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Artigo de método

Um Modelo de Rejeição de Enxerto de Rato de Transplante Intestinal com Ileostomia Exteriorizada para Avaliação de Prognóstico Longitudinal

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DOI:

10.3791/68412

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10 de junho de 2025

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1Department of Pediatric Surgery, Graduation School of Medicine, The University of Osaka, 2Department of Stem Cell Therapy Science, Graduate School of Medicine, The University of Osaka

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um modelo de transplante intestinal baseado em ratos com ileostomia para avaliação temporal da intervenção medicamentosa na rejeição do enxerto.

Resumo

Até o momento, o transplante de órgãos continua sendo o tratamento principal para a falência de órgãos. Entre vários órgãos sólidos, o prognóstico do paciente após o transplante intestinal permanece insatisfatório, principalmente devido à rejeição do enxerto. Esse desafio requer melhorias adicionais nas técnicas cirúrgicas ou no desenvolvimento de novas intervenções farmacológicas pós-cirúrgicas. Este artigo apresenta um modelo de rejeição de enxerto de transplante intestinal em ratos para servir de plataforma para tais investigações. Um segmento do íleo isolado da cepa Fischer 344 (F344) foi aloenxertado a um rato Lewis (LEW), seguido pela administração de tacrolimo em dose e esquema definidos. Uma ileostomia exteriorizada foi construída para permitir o monitoramento longitudinal não invasivo do estado tecidual do aloenxerto. Um modelo de regressão linear tricromática foi treinado usando imagens de ileostomia e usado para construir um esquema de avaliação baseado em imagem capaz de avaliar o estado da ileostomia em uma escala de 0 a 10. A avaliação indicou deterioração da saúde do aloenxerto a partir da terceira semana após o transplante. A análise histológica do aloenxerto confirmou sinais de rejeição crônica a partir do dia 28 do pós-operatório, semelhantes aos observados em pacientes humanos, e validou os resultados da avaliação não invasiva da imagem de ileostomia. Espera-se que o modelo de aloenxerto intestinal e os métodos de avaliação associados apresentados aqui facilitem o desenvolvimento do tratamento para transplante intestinal.

Introdução

A falência de órgãos é uma condição na qual um ou mais órgãos vitais funcionam de forma subótima e não podem sustentar a saúde. O atraso no atendimento médico é frequentemente fatal ou associado a complicações secundárias, como infecções1. Para a maioria dos órgãos, a substituição do órgão defeituoso é a única opção viável para uma recuperação prolongada. Desde a descoberta da reaquisição da estaminalidade pelas células somáticas2, postulou-se que essas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem permitir a organogênese completa e fornecer uma fonte virtualmente ilimitada de órgãos para substituição. Ao combinar o conhecimento do desenvolvimento embrionário com o controle cuidadoso das pistas de sinalização, o sucesso foi alcançado na geração de múltiplos tecidos na escala dos organoides. Para a geração de órgãos em grande escala, embora um progresso significativo tenha sido feito recentemente em órgãos específicos, como os olhos 3,4, o alotransplante de doadores humanos continua sendo a abordagem dominante para a maioria dos órgãos vitais.

Entre os órgãos internos, o transplante intestinal continua a apresentar resultados prognósticos insatisfatórios e requer maior refinamento cirúrgico ou intervençãomedicamentosa 5. Novas intervenções raramente são testadas diretamente em seres humanos e muitas vezes são avaliadas primeiro em modelos animais de transplante intestinal. O presente artigo detalha um modelo de rato de rejeição de enxerto intestinal para servir como uma plataforma de avaliação para esses potenciais avanços terapêuticos.

Para imitar a sutil incompatibilidade do antígeno leucocitário humano (HLA) observada em humanos, um segmento de íleo compatível com o sexo (macho) isolado de um rato Fischer 344 (F344) foi transplantado para um rato Lewis (LEW), seguido pela administração de doses subótimas do imunossupressor tacrolimus durante a fase aguda para induzir a rejeição do enxerto na fase crônica. Este par doador-receptor compartilha os mesmos loci do complexo principal de histocompatibilidade, mas difere em antígenos menores de histocompatibilidade6. Nesse método, uma porção da mucosa enxertada foi exteriorizada como uma ileostomia para permitir o monitoramento visual do prognóstico do transplante e do status de rejeição. Além disso, é apresentado um método complementar baseado em imagens de ileostomia para quantificação do estado de rejeição, validado pelas alterações histológicas correspondentes no enxerto transplantado.

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Pós-Graduação em Medicina da Universidade de Osaka, sob o número de referência 04-018-003 e foram realizados de acordo com as diretrizes da Universidade de Osaka. Foram utilizados ratos Lewis machos receptores (LEW) (pesando 200-250 g, 7-9 semanas de idade) e ratos Fischer 344 (F344) machos doadores (pesando 200-250 g, 10-12 semanas de idade). Antes da cirurgia, a região abdominal foi raspada e esterilizada com etanol a 70%. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cirurgia do doador

  1. Jejue o rato doador por 12 h antes da cirurgia.
  2. Anestesie o rato doador com isoflurano inalado (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Posicione o rato perpendicularmente ao operador. Defina o estereomicroscópio para ampliação de 5x durante o procedimento. Use seda 5-0 para ligadura.
    NOTA: A taxa de fluxo de isoflurano foi de 1,5 L/min. O isoflurano foi administrado a 2,5% durante a incisão abdominal inicial e mantido a 1,5% durante a cirurgia. A anestesia adequada foi confirmada pela ausência de reflexo do dedo do pé após a pinça do dedo do pé. Se necessário, aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento após a confirmação da anestesia.
  3. Faça uma incisão na linha média de 8 cm para abrir a cavidade abdominal. Estenda a incisão superior até o processo xifóide para garantir uma visualização clara da veia porta (VP).
  4. Disseque o ligamento de Treitz e gire o intestino delgado 180 graus no sentido horário para reverter a rotação intestinal.
  5. Observe as alças vasculares mesentéricas e selecione um local de enxerto bem vascularizado, com aproximadamente 10 cm de comprimento do íleo (Figura 1A1).
  6. Dissecar o mesentério distal e ligar a artéria mesentérica superior (AMS) e a veia mesentérica superior (VMS) do íleo distal. Certifique-se de que SMA/SMV sejam cortados da ligadura proximal. A ligadura inadequada pode causar sangramento e comprometer a perfusão do enxerto.
  7. Desloque o estômago e o baço cranialmente para expor claramente o PV.
  8. Dissecar e ligar a artéria/veia colônica média e a artéria/veia colônica direita, localizadas no lado esquerdo da SMA/SMV.
  9. Disseque o mesentério no lado direito da AMS/VMS e ligue o ramo jejunal. Evite ligar muito perto do SMV para evitar dobras (Figura 1A2).
  10. Separe suavemente a base da AMS usando um cotonete e ligue o mesentério entre a aorta acima da AMS e o PV. Esta área contém os gânglios linfáticos mesentéricos superiores e numerosos vasos linfáticos.
  11. Identificar e ligar a artéria renal direita, localizada no lado direito da aorta (Figura 1A3).
  12. Injete solução salina heparinizada (200 U / 2 mL) na veia peniana.
  13. Determine o comprimento final do enxerto e ligue o excesso de ramos mesentéricos. Ligue as artérias retas nas extremidades proximal e distal do enxerto.
  14. Ligue a aorta abaixo da AMS, depois ligue a aorta acima da AMS e excise a base da AMS junto com um remendo circular da aorta. Corte a veia porta no hilo hepático, garantindo um corte oblíquo para criar uma grande abertura anastomótica.
    1. Prossiga para cortar as alças vasculares proximais e distais e o intestino. Colocar o enxerto extraído em solução salina fria (4 °C) (Figura 1A4).
  15. Remover a ligadura aórtica proximal para induzir a exsanguinação e eutanasiar o rato doador (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).

2. Processamento de enxerto

  1. Identifique a artéria mesentérica superior (AMS) e a veia porta (VP).
  2. Perfundir suavemente o enxerto com 15 mL de solução salina fria através da AMS (Figura 1B1). Confirme se todo o sangue foi substituído e se a cor do enxerto fica pálida ou branca.
  3. Lave o lúmen do enxerto intestinal e remova o conteúdo fecal.
  4. Mantenha o enxerto imerso em solução salina fresca e fria até o transplante.

3. Cirurgia do receptor

  1. Anestesiar o rato receptor com isoflurano inalado (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente). Coloque o rato perpendicular ao operador.
    1. Defina o estereomicroscópio para 5× para procedimentos gerais e para 12,5× durante a anastomose vascular. Use seda 5-0 para ligadura e 8-0 Sutura de polipropileno sintético para anastomose vascular. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia durante a operação.
      NOTA: A taxa de fluxo de isoflurano foi de 1,5 L/min. O isoflurano foi administrado a 2,5% durante a incisão abdominal inicial e reduzido para 1,5% durante a cirurgia. A anestesia foi confirmada pela ausência de reflexo do dedo do pé após uma pinça do dedo do pé. Se necessário, aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento após a confirmação da anestesia.
  2. Antes da cirurgia, injete 0,5 mg/kg de tacrolimo por via intramuscular. Faça uma incisão na linha média (~5 cm) e abra a cavidade abdominal.
  3. Mova o intestino e o cólon cranialmente e disseque o ligamento de Treitz. Enrole o intestino e o cólon em gaze úmida e coloque-os no corpo do rato.
  4. Dissecar o peritônio sobre a veia cava inferior (VCI) e a aorta (Figura 1B2). Identifique e ligue a artéria e a veia gonadal direita. Localize o ureter direito.
  5. Gire o rato 90° no sentido anti-horário para que a cabeça fique voltada para a esquerda do operador. Prenda a VCI acima da veia renal direita usando uma pinça vascular Bulldog curva.
  6. Incise a parede do IVC com uma tesoura para criar uma abertura oval. Lave com solução salina e coloque uma sutura de permanência na borda caudal da VCI (Figura 1B3-1). Certifique-se de que a abertura da anastomose venosa seja grande (~1 cm) e estique a parede do PV adequadamente na anastomose.
  7. Coloque o enxerto no lado esquerdo do rato, posicionando o PV e a AMS próximos à VCI e à aorta. Oriente o íleo distal em direção à cabeça. Enrole o enxerto em gaze fria e úmida e aplique gelo para manter a temperatura baixa.
  8. Passe a agulha de sutura de permanência (sutura de polipropileno sintético 8-0) pela borda caudal do VP. Use uma pinça de mosquito para controlar a tensão da sutura.
  9. Suturar e amarrar a borda cranial do VP à VCI (VP a VCI). Anastomose a parede posterior da VP (VCI a VP) (Figura 1B3-2). Amarre a sutura de suporte na borda direita do PV. Em seguida, anastomose a parede anterior do PV (VP para VCI).
    1. Antes de completar a anastomose, clampeie o PV do enxerto e injete solução salina heparinizada. Amarre a sutura e solte a pinça IVC (Figura 1B3-3).
      NOTA: O sangramento inicial pode ocorrer na anastomose, mas geralmente é controlado espontaneamente.
  10. Prenda a aorta acima da bifurcação da artéria ilíaca com uma braçadeira Bulldog curva.
  11. Incisar a parede da aorta. Coloque uma sutura de suporte (sutura de polipropileno sintético 8-0) na borda cranial da aorta e da AMS (~4-5 mm) (Figura 1B4-1). Segure a sutura de estada com uma pinça de mosquito para controlar a tensão.
  12. Passe outro 8-0 agulha através da borda caudal da AMS e da aorta. Amarre e inicie a anastomose no lado direito do rato (Figura 1B4-2). Amarre a sutura de suporte.
  13. Gire o rato 180° para que a cabeça fique voltada para a direita do operador. Complete a anastomose SMA-aorta no lado esquerdo. Antes da sutura final, clampeie o enxerto PV e injete solução salina heparinizada. Amarre a sutura (Figura 1B4-3).
  14. Liberar as pinças aórticas e PV para reperfusão (Figura 1B5). Pode ocorrer sangramento inicial, mas pode ser controlado com uma leve pressão usando um cotonete. A mucosa do enxerto deve ficar rosada em poucos minutos (Figura 1B6).
  15. Gire o rato 90° para que a cabeça fique voltada para o lado oposto. Faça duas incisões cutâneas de 8 mm no abdome direito e exteriorize as extremidades proximal e distal do enxerto ileal.
    1. Suturar a pele e enxertar serosa com polidioxanona 5-0 (PDS) (Figura 1B7). Feche a incisão da linha média com PDS 5-0 para completar a cirurgia.
      NOTA: Os ratos pós-operatórios devem ser cuidadosamente monitorados até a recuperação total da consciência. Não retorne à gaiola até que a decúbito esternal seja alcançada.

4. Manejo pós-operatório

  1. Para manter o enxerto durante a fase aguda, injetar tacrolimo a 0,5 mg/kg por via intramuscular nos dias pós-operatórios (DPO) 1-13, 20 e 277.
    NOTA: Administre injeções consecutivas em pernas alternadas. Alternativamente, o tacrolimo pode ser administrado por via subcutânea.
  2. Injete meloxicam a 0,4 mg/kg por via subcutânea no DPO 1-3.
    NOTA: Os ratos receptores normalmente perdem peso até o DPO 7, com recuperação no DPO 14. Injeções subcutâneas de solução salina podem ser administradas para mitigar a desidratação devido à perda de fluidos da ileostomia. A mortalidade inesperada ocorre em aproximadamente 20% dos casos antes do DPO 7. A sobrevida e a saúde geral são tipicamente estáveis depois disso.

5. Avaliação por imagem do estado de saúde do enxerto intestinal

  1. Abra uma imagem da ileostomia no ImageJ. Converta a imagem em uma pilha RGB selecionando Tipo de > de imagem > pilha RGB.
    NOTA: Se a imagem ainda não estiver no formato RGB, primeiro converta-a para Cor RGB usando Tipo de > de Imagem > Cor RGB.
  2. Selecione uma região de interesse (ROI) que inclua apenas a área da mucosa visível da ileostomia.
  3. Meça a intensidade de cada canal (vermelho, verde e azul) dentro do ROI selecionado.
  4. Calcule a pontuação de saúde do enxerto usando a seguinte fórmula:
    Pontuação = figure-protocol-1
    NOTA: Normalize a pontuação final de modo que: Se a pontuação > 10, atribua um valor de 10; Se Pontuação < 0, atribua um valor de 0.

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Resultados

Imagens representativas dos principais pontos de verificação cirúrgica são mostradas na Figura 1. A taxa de sucesso da reperfusão foi de quase 100% e a taxa de sobrevida pós-operatória foi de 80,0% (20 de 25 cirurgias). Quando os procedimentos foram realizados corretamente e o tacrolimo foi administrado na dosagem e esquema especificados, a ileostomia exteriorizada geralmente tornava-se esbranquiçada - uma indicação de rejeição do enxerto - a partir da terceira semana após a cirurgia (

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Discussão

Embora os estudos em animais sejam essenciais para o desenvolvimento de intervenções cirúrgicas e farmacológicas aprimoradas para melhores resultados de curto e longo prazo do transplante intestinal, tem sido empiricamente difícil estabelecer a técnica de cirurgia de transplante intestinal em ratos. Aqui, os procedimentos cirúrgicos de transplante intestinal heterotópico são descritos em detalhes. Nesse método, os tempos de operação do doador e do receptor foram de aproximadamente 35 min...

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Divulgações

Ka.T. é um fundador científico, acionista e recebeu financiamento de pesquisa da StemRIM Inc. Todos os outros autores declaram não ter interesses conflitantes.

Agradecimentos

O Centro de Pesquisa e Educação Médica da Escola de Pós-Graduação em Medicina da Universidade de Osaka forneceu os instrumentos necessários para a imagem microscópica confocal dos aloenxertos. O trabalho foi apoiado por um fundo de pesquisa da StemRIM para Ka.T..

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5-0 Seda Trançada 40cm Preto Alfresa Pharma62-9965-34
5-0 seda trançada 40cm branco Alfresa Pharma62-9964-99
8-0 PROLENE BV130-5 45cmÍCONEEP8730H
Alexa Fluor 594 cabra anti-rato IgG (H + L)InvitrogenA11005Conc.: 2ug/ml
Alexa Fluor 647 cabra anti-coelho IgG (H + L)InvitrogenA21245Conc.: 2ug/ml
Porta-agulhas Barraquer Micro, mandíbula CVD de 8 mm, 6"
Braçadeira vascular Bulldog 35mmNatsumeC-42-S-2
Fischer 344 (F344)   Japan SLC (Shizuoka, Japão)doador, homem, 10 a 12 semanas de idade
Ratos Lewis (LEW)Japan SLC (Shizuoka, Japão)receptores, homens, 7 a 9 semanas de idade
MicrotesouraYDMCC06C
Pinça de Sutura de Microcirurgia - Curva, Plataformas, Alças Redondas: 15 cm / 6 pol.
Ms mAb em Colágeno IabcamAB90395Concentração de trabalho: diluição de 1000x
SORO FISIOLÓGICO 500 mLOTSUKA Rolamento 3311401A8024
Grampo duplo vascular de plásticoTreinamento em microcirurgia ltda
Prograf injeção 5 mgAstellas PharmaRolamento 3999416A1028
Rb pAb para LamininabcamAB11575Conc.: 2ug/ml
Anestesizante para pequenos animaisKikai MuromachiMK-A100
Microscópio cirúrgico OPMI-1FRCarl ZeissOPMI-1FR
SUTURA, 5/0 18 PDS II CLR MONO P, VAÍCONEZ493G

Referências

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