Um Modelo de Rejeição de Enxerto de Rato de Transplante Intestinal com Ileostomia Exteriorizada para Avaliação de Prognóstico Longitudinal

A falência de órgãos é uma condição na qual um ou mais órgãos vitais funcionam de forma subótima e não podem sustentar a saúde. O atraso no atendimento médico é frequentemente fatal ou associado a complicações secundárias, como infecções¹. Para a maioria dos órgãos, a substituição do órgão defeituoso é a única opção viável para uma recuperação prolongada. Desde a descoberta da reaquisição da estaminalidade pelas células somáticas², postulou-se que essas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem permitir a organogênese completa e fornecer uma fonte virtualmente ilimitada de órgãos para substituição. Ao combinar o conhecimento do desenvolvimento embrionário com o controle cuidadoso das pistas de sinalização, o sucesso foi alcançado na geração de múltiplos tecidos na escala dos organoides. Para a geração de órgãos em grande escala, embora um progresso significativo tenha sido feito recentemente em órgãos específicos, como os olhos ^3,4, o alotransplante de doadores humanos continua sendo a abordagem dominante para a maioria dos órgãos vitais.

Entre os órgãos internos, o transplante intestinal continua a apresentar resultados prognósticos insatisfatórios e requer maior refinamento cirúrgico ou intervenção^{medicamentosa 5}. Novas intervenções raramente são testadas diretamente em seres humanos e muitas vezes são avaliadas primeiro em modelos animais de transplante intestinal. O presente artigo detalha um modelo de rato de rejeição de enxerto intestinal para servir como uma plataforma de avaliação para esses potenciais avanços terapêuticos.

Para imitar a sutil incompatibilidade do antígeno leucocitário humano (HLA) observada em humanos, um segmento de íleo compatível com o sexo (macho) isolado de um rato Fischer 344 (F344) foi transplantado para um rato Lewis (LEW), seguido pela administração de doses subótimas do imunossupressor tacrolimus durante a fase aguda para induzir a rejeição do enxerto na fase crônica. Este par doador-receptor compartilha os mesmos loci do complexo principal de histocompatibilidade, mas difere em antígenos menores de histocompatibilidade⁶. Nesse método, uma porção da mucosa enxertada foi exteriorizada como uma ileostomia para permitir o monitoramento visual do prognóstico do transplante e do status de rejeição. Além disso, é apresentado um método complementar baseado em imagens de ileostomia para quantificação do estado de rejeição, validado pelas alterações histológicas correspondentes no enxerto transplantado.

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Pós-Graduação em Medicina da Universidade de Osaka, sob o número de referência 04-018-003 e foram realizados de acordo com as diretrizes da Universidade de Osaka. Foram utilizados ratos Lewis machos receptores (LEW) (pesando 200-250 g, 7-9 semanas de idade) e ratos Fischer 344 (F344) machos doadores (pesando 200-250 g, 10-12 semanas de idade). Antes da cirurgia, a região abdominal foi raspada e esterilizada com etanol a 70%. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cirurgia do doador

1. Jejue o rato doador por 12 h antes da cirurgia.
2. Anestesie o rato doador com isoflurano inalado (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Posicione o rato perpendicularmente ao operador. Defina o estereomicroscópio para ampliação de 5x durante o procedimento. Use seda 5-0 para ligadura.
   NOTA: A taxa de fluxo de isoflurano foi de 1,5 L/min. O isoflurano foi administrado a 2,5% durante a incisão abdominal inicial e mantido a 1,5% durante a cirurgia. A anestesia adequada foi confirmada pela ausência de reflexo do dedo do pé após a pinça do dedo do pé. Se necessário, aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento após a confirmação da anestesia.
3. Faça uma incisão na linha média de 8 cm para abrir a cavidade abdominal. Estenda a incisão superior até o processo xifóide para garantir uma visualização clara da veia porta (VP).
4. Disseque o ligamento de Treitz e gire o intestino delgado 180 graus no sentido horário para reverter a rotação intestinal.
5. Observe as alças vasculares mesentéricas e selecione um local de enxerto bem vascularizado, com aproximadamente 10 cm de comprimento do íleo (Figura 1A1).
6. Dissecar o mesentério distal e ligar a artéria mesentérica superior (AMS) e a veia mesentérica superior (VMS) do íleo distal. Certifique-se de que SMA/SMV sejam cortados da ligadura proximal. A ligadura inadequada pode causar sangramento e comprometer a perfusão do enxerto.
7. Desloque o estômago e o baço cranialmente para expor claramente o PV.
8. Dissecar e ligar a artéria/veia colônica média e a artéria/veia colônica direita, localizadas no lado esquerdo da SMA/SMV.
9. Disseque o mesentério no lado direito da AMS/VMS e ligue o ramo jejunal. Evite ligar muito perto do SMV para evitar dobras (Figura 1A2).
10. Separe suavemente a base da AMS usando um cotonete e ligue o mesentério entre a aorta acima da AMS e o PV. Esta área contém os gânglios linfáticos mesentéricos superiores e numerosos vasos linfáticos.
11. Identificar e ligar a artéria renal direita, localizada no lado direito da aorta (Figura 1A3).
12. Injete solução salina heparinizada (200 U / 2 mL) na veia peniana.
13. Determine o comprimento final do enxerto e ligue o excesso de ramos mesentéricos. Ligue as artérias retas nas extremidades proximal e distal do enxerto.
14. Ligue a aorta abaixo da AMS, depois ligue a aorta acima da AMS e excise a base da AMS junto com um remendo circular da aorta. Corte a veia porta no hilo hepático, garantindo um corte oblíquo para criar uma grande abertura anastomótica.
    1. Prossiga para cortar as alças vasculares proximais e distais e o intestino. Colocar o enxerto extraído em solução salina fria (4 °C) (Figura 1A4).
15. Remover a ligadura aórtica proximal para induzir a exsanguinação e eutanasiar o rato doador (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).

2. Processamento de enxerto

1. Identifique a artéria mesentérica superior (AMS) e a veia porta (VP).
2. Perfundir suavemente o enxerto com 15 mL de solução salina fria através da AMS (Figura 1B1). Confirme se todo o sangue foi substituído e se a cor do enxerto fica pálida ou branca.
3. Lave o lúmen do enxerto intestinal e remova o conteúdo fecal.
4. Mantenha o enxerto imerso em solução salina fresca e fria até o transplante.

3. Cirurgia do receptor

1. Anestesiar o rato receptor com isoflurano inalado (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente). Coloque o rato perpendicular ao operador.
   1. Defina o estereomicroscópio para 5× para procedimentos gerais e para 12,5× durante a anastomose vascular. Use seda 5-0 para ligadura e 8-0 Sutura de polipropileno sintético para anastomose vascular. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia durante a operação.
      NOTA: A taxa de fluxo de isoflurano foi de 1,5 L/min. O isoflurano foi administrado a 2,5% durante a incisão abdominal inicial e reduzido para 1,5% durante a cirurgia. A anestesia foi confirmada pela ausência de reflexo do dedo do pé após uma pinça do dedo do pé. Se necessário, aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento após a confirmação da anestesia.
2. Antes da cirurgia, injete 0,5 mg/kg de tacrolimo por via intramuscular. Faça uma incisão na linha média (~5 cm) e abra a cavidade abdominal.
3. Mova o intestino e o cólon cranialmente e disseque o ligamento de Treitz. Enrole o intestino e o cólon em gaze úmida e coloque-os no corpo do rato.
4. Dissecar o peritônio sobre a veia cava inferior (VCI) e a aorta (Figura 1B2). Identifique e ligue a artéria e a veia gonadal direita. Localize o ureter direito.
5. Gire o rato 90° no sentido anti-horário para que a cabeça fique voltada para a esquerda do operador. Prenda a VCI acima da veia renal direita usando uma pinça vascular Bulldog curva.
6. Incise a parede do IVC com uma tesoura para criar uma abertura oval. Lave com solução salina e coloque uma sutura de permanência na borda caudal da VCI (Figura 1B3-1). Certifique-se de que a abertura da anastomose venosa seja grande (~1 cm) e estique a parede do PV adequadamente na anastomose.
7. Coloque o enxerto no lado esquerdo do rato, posicionando o PV e a AMS próximos à VCI e à aorta. Oriente o íleo distal em direção à cabeça. Enrole o enxerto em gaze fria e úmida e aplique gelo para manter a temperatura baixa.
8. Passe a agulha de sutura de permanência (sutura de polipropileno sintético 8-0) pela borda caudal do VP. Use uma pinça de mosquito para controlar a tensão da sutura.
9. Suturar e amarrar a borda cranial do VP à VCI (VP a VCI). Anastomose a parede posterior da VP (VCI a VP) (Figura 1B3-2). Amarre a sutura de suporte na borda direita do PV. Em seguida, anastomose a parede anterior do PV (VP para VCI).
   1. Antes de completar a anastomose, clampeie o PV do enxerto e injete solução salina heparinizada. Amarre a sutura e solte a pinça IVC (Figura 1B3-3).
      NOTA: O sangramento inicial pode ocorrer na anastomose, mas geralmente é controlado espontaneamente.
10. Prenda a aorta acima da bifurcação da artéria ilíaca com uma braçadeira Bulldog curva.
11. Incisar a parede da aorta. Coloque uma sutura de suporte (sutura de polipropileno sintético 8-0) na borda cranial da aorta e da AMS (~4-5 mm) (Figura 1B4-1). Segure a sutura de estada com uma pinça de mosquito para controlar a tensão.
12. Passe outro 8-0 agulha através da borda caudal da AMS e da aorta. Amarre e inicie a anastomose no lado direito do rato (Figura 1B4-2). Amarre a sutura de suporte.
13. Gire o rato 180° para que a cabeça fique voltada para a direita do operador. Complete a anastomose SMA-aorta no lado esquerdo. Antes da sutura final, clampeie o enxerto PV e injete solução salina heparinizada. Amarre a sutura (Figura 1B4-3).
14. Liberar as pinças aórticas e PV para reperfusão (Figura 1B5). Pode ocorrer sangramento inicial, mas pode ser controlado com uma leve pressão usando um cotonete. A mucosa do enxerto deve ficar rosada em poucos minutos (Figura 1B6).
15. Gire o rato 90° para que a cabeça fique voltada para o lado oposto. Faça duas incisões cutâneas de 8 mm no abdome direito e exteriorize as extremidades proximal e distal do enxerto ileal.
    1. Suturar a pele e enxertar serosa com polidioxanona 5-0 (PDS) (Figura 1B7). Feche a incisão da linha média com PDS 5-0 para completar a cirurgia.
       NOTA: Os ratos pós-operatórios devem ser cuidadosamente monitorados até a recuperação total da consciência. Não retorne à gaiola até que a decúbito esternal seja alcançada.

4. Manejo pós-operatório

1. Para manter o enxerto durante a fase aguda, injetar tacrolimo a 0,5 mg/kg por via intramuscular nos dias pós-operatórios (DPO) 1-13, 20 e 27⁷.
   NOTA: Administre injeções consecutivas em pernas alternadas. Alternativamente, o tacrolimo pode ser administrado por via subcutânea.
2. Injete meloxicam a 0,4 mg/kg por via subcutânea no DPO 1-3.
   NOTA: Os ratos receptores normalmente perdem peso até o DPO 7, com recuperação no DPO 14. Injeções subcutâneas de solução salina podem ser administradas para mitigar a desidratação devido à perda de fluidos da ileostomia. A mortalidade inesperada ocorre em aproximadamente 20% dos casos antes do DPO 7. A sobrevida e a saúde geral são tipicamente estáveis depois disso.

5. Avaliação por imagem do estado de saúde do enxerto intestinal

1. Abra uma imagem da ileostomia no ImageJ. Converta a imagem em uma pilha RGB selecionando Tipo de > de imagem > pilha RGB.
   NOTA: Se a imagem ainda não estiver no formato RGB, primeiro converta-a para Cor RGB usando Tipo de > de Imagem > Cor RGB.
2. Selecione uma região de interesse (ROI) que inclua apenas a área da mucosa visível da ileostomia.
3. Meça a intensidade de cada canal (vermelho, verde e azul) dentro do ROI selecionado.
4. Calcule a pontuação de saúde do enxerto usando a seguinte fórmula:
   Pontuação =
   NOTA: Normalize a pontuação final de modo que: Se a pontuação > 10, atribua um valor de 10; Se Pontuação < 0, atribua um valor de 0.

Imagens representativas dos principais pontos de verificação cirúrgica são mostradas na Figura 1. A taxa de sucesso da reperfusão foi de quase 100% e a taxa de sobrevida pós-operatória foi de 80,0% (20 de 25 cirurgias). Quando os procedimentos foram realizados corretamente e o tacrolimo foi administrado na dosagem e esquema especificados, a ileostomia exteriorizada geralmente tornava-se esbranquiçada - uma indicação de rejeição do enxerto - a partir da terceira semana após a cirurgia (Figura 2A, B). Em contraste, os enxertos singênicos (LEW→LEW), que não provocam uma resposta de rejeição, mantiveram boa saúde a longo prazo (Figura 2B). O monitoramento longitudinal da aparência da ileostomia usando um modelo de regressão tricromática (detalhes sobre o desempenho do treinamento e a saída da regressão são fornecidos no Arquivo Suplementar 1) forneceu informações quantitativas sobre a saúde e o status de rejeição do enxerto (Figura 2A, C). A análise histológica revelou a perda de estruturas epiteliais, como vilosidades e criptas - características-chave para a função e manutenção intestinal - juntamente com o espessamento da submucosa rica em matriz extracelular (MEC) nos dias 28 e 45 pós-operatórios (Figura 3A, B).

Figura 1: Imagens operatórias representativas do transplante intestinal de ratos. (A) Cirurgia do doador. (1) O intestino delgado do rato doador; A região do enxerto pretendida é indicada pelas setas brancas. (2) O enxerto após a dissecção dos ramos mesentéricos. VP: veia porta; VMS: veia mesentérica superior; AMS: artéria mesentérica superior. (3) Dissecção do peritônio ao redor da aorta e da raiz da AMS. A artéria renal direita (ARR) é identificada entre a aorta e a veia cava inferior (VCI). (4) O enxerto antes da extração. As setas indicam as extremidades proximal e distal do segmento intestinal a ser extraído; Linhas pontilhadas pretas marcam os locais de transecção. (B) Preparação da mesa traseira e cirurgia do receptor. (1) O enxerto após a perfusão da AMS com solução salina, evidenciado por sua aparência esbranquiçada. (2) Aorta e VCI do receptor; ovais vermelhos e azuis indicam os locais pretendidos da anastomose. (3-1) O receptor da VCI antes da anastomose, com uma sutura de permanência na borda caudal da abertura da VCI. (3-2) Conclusão da anastomose da parede posterior entre a veia porta (VP) e a VCI. (3-3) Anastomose PV-IVC completa; a VP do enxerto é pinçada e a VCI é aberta. (4-1) Anastomose entre a aorta do receptor e a AMS do doador, com sutura de permanência na borda cranial. (4-2) Conclusão da anastomose da parede esquerda. (4-3) Anastomose completa AMS-aorta. (5) O enxerto antes da reperfusão. (6) O enxerto após reperfusão bem-sucedida. (7) Colocação de ileostomias das extremidades proximal e distal do enxerto, posicionadas à direita da incisão na linha média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Monitoramento baseado em imagens da saúde do enxerto intestinal por meio da avaliação da ileostomia. (A) Esquema mostrando o desenvolvimento de um modelo de regressão linear para calcular os escores do estado de saúde do enxerto com base nas intensidades RGB das imagens de ileostomia. (B) Imagens representativas e escores de estado de saúde calculados da ileostomia durante o cronograma de rejeição. Uma imagem de um enxerto singênico no dia pós-operatório (DPO) 127 é mostrada como referência para a saúde do enxerto a longo prazo. Cada região de ileostomia representa uma área de 1 cm × 1 cm. Barras de escala: 1 mm. (C) Rastreamento de tempo dos escores do estado de saúde para dois enxertos. DPO: dia de pós-operatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise histológica do enxerto intestinal. (A) Imagens de microscopia confocal da distribuição celular e da matriz extracelular (MEC) em crioscortes de 14 μm do enxerto em PODs indicados, com inserções submucosas. (B) Coloração Sirius Red de colágeno em criossecções de 6 μm de enxertos coletados no POD 45. Barras de escala: 100 μm; 20 μm em inserções. Os asteriscos indicam a superfície epitelial intestinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Abundância de macrófagos intestinais homeostáticos S1 como marcador prognóstico da saúde do enxerto. (A) Visualização UMAP de transcriptomas de célula única mostrando o agrupamento de macrófagos intestinais homeostáticos Cx3cr1+, Mrc1+ e Timp2+ (pontas de seta), com base em GSE167460 de dados públicos. (B) A pontuação de identidade baseada em MIKA confirma a forte identidade de macrófagos S1 nessas populações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Métricas de desempenho de treinamento e dados de saída do modelo de regressão tricromática usado para monitoramento longitudinal da aparência da ileostomia. Clique aqui para baixar este arquivo.

Ka.T. é um fundador científico, acionista e recebeu financiamento de pesquisa da StemRIM Inc. Todos os outros autores declaram não ter interesses conflitantes.