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Bioimpressão de fatias de tumor de hidrogel como modelo 3D para linfoma de células do manto

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DOI:

10.3791/68417

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12 de setembro de 2025

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1Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology and University of Tuebingen, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute, 3Department of Clinical Pathology, Robert Bosch Hospital, 4Robert Bosch Hospital, 5Departments of Clinical Pharmacology, Pharmacy and Biochemistry, University of Tuebingen, 6iFIT Cluster of Excellence (EXC 2180), Image-guided and Functionally Instructed Tumor Therapies, University of Tuebingen, 7German Cancer Consortium (DKTK) and German Cancer Research Center (DKFZ), Partner Site Tuebingen, 8National Center for Tumor Diseases (NCT), NCT South-West, a partnership between DKFZ, University Hospital Tuebingen, University of Tuebingen, Tuebingen, Bosch Health Campus, Stuttgart, Robert Bosch Hospital, Stuttgart, University Hospital Ulm, and Ulm University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da geração, cultura e análise do linfoma de células do manto em fatias de tumor de hidrogel impressas em 3D.

Resumo

O linfoma de células do manto (LCM) é uma neoplasia rara e agressiva de células B que frequentemente recidiva e mostra apenas uma resposta limitada à quimioterapia convencional. Um grande desafio na pesquisa do LCM é a cultura de células primárias do LCM ex vivo, pois as células tendem a sofrer apoptose espontânea quando cultivadas em cultura de suspensão 2D. Embora os modelos 3D sejam conhecidos por recapitular melhor a situação in vivo dos tumores sólidos, sua aplicação ainda é pouco explorada em linfomas. O desenvolvimento de modelos 3D que replicam as condições in vivo do MCL dentro do linfonodo pode aumentar sua sobrevivência, facilitar o estudo da diafonia do microambiente MCL-tumor e imitar a resposta in vivo ao medicamento. Aqui, um modelo impresso em 3D de MCL na forma de fatias de tumor de hidrogel foi estabelecido, juntamente com um método de cultura otimizado. Um processo padronizado foi desenvolvido usando linhagens celulares MCL ou células MCL primárias, nas quais as células são imersas em um hidrogel contendo alginato, colágeno tipo I e matriz de membrana basal por bioimpressão em um banho de suporte de gelatina. As fatias tumorais de hidrogel MCL resultantes são cultivadas em um suporte de filtro para manter sua estabilidade durante todo o período de cultura. Tratamentos medicamentosos podem ser aplicados ao sistema. A resposta de células individuais dentro da fatia do tumor de hidrogel pode ser rastreada por imagens de fluorescência 3D ao vivo de quatro cores. As células primárias do LCM demonstraram uma viabilidade estável quando cultivadas nas fatias tumorais de hidrogel. Este protocolo fornece uma descrição detalhada da geração, cultura e análise de células MCL em fatias tumorais de hidrogel. Ao imitar de perto o microambiente tumoral e utilizar uma cultura de interface ar-líquido, o modelo apresentado aumenta a relevância fisiológica em comparação com a cultura 2D tradicional. Ele oferece um potencial significativo para o avanço dos estudos biológicos e terapêuticos do MCL.

Introdução

O linfoma de células do manto (LCM) é um linfoma não-Hodgkin de células B raro e agressivo originado da zona do manto dos linfonodos1. A zona do manto é composta por um anel de pequenos linfócitos ao redor do centro germinativo do folículo das células B. Normalmente, o ligamento colateral medial mostra uma evolução clínica agressiva, com recidivas frequentes após a quimioterapia inicial. Devido a uma melhor compreensão da formação da doença1 e ao desenvolvimento de novos tratamentos, incluindo imunoquimioterapia2, inibidores de tirosina quinase de Bruton3 ou conjugados anticorpo-droga4, as opções de tratamento para pacientes com LCM levaram a melhores taxas de resposta e uma sobrevida livre de progressão prolongada. No entanto, a resistência aos medicamentos e as recidivas ainda tornam a doença incurável5. Em parte, isso é consequência de sua heterogeneidade e da influência do microambiente tumoral no desenvolvimento tumoral e na resistência aos medicamentos6. Um desafio no estudo do ligamento colateral medial é a dificuldade de cultivar células primárias do ligamento colateral medial em cultura de suspensão7, pois as células sofrem apoptose espontânea ex vivo 4,5. Isso destaca a necessidade de abordagens alternativas para modelar melhor o MCL em modelos pré-clínicos.

In vivo, os tumores são estruturas tridimensionais (3D) compostas por vários componentes celulares, incluindo células tumorais, células imunes e células estromais, bem como componentes não celulares, como a matriz extracelular (MEC). A MEC, que consiste em macromoléculas como colágeno e laminina, forma uma complexa malha fibrosa de fibras elásticas que é altamente hidrofílica, criando um ambiente semelhante a um gel 2,8,9,10. Para melhor replicar essas condições in vivo de tumores ex vivo, uma variedade de modelos 3D foi desenvolvida. Nos últimos anos, esses modelos tornaram-se cruciais para o estudo da farmacologia e biologia do câncer, com foco principalmente em tumores sólidos11.

Até o momento, esse campo permanece pouco explorado nos linfomas, uma vez que as células cancerígenas hematológicas têm a capacidade de crescer tanto em suspensão quanto em ambientes estromais, como linfonodos, medula óssea ou tecidos linfóides secundários12. In vivo, as células do ligamento colateral medial se disseminam da zona do manto dos linfonodos para o sangue ou a medula óssea, embora proliferem principalmente dentro dos linfonodos de onde se originam13,14. Dentro dos linfonodos, as células MCL são cercadas por células T, macrófagos e células estromais mesenquimais, todas as quais demonstraram controlar a sobrevivência ou a resposta medicamentosa das células MCL 14,15,16,17,18. Além disso, a interferência do microambiente MCL-tumoral, bem como a porosidade e as propriedades mecânicas, são fatores importantes que podem influenciar as respostas e a resistência aos medicamentos 6,14. Assim, modelos tumorais 3D padronizados e reprodutíveis de MCL que simulam o microambiente nativo são necessários para estudar o MCL primário. Até agora, modelos principalmente baseados em células, como esferóides ou organoides de células primárias do MCL, foram estabelecidos 6,19. Eles aumentam com sucesso a viabilidade e a cultura a longo prazo das células primárias do LCM. No entanto, a matriz extracelular está sub-representada nesses modelos. Nesse contexto, a bioimpressão 3D avançada oferece uma abordagem promissora. Ao montar diretamente células vivas e hidrogéis, essa tecnologia permite a geração de modelos de linfonodos 3D baseados em hidrogel fisiologicamente relevantes.

Aqui, um modelo bioimpresso em 3D de MCL na forma de fatias de tumor de hidrogel foi estabelecido, juntamente com um método de cultura otimizado. As células são incorporadas em fatias de hidrogel à base de colágeno tipo I, alginato e Matrigel por incorporação reversível de forma livre de hidrogéis suspensos (FRESH)bioimpressão 20. As fatias do tumor de hidrogel são cultivadas em um suporte de filtro, o que permite que as células do MCL cresçam em um ambiente que recapitula de perto as condições in vivo do linfonodo.

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da geração, cultura e análise de células MCL em fatias tumorais de hidrogel. Ao utilizar imagens de fluorescência 3D ao vivo em quatro cores, a viabilidade ou resposta a medicamentos de células individuais dentro da fatia do tumor de hidrogel pode ser rastreada. As células primárias do LCM demonstraram melhor sobrevida quando cultivadas nas fatias tumorais de hidrogel. Este modelo fornece uma ferramenta para estudar a biologia do MCL e a resposta ao tratamento, abrindo caminho para a compreensão das influências microambientais e da variabilidade do paciente com MCL.

Protocolo

O trabalho com células primárias do ligamento colateral medial deve ser aprovado pelo comitê de ética local. Neste estudo, o comitê de ética da Faculdade de Medicina da Universidade Eberhard-Karls e do Hospital Universitário de Tuebingen aprovou a coleta e investigação de amostras de pacientes e doadores saudáveis (número do projeto 159/2011BO2), e o consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes de acordo com a Declaração de Helsinque. As células primárias do MCL usadas aqui foram isoladas de linfonodos inteiros de pacientes com MCL e, portanto, incluíram não apenas células MCL, mas também outras células, como células imunes e fibroblastos.

1. Preparação de pasta de gelatina para o banho de suporte

NOTA: A pasta de gelatina servirá como banho de suporte durante o processo de bioimpressão 3D. Induz a reticulação da biotinta, permitindo a formação de uma estrutura 3D. A preparação da pasta de gelatina deve ser realizada em condições estéreis dentro de uma capa de cultura de células.

  1. Prepare uma solução de gelatina a 4,5% (p / v) em HEPES 10 mM e CaCl11 mM 2 dissolvendo 6,75 g de gelatina em pó em 1,5 mL de HEPES 1 M, 15 mL de CaCl110 mM 2 e 133,5 mL de H2O estéril em um frasco de vidro estéril com tampa. Certifique-se de que o frasco de vidro seja adequado para misturar em um misturador de alto desempenho.
  2. Incubar a solução a 37°C durante 4 h ou até que não sejam observadas manchas ao agitar a solução, indicando que a gelatina está completamente dissolvida. Resfrie a gelatina a 4 ° C durante a noite ou por pelo menos 12 h.
  3. Prepare um tampão de lavagem estéril consistindo de 10 mM HEPES e 14.4 mM CaCl2. Pré-resfrie o tampão de lavagem a 4 ° C.
  4. Quebre a gelatina solidificada a 4,5% em vários pedaços usando uma colher estéril.
  5. Encha completamente o frasco de vidro contendo a gelatina a 4.5% com o tampão de lavagem pré-resfriado, garantindo que o tampão permaneça frio durante todo o processo de preparação da pasta de gelatina.
  6. Congele o frasco de vidro contendo gelatina a -20 ° C por 45-60 min, até que a suspensão de gelatina atinja 0 ° C, mas ainda não tenha começado a formar cristais de gelo. Use um termômetro para monitorar a temperatura.
  7. Prenda a tampa e a lâmina da batedeira ao frasco de vidro e, em seguida, monte o frasco de vidro na batedeira. Misture a suspensão de gelatina por 120 s usando a configuração de pulso.
    NOTA: As configurações do liquidificador podem ter que ser ajustadas ao usar um tipo diferente de liquidificador.
  8. Transfira a suspensão misturada para tubos pré-resfriados de 50 mL. Centrifugue a 3.800 x g por 2 min a 4°C. Certifique-se de que a suspensão seja separada em uma pasta de gelatina sólida na parte inferior e o tampão de lavagem do líquido na parte superior.
  9. Execute a seguinte etapa no gelo: Lave a pasta de gelatina. Aspire a camada líquida superior, tentando remover as bolhas visíveis na parte superior do tampão de lavagem. Adicione 20 mL de tampão de lavagem fresco a 4 ° C ao tubo. Vortex o tubo para misturar a pasta de gelatina com o tampão de lavagem.
  10. Repita o processo de centrifugação e lavagem pelo menos 3x ou até que nenhuma bolha seja visível na parte superior do tampão de lavagem. Após a lavagem final, remova qualquer tampão de lavagem residual por aspiração. A pasta de gelatina pode ser armazenada a 4°C por várias semanas.

2. Preparação de biotinta carregada de células

  1. Prepare uma solução estéril de alginato a 5% 1-2 dias antes da impressão. Adicione 1 g de alginato a 20 mL de PBS estéril em um tubo de 50 mL. Para evitar resíduos secos de pó de alginato, adicione o PBS em pequenos incrementos, alternando entre as adições. Incubar a solução em banho-maria a 37 °C durante várias horas ou durante a noite num rolo tubular à temperatura ambiente. Quando o alginato estiver completamente dissolvido, conservar a solução a 4 °C até ser necessário.
  2. Se estiver trabalhando com uma linha celular MCL, cultive as células em suspensão em um frasco T75. No dia da impressão, certifique-se de que 1,4 x 107 células estejam disponíveis para a preparação de 1 mL de bioink, o que renderá 9 a 10 fatias de tumor de hidrogel.
  3. Se estiver trabalhando com células primárias do LCM, as células não precisam ser cultivadas em cultura em suspensão antes da bioimpressão. Descongele as células MCL primárias criopreservadas diretamente antes da bioimpressão. Transfira as células primárias do LCM para um tubo de 50 mL com meio de cultura. Para remover o meio de congelamento restante, centrifugue imediatamente o tubo a 340 x g por 5 min e, em seguida, remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 20 mL de meio fresco para contagem de células.
  4. No dia da impressão, prepare a biotinta adaptada para as células de interesse. Para células Jeko-1, prepare uma biotinta composta por 0,5% (p/v) de alginato, 20% (v/v) de colágeno tipo I, 1x RPMI e 2 mM de HEPES. Misture 100 μL de alginato a 5%, 200 μL de colágeno tipo I, 100 μL de 10x RPMI, 200 μL de HEPES 10 mM e 350 μL de PBS para 1 mL de bioink. As células serão adicionadas na etapa 2.6.
  5. Para células MCL primárias, prepare uma biotinta composta por 0,5% (p/v) de alginato, 20% (v/v) de colágeno tipo I, 1x RPMI e 0,5 mM de HEPES. Misture 100 μL de alginato a 5%, 200 μL de colágeno tipo I, 100 μL de 10x RPMI, 50 μL de HEPES 10 mM e 500 μL de matriz de membrana basal para 1 mL de bioink. As células serão adicionadas na etapa 2.6. Se estiver trabalhando com uma linha celular MCL, transfira a suspensão celular do frasco de cultura para um tubo de 50 mL.
  6. Misture as células com 0,4% de azul de tripano na proporção de 1:1. Conte as células viáveis (não coradas) usando um contador de células ou uma câmara de Neubauer. Calcule o volume de suspensão celular para 1 mL de bioink, que equivale a 1,4x107 células. Transfira o volume calculado para um novo tubo de 50 mL. Centrifugue a 340 x g por 5 min e, em seguida, remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular na biotinta preparada para gerar a biotinta final carregada de células.
    NOTA: Estimou-se que o pellet celular tenha um volume de 50 μL de meio. Juntamente com a biotinta preparada na etapa 2.4, isso produzirá 1 mL de biotinta.

3. Bioimpressão no banho

NOTA: Se possível, conduza o processo de impressão 3D em um ambiente estéril, como sob uma capa de cultura de células. A impressora 3D utilizada foi modificada para FRESH printing com a adição de um extensor de bomba de seringa, conforme descrito em Hinton et al.20.

  1. Ligue a bioimpressora e conecte-a ao software da impressora 3D. Abra o arquivo .stl que contém o blueprint para as fatias de tumor de hidrogel. Até 5 fatias podem ser impressas simultaneamente. Certifique-se de que cada fatia de tumor de hidrogel tenha um diâmetro de 8 mm e uma altura de 1,5 mm. Defina a densidade de preenchimento para 85%. Posicione o cabeçote da impressora.
    NOTA: O arquivo STL foi projetado com o Fusion 360 e pode ser encontrado no Arquivo de codificação suplementar 1. Para a impressão 3D, foi utilizado o software Cura Versão 15.04.5.
  2. Transferir a pasta de gelatina previamente preparada para uma placa de Petri de 35 mm de diâmetro até ficar meio cheia. Certifique-se de que não haja espaços de ar na pasta de gelatina. Retire o excesso de água da pasta usando lenços descartáveis de precisão para gerar um banho de suporte de gelatina, que é pastoso e mantém a forma até que seja aplicada força suficiente.
  3. Transfira a biotinta carregada de células para uma seringa de vidro de 2,5 mL e conecte-a a um bico rombudo de 0,8 mm. Inverta a seringa e ejete cuidadosamente o excesso de ar e bolhas de ar. Assim que a seringa estiver preparada, insira-a na bioimpressora. Usando o software da impressora 3D, extrude a biotinta até que ela comece a ser ejetada do bico. Limpe a gota de biotinta ejetada usando um pano descartável de precisão científica para evitar o entupimento do bico.
  4. Coloque o banho de suporte de gelatina logo abaixo do bico da seringa. Abaixe o cabeçote da impressora até que o bico esteja posicionado dentro da pasta de gelatina, 2 mm acima do fundo do banho de suporte.
  5. Inicie o processo de impressão através do software da impressora 3D.
  6. Quando o processo de impressão estiver concluído, remova qualquer excesso de pasta de gelatina do bico para evitar entupimento. Retire o banho de suporte contendo as fatias de tumor de hidrogel e cubra-o com uma tampa para manter a esterilidade.
  7. Incube o banho de suporte contendo as fatias de tumor de hidrogel impressas a 37 °C para permitir que a gelatina derreta. Esta etapa liberará as fatias de tumor de hidrogel impressas do banho de suporte.
  8. Pré-aqueça o tampão de lavagem e o meio de cultura de células a 37 °C. Enquanto a gelatina está derretendo, prepare uma placa de 6 poços para lavar as fatias de tumor de hidrogel. Encha dois poços com HEPES 10 mM, tampão de lavagem CaCl 14,4 mM2 (mesmo tampão usado para lavagem da pasta de gelatina) e dois poços com meio de cultura celular.
  9. Depois que a gelatina derreter, use uma espátula estéril para transferir as fatias do tumor de hidrogel para o tampão de lavagem. Lave as fatias por 1 min cada, primeiro nos dois poços contendo tampão de lavagem e depois nos dois poços contendo meio. As fatias de tumor de hidrogel carregadas de células estão agora prontas para cultura.
  10. Guarde a biotinta restante para repetir o processo de impressão.

4. Cultura e tratamento de fatias de tumor de hidrogel

  1. Para cultivar as fatias de hidrogel, transfira-as para um suporte de filtro (tamanho de poro de 0,4 μm) colocado dentro de uma placa de 6 poços. Cultive até 5 fatias de hidrogel em um único suporte de filtro. Adicione 1,5 mL de meio de cultura celular abaixo do suporte do filtro. Adicione uma gota de meio em cima das fatias de tumor de hidrogel para evitar que sequem.
  2. Para o tratamento medicamentoso de fatias de tumor de hidrogel, adicione a quantidade desejada do medicamento ao meio de cultura celular. Aqui, fatias de tumor de hidrogel foram tratadas com 0,33 μM-27 μM de doxorrubicina por 48 h ou 72 h. Sempre cultive um conjunto de fatias sem tratamento como controle.
  3. Coloque a placa de 6 poços com as fatias de tumor de hidrogel em uma incubadora de cultura de células a 37 °C e 5% de CO2 pelo período de cultivo desejado.

5. Análise de viabilidade de células por ensaio de exclusão de azul de tripano

  1. Para avaliar a viabilidade celular após a cultura ou tratamento, dissolva as fatias tumorais de hidrogel. Transfira uma fatia de tumor de hidrogel para um tubo de 1,5 mL. Adicione 500 μL por fatia de um tampão de dissolução contendo 30 mM de EDTA, 55 mM de citrato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio (pH 6,8). Pipete para cima e para baixo até que o hidrogel esteja completamente dissolvido.
  2. Centrifugue a solução a 340 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante. Ressuspenda as células em 500 μL de meio por fatia de hidrogel dissolvido.
  3. Misture a suspensão celular na proporção de 1:1 com 0,4% de azul de tripano. Conte as células viáveis (não coradas) e mortas (coradas) com um contador de células ou uma câmara de Neubauer. Registre o número de células vivas e mortas para análise posterior.

6. Imagem de fluorescência 3D ao vivo de quatro cores

NOTA: A coloração de quatro cores usada aqui permite a diferenciação entre células vivas (TMRM-positivas), células apoptóticas (substrato fluorogênico Caspase-3 positivo) e células mortas (PicoGreen-positivo)21,22,23. Os núcleos são detectados com DRAQ5. No entanto, este protocolo pode ser ajustado a qualquer outro corante de fluorescência específico fotoestável para detectar os biomarcadores, estruturas celulares ou tipos de células de escolha. Antes de colorir, certifique-se de que o microscópio seja capaz de detectar os comprimentos de onda dos fluoróforos usados para coloração.

  1. Para uma coloração de quatro cores de uma fatia de tumor de hidrogel, prepare uma solução de coloração adicionando TMRM, DRAQ5 e substrato fluorogênico de Caspase-3 a 1 mL de meio de cultura de células a uma concentração final de 0,5 μM, 5 μM e 2 μM, respectivamente.
  2. Usando uma espátula estéril, transfira uma fatia de tumor de hidrogel para uma lamínula de vidro com câmara. Adicione a solução de coloração preparada por cima da fatia de hidrogel até que esteja totalmente coberta. Incubar a amostra durante 20 min a 37 °C na escuridão.
  3. Após a incubação inicial, colete a solução de coloração que cobre a fatia tumoral de hidrogel e adicione 0,7 μL / mL de PicoGreen. Pipetar a solução de coloração de volta para a fatia de hidrogel e incubar durante mais 10 minutos a 37 °C na escuridão.
  4. Após a incubação, remova cuidadosamente o excesso de meio, deixando solução de coloração suficiente para manter a fatia de hidrogel úmida.
  5. Analise a fatia imediatamente usando um microscópio confocal. Para evitar fototoxicidade e fotobranqueamento, minimize a dose de fótons aplicada reduzindo a intensidade do laser e o tempo de excitação. Os espectros de excitação/emissão das manchas descritas acima podem ser encontrados na Tabela 1.
  6. Para obter uma visão geral da distribuição celular da célula no hidrogel, capture as seções z. Se as seções z foram feitas durante a imagem, gere reconstruções 3D das fatias do tumor de hidrogel usando o software apropriado. Essas reconstruções permitirão uma análise completa da distribuição espacial e do status celular das células nas fatias tumorais de hidrogel.
  7. Siga as instruções e o script fornecidos no Arquivo Suplementar 1 e no Arquivo Suplementar 2 para executar a segmentação e reconstrução da célula.

Resultados

As fatias tumorais de hidrogel contendo células MCL foram geradas com o protocolo descrito acima. As etapas do fluxo de trabalho para impressão 3D e cultura das fatias de tumor de hidrogel são mostradas na Figura 1A. A impressora 3D utilizada foi modificada para FRESH printing com a adição de um extensor de bomba de seringa, conforme descrito em Hinton et al.20 (Figura 1B). Até cinco fatias foram impressas de uma só vez (Figura 1C) e cultivadas em um suporte de filtro (Figura 1D). O meio foi adicionado abaixo do suporte do filtro para fornecer um suprimento de nutrientes para as fatias tumorais de hidrogel. Uma gota de meio foi adicionada em cima de cada fatia de tumor de hidrogel para evitar que secassem. Uma visão geral de cinco fatias de tumor de hidrogel cultivadas em um suporte de filtro é mostrada na Figura 1E, juntamente com imagens em close de uma fatia de hidrogel. Durante um período de cultura de 3 dias, os cortes tumorais de hidrogel permaneceram estáveis e mantiveram sua estrutura (Figura 2A). Logo após a impressão, bolhas de ar estavam presentes nas fatias do tumor de hidrogel, mas desapareceram durante o cultivo (Figura 2A).

A viabilidade da linhagem celular MCL Jeko-1 cultivada em fatias tumorais de hidrogel (3D) em comparação com células Jeko-1 cultivadas em cultura em suspensão (2D) foi avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano (Figura 2B). Após 3 dias de cultivo, 80% das células eram viáveis, em comparação com uma viabilidade inicial de 88% das células Jeko-1 antes da impressão. As células Jeko-1 cultivadas em 2D mantiveram a viabilidade inicial de 88%. Não houve diferença significativa entre as células Jeko-1 cultivadas em 2D e 3D. Para avaliar se as células Jeko-1 proliferam nas fatias de hidrogel, foi determinado o número médio de células Jeko-1 por fatia de hidrogel (Figura 2C). Enquanto 5x105 células Jeko-1 estavam contidas em cada fatia logo após a impressão (d0), esse número quase dobrou para 9,3x105 células após 3 dias de cultivo.

A distribuição e o status das células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel foram avaliados por imagens de fluorescência ao vivo em quatro cores (Figura 2D) diretamente após a impressão ou após 3 dias de cultura. Após a impressão, as reconstruções 3D das fatias de hidrogel Jeko-1 mostraram uma distribuição homogênea das células. A maioria das células foi positiva para TMRM, um marcador para potencial de membrana mitocondrial22. Uma minoria de células foi positiva para a atividade da Caspase-3, um marcador para indução de apoptose23, bem como para o marcador de células mortas PicoGreen21. Após 3 dias de cultivo, foi observado um aumento no número de células juntamente com a formação de aglomerados de células. A maioria das células permaneceu positiva para TMRM, enquanto apenas algumas células foram positivas para atividade de Caspase-3 ou PicoGreen (Figura 2C).

Para analisar se as células do ligamento colateral medial em fatias de hidrogel respondem a quimioterápicos, as células Jeko-1 cultivadas em cultura em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) foram tratadas com a droga quimioterápica doxorrubicina, que faz parte do tratamento padrão para pacientes com LCM24. A estrutura geral das fatias de hidrogel foi mantida durante o tratamento com doxorrubicina (Figura 3A). A viabilidade das células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel diminuiu de forma dose-dependente em resposta ao tratamento com doxorrubicina. O IC50 da doxorrubicina em células Jeko-1 foi aumentado quando as células foram cultivadas em fatias de hidrogel (IC50 = 5,8 μM) em comparação com as células Jeko-1 cultivadas em cultura de suspensão 2D (IC50 = 2,0μM; Figura 3B). A imagem de fluorescência ao vivo em quatro cores mostrou um sinal TMRM reduzido e um aumento do sinal PicoGreen em células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel em resposta ao tratamento com doxorrubicina, confirmando uma redução da viabilidade induzida pelo tratamento. As imagens obtidas a partir de imagens de fluorescência ao vivo em quatro cores foram reconstruídas em 3D, segmentadas com base no sinal dos núcleos DRAQ5 e analisadas usando o Python Script descrito no Arquivo Suplementar 1. Uma máscara de segmentação exemplar é mostrada na Figura Suplementar 1. O número de células identificado a partir do sinal DRAQ5 foi usado para determinar o número total de células. O número de células positivo para a atividade de TMRM, PicoGreen e Caspase-3 foi usado para identificar a porcentagem de células viáveis, mortas ou apoptóticas, respectivamente. As quantificações da coloração de fluorescência viva de quatro cores de células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel por 3 dias com ou sem 9 μM de doxorrubicina mostraram viabilidade comparável ao ensaio de exclusão de azul de tripano (Tabela 2).

Além das linhagens celulares MCL estabelecidas, as células MCL primárias de três pacientes MCL diferentes foram cultivadas em cultura de suspensão 2D ou em fatias de hidrogel 3D (Figura 4, Figura Suplementar 2). Conforme verificado por um patologista, todos os três MCLs (Paciente 1-3) eram de morfologia clássica/comum com índices Ki67 de 20%-50%. As células primárias do ligamento colateral medial incluíam todos os tipos de células isoladas dos linfonodos do paciente com ligamento colateral medial e, portanto, continham não apenas células do LCM, mas também outros tipos de células imunes ou células estromais. A viabilidade das fatias primárias de hidrogel MCL foi avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. Após 4 dias de cultura, as células primárias do LCM em fatias de hidrogel mantiveram uma viabilidade de 43,6% (45,7% no dia 3) em comparação com uma viabilidade basal de 71,0% antes da impressão (Figura 4A). Isso representa um aumento da viabilidade em comparação com as células cultivadas em suspensão (2D), que tiveram uma sobrevivência de 19,6% após quatro dias de cultivo (28,4% no dia 3). Essa viabilidade foi visualizada por imagens de fluorescência ao vivo em quatro cores, nas quais a maioria das células foi positiva para TMRM e viável, enquanto uma subpopulação foi positiva para atividade de Caspase-3 e PicoGreen, indicando apoptose e morte celular, respectivamente (Figura 4B). Os dados de quantificação da Figura 4B são mostrados na Tabela 2. As células primárias de mais dois pacientes com MCL mostraram um aumento da sobrevivência das células quando cultivadas nas fatias de hidrogel (3D) em comparação com a respectiva cultura em suspensão 2D (Figura Suplementar 1).

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Figura 1: Fluxo de trabalho de impressão 3D de fatias tumorais de hidrogel.(A) Fluxo de trabalho de impressão 3D e cultura de células em fatias tumorais de hidrogel. (B) Configuração da impressora usada para bioimpressão 3D de fatias de hidrogel em um banho de suporte de gelatina. (C) Impressão de um projeto no software da impressora 3D. Até cinco fatias de hidrogel foram impressas de uma só vez. (D) Representação esquemática da cultura de fatias de hidrogel. As fatias de hidrogel foram cultivadas em um suporte de filtro em uma placa de 6 poços. Uma gota de meio foi adicionada em cima de cada fatia de hidrogel para manter sua umidade. Até cinco fatias de hidrogel podem ser cultivadas em um suporte de filtro. (E) Fatias de hidrogel impressas em 3D cultivadas em um suporte de filtro, conforme mostrado por uma imagem geral ou por imagens em close-up. As barras de escala representam 5 mm, 1 mm ou 200 μm, conforme indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Cultura de uma linhagem celular de linfoma de células do manto (MCL) em fatias de hidrogel impressas em 3D.(A) Close-up de uma fatia de hidrogel representativa contendo a linha celular MCL Jeko-1 após impressão (d0) ou após 3 dias de cultura (d3). A barra de escala representa 1 mm. (B) Viabilidade de células Jeko-1 cultivadas em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) por 2 dias, conforme avaliado pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. A média ± DP de três experimentos independentes de bioimpressão é mostrada. (C) Número de células Jeko-1 contidas em cada fatia de hidrogel imediatamente após a impressão (d0) ou após até 3 dias de cultura (d1-d3). A média ± DP de três experimentos independentes de bioimpressão é mostrada. Não foi observada diferença estatisticamente significativa (n.s., p > 0,05, teste de Mann-Whitney). (D) Reconstrução tridimensional de fatias de hidrogel Jeko-1 no dia da impressão (d0) ou após 3 dias de cultura (d3). O modelo foi gerado a partir de pilhas z de uma imagem de fluorescência 3D ao vivo de quatro cores. As células vivas são mostradas em vermelho (TMRM), as células apoptóticas em amarelo (atividade enzimática da Caspase-3), as células mortas em verde (PicoGreen) e os núcleos em azul (DRAQ5). A barra de escala representa 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Tratamento medicamentoso de uma linhagem celular de linfoma de células do manto (MCL) em fatias de hidrogel. (A) Close-up de uma fatia de hidrogel representativa contendo a linha celular MCL Jeko-1 tratada com 3 μM de doxorrubicina por 3 dias (d3). A barra de escala representa 1 mm. (B) Células Jeko-1 cultivadas em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) foram tratadas com concentrações crescentes do agente quimioterápico Doxorrubicina por 2 dias. A viabilidade das células foi avaliada pelo ensaio de exclusão do azul de tripano. A média ± DP de quatro experimentos independentes de bioimpressão é mostrada. (C) Reconstrução tridimensional de fatias de hidrogel Jeko-1 tratadas com 9 μM de doxorrubicina (Doxo) por 3 dias (d3). O modelo foi gerado a partir de pilhas z de uma imagem de fluorescência 3D ao vivo de quatro cores. As células vivas são mostradas em vermelho (TMRM), as células apoptóticas em amarelo (atividade enzimática da Caspase-3), as células mortas em verde (PicoGreen) e os núcleos em azul (DRAQ5). A barra de escala representa 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Cultura de células primárias do LCM em fatias de hidrogel impressas em 3D. (A) Viabilidade de células primárias do LCM cultivadas em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) por até 4 dias, conforme avaliado pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. A viabilidade média de um experimento é mostrada. (B) Reconstrução tridimensional de células primárias do LCM cultivadas em fatias de hidrogel (3D) por 3 dias. As pilhas Z foram geradas a partir de fatias de hidrogel coradas com uma coloração viva de quatro cores e analisadas usando um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). As células vivas são mostradas em vermelho (TMRM), as células apoptóticas em amarelo (atividade enzimática da Caspase-3), as células mortas em verde (PicoGreen) e os núcleos em azul (DRAQ5). A barra de escala representa 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ManchaTMRMDRAQ5Substrato NucView405 Caspase-3PicoVerde
Excitação/Emissão548 nm/574 nm647 nm/681 nm429 nm/ 469 nm488 nm/ 520 nm

Tabela 1: Máximos de excitação/emissão das manchas usadas para imagens de fluorescência 3D ao vivo em quatro cores.

Amostra% de células
TMRM (células viáveis)PicoGreen (células mortas)Caspase-3 (células apoptóticas)
Jeko-1 Ctrl8323.618.3
Jeko-1 Doxo 9 μM27.681.386.6
Paciente Primário 1 do LCM75.231.133.1

Tabela 2: Quantificação de reconstruções 3D de coloração viva de quatro cores de fatias tumorais de hidrogel cultivadas. Fatias de tumor de hidrogel foram cultivadas por 3 dias e continham células Jeko-1 cultivadas com ou sem tratamento com 9 μM de doxorrubicina ou células MCL primárias (paciente 1).

Figura suplementar 1: Identificação celular a partir de reconstruções 3D de coloração viva de quatro cores. Reconstruções 3D de imagem confocal marcada com DRAQ5 obtida a partir de (A) coloração ao vivo de quatro cores e (B) uma imagem segmentada neste canal gerada usando o pipeline de análise de imagem Python. A barra de escala representa 200 μm. Clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 2: Cultura de células MCL primárias dos pacientes 2 e 3 em fatias tumorais de hidrogel.Viabilidade das células MCL primárias do (A) paciente 2 ou (B) paciente 3 cultivadas em suspensão (2D) ou em fatias de hidrogel (3D) por até 4 dias, conforme avaliado pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. A viabilidade média de um experimento é mostrada. Clique aqui para baixar esta figura.

Arquivo Suplementar 1: Instruções para análise de reconstruções 3D obtidas a partir de coloração ao vivo de quatro cores. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Script Python para análise de reconstruções 3D obtidas a partir de coloração ao vivo de quatro cores. Clique aqui para baixar este arquivo.

Codificação Suplementar File 1: Stl. arquivo contendo o projeto para as fatias de tumor de hidrogel. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

As fatias tumorais de hidrogel descritas neste protocolo oferecem um modelo MCL que mimetiza a estrutura linfonodal, permitindo o estudo da sobrevivência das células MCL e da resposta a drogas em um microambiente tumoral 3D gerado por bioimpressão.

Os métodos de bioimpressão mais utilizados são baseados na extrusão, onde a biotinta é ejetada através de um sistema de dispensação. Na impressão a jato de tinta, por exemplo, as biotintas são rapidamente reticuladas após a deposição para formar estruturas 3D25. No entanto, essa abordagem vem com limitações, principalmente em termos de viscosidade dos materiais usados e capacidade de empilhar camadas. Em contraste, a bioimpressão 3D de extrusão baseada em seringa incorporada, como a bioimpressão FRESH usada neste protocolo, aplica uma abordagem gel-in-gel. Isso permite a impressão de biotintas de baixa viscosidade, como o colágeno, em construções estáveis, tornando possível mimetizar o complexo microambiente tumoral 20,26. Embora as impressoras 3D desenvolvidas especificamente para bioimpressão possam ser caras, o método apresentado aqui oferece um ponto de entrada mais acessível. Pode ser adaptado a impressoras de extrusão padrão com modificações relativamente simples. Essas modificações podem ser impressas em 3D com filamentos acessíveis, e os designs estão disponíveis como recursos de código aberto, por exemplo, por Hinton et al.20. No entanto, é importante observar que a preparação do banho de suporte de hidrogel para bioimpressão FRESH é altamente sensível à temperatura e requer atenção cuidadosa durante a preparação da pasta.

Freqüentemente, os modelos de tumor impressos em 3D são cultivados em sistemas flutuantes, sem o gradiente de oxigênio in vivo 25, ou em culturas de chips microfluídicos27, que capturam um alto grau de complexidade, mas têm baixo rendimento e requerem alta manutenção. Esses obstáculos podem ser superados com as fatias de tumor de hidrogel descritas aqui. A configuração de cultura de até cinco fatias tumorais de hidrogel em uma interface ar-líquido é derivada da cultura de fatias tumorais de corte preciso de tumores sólidos28. A membrana do suporte filtrante utilizada neste protocolo é composta por uma membrana de politetrafluoretileno (PFTE) com poro de 0,4 μm, que permite a troca de nutrientes, mas evita a fixação celular ou a migração celular29. A cultura na membrana de PTFE fornece suporte físico para as fatias manterem sua estabilidade e evitarem que se rompam ou se desintegrem. Além disso, eles fornecem uma interface ar-líquido, fornecendo oxigênio principalmente do ar acima e nutrientes do meio abaixo do filtro30. O sistema, portanto, incorpora variações espaço-temporais no suprimento de nutrientes, proliferação celular e oxigenação, como podem ocorrer in vivo25. Cultivadas nas fatias tumorais de hidrogel em um suporte de filtro, as células primárias do LCM mantiveram uma viabilidade de mais de 40% por 4 dias, o que foi superior à viabilidade observada na cultura em suspensão 2D (Figura 3A, Figura Suplementar 2). Investigações adicionais devem abordar se uma viabilidade prolongada pode ser alcançada pela adição de citocinas ou co-cultivo com fibroblastos que expressam CD40L, como tem sido descrito em esferoides e organoides de tumor primário de linfoma de células B 6,19,30 ou co-culturas de células MCL primárias com células L de fibroblastos que expressam CD40L14. A incorporação de tais abordagens nas fatias tumorais de hidrogel deve ser considerada para melhorar a cultura de células MCL primárias, bem como a semelhança com o microambiente nativo.

Os gânglios linfáticos contêm uma rede bem desenvolvida de fibras da matriz extracelular. Devido ao seu padrão, são conhecidas como fibras reticulares. Principalmente, essas fibras são compostas por colágeno e componentes específicos da membrana basal 31,32,33. Para gerar uma matriz semelhante à situação in vivo nos linfonodos, a biotinta usada para gerar as fatias tumorais de hidrogel é composta de colágeno tipo I e Matrigel, que consiste nas quatro principais proteínas ECM da membrana basal laminina, colágeno IV, entactina e perlecan34. Além disso, o alginato é adicionado à biotinta para estabilizar as fatias tumorais de hidrogel, permitindo uma cultura prolongada e o transporte de um vaso para outro usando uma espátula. O teste de diferentes hidrogéis contendo colágeno e alginato mostrou a maior viabilidade celular em combinação com uma fatia de hidrogel estável e durável ao usar uma bioink com 0,5% de alginato e 20% de colágeno (dados não mostrados). Além dos componentes, o diâmetro do corte do tumor de hidrogel de 0,8 cm se assemelha ainda mais ao diâmetro médio do linfonodo de 1 cm35. A imagem 3D ao vivo das fatias do tumor de hidrogel mostrou ainda uma distribuição uniforme das células (Figura 2C).

Aqui, a capacidade de tratar as fatias de hidrogel com drogas foi demonstrada pelo tratamento com doxorrubicina, que faz parte da terapia R-CHOP (rituximabe, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona), uma terapia padrão para subgrupos de pacientes mais velhos com LCM24. Em comparação com as culturas 2D, as influências do microambiente tumoral nos efeitos do tratamento podem ser estudadas nas fatias tumorais de hidrogel. Conforme mostrado na Figura 3, as células Jeko-1 cultivadas em fatias de hidrogel foram mais resistentes ao tratamento com doxorrubicina do que as células cultivadas em 2D. Isso está de acordo com as observações de que a matriz extracelular pode influenciar as respostas aos medicamentos e freqüentemente aumentar a resistência aos medicamentos por meio da modulação da rigidez tumoral36, da comunicação célula-célula37 e da administração do medicamento38. Além disso, a análise de citometria de fluxo, bem como a coloração imuno-histoquímica ou de imunofluorescência multiplex, podem fornecer informações mais profundas sobre a resposta ao tratamento de células únicas nas fatias tumorais de hidrogel.

Em conclusão, este protocolo descreve a geração e cultura de fatias tumorais de hidrogel, que representam um modelo de linfonodo 3D que imita a estrutura linfonodal tridimensional nativa. Ele tem o potencial de expandir a aplicação das células MCL para outras indicações de linfoma primário.

Divulgações

Este estudo foi apoiado pela Robert-Bosch Stiftung e pelo Ministério da Ciência, Pesquisa e Artes de Baden-Württemberg (3R-Network BW).

Agradecimentos

Agradecemos a Kerstin Willecke por sua excelente assistência técnica e a Yang Zhang por sua valiosa assistência com a análise de imagens 3D.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
µ-slide Fundo de vidro de 8 poçosibidi GmbH80827Lâminas de fundo de vidro usadas para imagens ao vivo de fatias de hidrogel
10x PBSCarl Roth GmbH + Co.KG9150.1Componente Bioink
10X RPMI-1640 MédioSigma-AldrichR1145Componente Bioink
Seringa à prova de gás de 2,5 ml modelo 1002 TLLHamilton81420Seringa para bioimpressão
Impressora de extrusão 3D, PrintrBot SimplePrintrbotAuto-modificado para permitir a impressão de biotintas
Placa de 6 poçosTh. Geyer GmbH & Co.KG7696790Cultura das fatias de hidrogel
Sistemas de filtração a vácuo de topo de garrafa, membrana PES, 500 ml, 0,22 µ m tamanho do poro, 70  membrana de mm de diâmetroCorning Inc.513-3355Filtração estéril de tampões
Cloreto de cálcio desidratadoCarl Roth GmbH + Co.KGT885.2Componente do tampão de lavagem e pasta de gelatina
Colágeno I de ratoCorning Inc.CLS354249Componente Bioink
Software Cura Versão 15.04.5 para impressão 3DUltimakerSoftware usado para impressão 3D
DRAQ5Biostatus Ltda.DR50050Coloração para imagens ao vivo de fatias de hidrogel
Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) di-hidratadoSigma-AldrichE5134Componente do tampão de dissolução de alginato
Contador automático de células EVENano EnTek Inc.10027-452Contador de células
Placas de Petri bacteriológicas Falcon com tampa, 35 mm de diâmetroFalcão351008Preenchido com pasta de gelatina para formar o banho de suporte para bioimpressão
Tubos Falcon, 50 mLSarstedt AG & Co.KG62.547.254
Soro fetal de bezerroSigma-AldrichS0615Suplemento de meio de cultura celular
Gelatina de pele suínaSigma-AldrichG1890Componente principal da pasta de gelatina
HEPES, Ácido Livre, Grau de Biologia MolecularMerck KGaACAS 7365-45-9Componente do tampão de lavagem e pasta de gelatina
Linha celular Jeko-1 MCLATCCCRL-3006Linha celular MCL
Toalhetes de precisão KIMTECH ScienceCorporação Kimberly Clark7551Usado para extrair o excesso de água da pasta de gelatina e para remover gotículas do bico da impressora 3D
Software LAS X Versão 3.5.7.23225LeicaSoftware usado para reconstruções 3D
Leica TCS SP8 Microscópio confocal de varredura a laserLeicaTCS SP8Microscópio confocal para imagens ao vivo
Pote de Vidro Regular Pint 16 ozCorporação BolaG001Frasco no qual a pasta de gelatina é preparada
Matriz de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento Matrigel (TFG)Corning Inc.356231Componente Bioink
Inserção de cultura de células milicelulares, 0,4 µ tamanho do poro mMerck KGaAPICMORG 50Suporte de filtro para fatias de hidrogel
Substrato NucView 405 Caspase-3, 1 mM em 1x PBSBiotium10405Coloração para imagens ao vivo de fatias de hidrogel
Liquidificador Oster Professional SeriesOsterBPST02-B00Liquidificador para gerar pasta de gelatina
Penicilina/estreptamicinaGibco15140163Suplemento para meio de cultura de células MCL
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-ReagenzienInvitrogenPág. 7589Coloração para imagens ao vivo de fatias de hidrogel
Rotina 35 RHettich24573Centrifugação de células
Centrífuga ROTINA 38/38RHettichZ720109Centrifugação de pasta de gelatina
RPMI-1640+GlutaMAXGibco61870036Base do meio de cultura para células MCL
Alginato de sódioCooperação FMCGQ9109901Componente Bioink
Cloreto de sódioMerck KGaA1.06404Componente do tampão de dissolução de alginato
Citrato de sódioCarl Roth GmbH + Co.KG3580.1Componente do tampão de dissolução de alginato
Cânulas de aplicação romba Sterican 21G 0,8x22 mmB.Braun9180109Bico para impressão 3D
Perclorato de tetrametilrodamina-éster metílico (TMRM)Sigma-AldrichT5428Coloração para imagens ao vivo de fatias de hidrogel
Azul de tripano, 0,4%Sigma-AldrichT8154Coloração para análise de viabilidade
Termômetro à prova d'águaVWR620-2099Termômetro para monitorar a temperatura da pasta de gelatina

Referências

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