programa de Biologia Molecular da Universidade de Montreal. Os autores agradecem muito a assistência da plataforma de Microscopia e Imagem do IRCM.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio de dissecção Discovery V12 | Zeiss | microscópio de dissecção | |
| Fórceps Dumont #55, dicas de biologia | Ferramentas de Belas Ciências | 11255-20 | pinça de dissecação |
| EP-Slik (slik20358) | BDSC | Panneton et al. 2015 | estirpe de mosca para expressar Slik |
| FIJI | Schindelin J. et al. (2012) | software de análise de imagens | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | coloração nuclear de imagem ao vivo |
| LexAop-CD4-spGFP11 | BDSC | 93018 | Linhagem de mosca |
| Microscópio confocal LSM 700 | Zeiss | microscópio confocal | |
| nub-GAL4 | Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (BDSC) | 86108 | Linhagem de mosca |
| PerM-LexA | Rambaud, Joseph et al., 2025 | Linhagem de mosca | |
| Placa de spot de vidro PYREX de 9 depressõesvender | Ciências da Vida da Corning | 7220-85 | para coletar e lavar larvas |
| Drosophila de Schneider Medium | ThermoFisher Scientific | 21720024 | meio de imagem ao vivo |
| Espaçadores de imagem SecureSeal, 8 poços, 0,12 mm de espessura | Grace Bio-Labs | 654008 | Espaçador |
| Kit de elastômero de silicone SYLGARD 184 | Silgard | 3097358-1004 | para fazer placas de dissecação |
| UAS-CD4-spGFP1-10 | BDSC | 93017 | Linhagem de mosca |
| Preto Zen | Zeiss | software de aquisição |
Referências
- Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
- Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).
- Daly, C. A., Hall, E. T., Ogden, S. K. Regulatory mechanisms of cytoneme-based morphogen transport. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 119(2022).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of Sonic Hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a Dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. Elife. 10, e61432(2021).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Stanganello, E., et al. Filopodia-based Wnt transport during vertebrate tissue patterning. Nat Commun. 6, 5846(2015).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme signaling provides essential contributions to mammalian tissue patterning. Cell. 187 (2), 276-293.e23 (2024).
- Zhang, C., Brunt, L., Ono, Y., Rogers, S., Scholpp, S. Cytoneme-mediated transport of active Wnt5b-Ror2 complexes in zebrafish. Nature. 625 (7993), 126-133 (2024).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Wood, B. M., et al. Cytonemes with complex geometries and composition extend into invaginations of target cells. J Cell Biol. 220 (5), e202101116(2021).
- Gonzalez-Mendez, L., Seijo-Barandiaran, I., Guerrero, I. Cytoneme-mediated cell-cell contacts for Hedgehog reception. Elife. 6, e24045(2017).
- Du, L., Sohr, A., Li, Y., Roy, S. GPI-anchored FGF directs cytoneme-mediated bidirectional contacts to regulate its tissue-specific dispersion. Nat Commun. 13 (1), 3482(2022).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
- Yang, S., et al. Competitive coordination of the dual roles of the Hedgehog co-receptor in homophilic adhesion and signal reception. Elife. 10, e65770(2021).
- Patel, A., et al. Cytonemes coordinate asymmetric signaling and organization in the Drosophila muscle progenitor niche. Nat Commun. 13 (1), 1185(2022).
- Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium. Elife. 4, e06114(2015).
- Hatori, R., Kornberg, T. B. Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues. Development. 147 (22), dev195974(2020).
- Rambaud, B., et al. Slik sculpts the plasma membrane into cytonemes to control cell-cell communication. EMBO J. 44 (8), 2186-2210 (2025).
- Gibson, M. C., Schubiger, G. Peripodial cells regulate proliferation and patterning of Drosophila imaginal discs. Cell. 103 (2), 343-350 (2000).
- Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs. Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).
- Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. Egfr/Ras pathway mediates interactions between peripodial and disc proper cells in Drosophila wing discs. Development. 130 (20), 4931-4941 (2003).
- Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S. Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology. Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).
- Panneton, V., et al. Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation. J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
