Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia e interações com sinapses na retina murina doente

Summary

Este artigo demonstra um método para visualizar e quantificar a motilidade e o contato da microglia com pontos pós-sinápticos na retina usando microscopia confocal de disco giratório.

Abstract

A microglia são os macrófagos residentes do sistema nervoso central (SNC) que respondem a infecções e lesões teciduais. Além de seu papel na inflamação, a microglia desempenha um papel no desenvolvimento do refinamento dos circuitos por meio da poda sináptica. No entanto, os mecanismos de poda sináptica na neuroinflamação e neurodegeneração permanecem desconhecidos. Neste protocolo, usamos um modelo de explant de retina de camundongo para estudar a dinâmica da microglia ex vivo. Para examinar a motilidade da microglia e suas interações com proteínas pós-sinápticas, marcamos sinapses com AAV-PSD95-RFP e gravamos vídeos em timelapse de microglia móvel colocalizada com proteínas pós-sinápticas usando microscopia confocal de disco giratório. Em seguida, criamos reconstruções de superfície e pontos da microglia e PSD95 usando software de análise de imagem. Dados como comprimento do deslocamento da microglia, velocidade do processo e contato com pontos pós-sinápticos podem então ser extraídos dessas superfícies para entender o comportamento da microglia tanto em estados homeostáticos quanto após lesão neuronal. Esse protocolo pode ser útil para examinar o papel da microglia na poda sináptica em doenças neurodegenerativas da retina.

Introduction

A função do circuito e a homeostase dependem de disparo sinapse altamente regulado e outras interações únicas entre vários tipos^{celulares 1}. Servindo como macrófagos residentes do sistema nervoso central (SNC), as microglias são uma população não neuronal na retina que desempenha um papel único na poda sináptica. Durante o desenvolvimento do SNC, a microglia pode sinapses não funcionais ou fracas para refinar a circuitaria^{neural 2}. A microglia no cérebro em desenvolvimento examina seu ambiente e está preparada para um papel neuroprotetor durante períodos^{críticos 3}. No desenvolvimento do sistema visual, a microglia é reguladora-chave no desenvolvimento de neurônios corticais e interneurônios, além de exibir mudanças morfológicas durante períodos críticos de remodelação^{sináptica 4}. Da mesma forma, na retina em desenvolvimento, a microglia limpa células apoptóticas para dar lugar a novas conexões sinápticas, confirmado com a regulação para cima do marcador homeostático P2Ry12 durante esses eventos^{de limpeza.} No entanto, descobertas recentes destacam que a microglia pode não desempenhar um papel definitivo no refinamento dos circuitos neurais no sistema visual^{em desenvolvimento 6}, enfatizando que há controvérsia sobre o papel que a microglia desempenha no desenvolvimento dos circuitos visuais.

Em contextos de lesão, a microglia altera a morfologia para um estado ativo e pode desempenhar um papel neurodegenerativo. Por exemplo, a microglia em modelos de doença de Alzheimer demonstrou aumento do engolimento das placas amiloide-beta⁷ e de marcadores sinápticos como SPH e PSD95-8. Na neurodegeneração retiniana, muitos grupos de pesquisa encontraram microglia com material sináptico engolido, mas não há evidências claras de engolimento ativo de sinapses^intactas 9,10,11,12,13. Por exemplo, He et al. descobriram que o aumento do número de microglias e o volume de material sináptico engolido em um modelo de retinite^{pigmentosa 9}, mas não está claro se houve fagocitose de sinapses intactas versus eliminação de detritos. Além disso, classificações tradicionais de microglia — como "repouso vs. ativado" ou "M1 vs. M2" — são simplificadas demais e cada vez mais imprecisas diante dos insights modernos. A microglia existe em um gradiente de estados, não em categorias^{discretas 12}. Assim, Paolicelli et al. defenderam uma mudança das classificações binárias desatualizadas para uma nomenclatura mais nuançada e rigorosamente definida para os estados microgliais, a fim de melhor compreender e definir a morfologia e atividade das^{microglias 12}. Portanto, estratégias para avaliar a função microglial ex vivo e in vivo aumentarão a capacidade do campo de discernir estados e atividades microgliálicas tanto em contextos de desenvolvimento quanto de doenças.

Embora existam estratégias para estudar a função da microglia tanto ex vivo quanto in vivo, a imagem live ex vivo traz vários benefícios. Primeiro, a clareza da córnea ou o desenvolvimento de catarata não impedem a imagem retiniana, criando uma visualização clara de processos minúsculos e pontos sinápticos. Além disso, a imagem in vivo exige mais habilidade técnica para ser montada, o que torna as preparações ex vivo com maior capacidade de montagem, resultando em mais animais fotografados por experimento. Apesar dos benefícios teóricos que a imagem in vivo pode proporcionar, é necessário um alto poder do laser (100-230 μW) para capturar a motilidade do processo microglial para imagens^{longitudinais 14,15}. No entanto, imagens ex vivo da microglia com menor potência do laser e meios de imagem adequados podem fornecer a mesma qualidade de imagem que a imagem in vivo, com a preparação adequada, embora o tecido não esteja mais in situ.

Demonstramos que a microglia aumenta em número, complexidade e movimento do processo após elevação transitória da pressão intraocular (PIO)¹⁰. No tecido fixo, essa microgliose resulta em aumento da colocalização com proteínas^{sinápticas 10}. Trabalhos anteriores também demonstraram perda precoce de sinapses e degeneração de dendritos de células ganglionares da retina (RGCs) no modelo murino de hipertensão ocular induzida por laser (LIOH) e em outros modelos neurodegenerativos 10,16,17,18,19,20. No entanto, ainda não se sabe se elas desempenham um papel ativo na poda das sinapses ou um papel mais passivo na eliminação de detritos celulares, incluindo sinapses desmontadas. Como a desmontagem das sinapses é uma marca inicial da neurodegeneração, compreender a dinâmica da microglia e seu papel na desmontagem das sinapses é^{fundamental 8,10}. Aqui, utilizamos imagens ao vivo para entender a dinâmica da microglia e sua interação com a proteína de densidade pós-sináptica excitatória (PSD95) nos dendritos dos RGCs.

Protocol

Os animais eram mantidos na Universidade da Califórnia, San Francisco, sob ciclos de luz de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, recebendo água e dieta padrão ad libitum, salvo especificação específica. Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, São Francisco. Veja a Tabela de Materiais para materiais e instrumentos usados neste protocolo. Uma visão geral do procedimento experimental, desde a injeção intravítrea até a imagem e análise, é mostrada na Figura 1.

1. Produção e eficiência do vírus AAV-PSD95-TagRFP

1. Construa AAV-PSD95-tagRFP tomando a sequência PSD-95pTagRFP (plasmídeo Addgene #52671; RRID:Addgene_52671) e inseri-o a jusante do promotor CMV em AAV-CMV-GFP após remover o GFP (plasmídeo Addgene #67634; RRID: Addgene_67634).
2. Prepare o vírus usando HEK293T tripla transfectada, purificado usando PEG/clorofórmio e concentrado até um título de 10¹² ip/mL (conforme descrito em Negrini et al.)²¹.
   NOTA: Este método de produção viral normalmente produz um título menor do que a ultracentrifugação, mas para esses experimentos, é desejável ter células pouco^{infectadas 21}. A versão do capsídeo/sorotipo usada nesses experimentos era 7m8, (plasmídeo de Addgene # 64839; RRID: Addgene_64839).
   1. Teste a eficiência do AAV antes de prosseguir com o protocolo completo de imagem.
      NOTA: Leitores que implementam este protocolo devem buscar rotulagem esparsa dos RGCs, pois o objetivo é identificar e isolar dendritos individuais dos RGCs.
3. Verifique a transfecção bem-sucedida e, em seguida, conserte a retina em 2% de PFA em 1x ACSF. Para proteínas sinápticas, verifique o sinal sob microscópio confocal a 63x para verificar a resolução clara da marcação fluorescente.
   NOTA: A concentração mais leve de fixação ajuda a preservar a marcação das proteínas sinápticas. Se o AAV usado não for para componentes sinápticos, os leitores podem optar por usar 4% de PFA em vez disso.

2. Manejo de camundongos e injeções intravítreas AAV-PSD95-TagRFP

1. Cruzamento de camundongos albinos CD-1 macho e fêmea (cepa 022) com B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (cepa 005582) para produzir camundongos albinos CD-1 com microglia expressora de EGFP. Espere pelo menos quatro gerações de retrocruzamentos para usar os ratos heterozigotos macho e fêmea Cx3cr1 em experimentos. Mantenha e atualize a cepa após 10 gerações de volta ao fundo do CD-1 para evitar deriva genética.
2. Anestesiar animais (P30-P60) usando anestesia isoflurana por meio de uma câmara de indução com anestesia de 3-5% em oxigênio com uma vazão de 1 L/min de oxigênio. Coloque o animal em um estereomicroscópio, garantindo que o isoflurano seja administrado continuamente através de um cone nasal. Para confirmar que o animal está anestesiado, belisque o dedo do pé pelo menos 3 vezes para confirmar.
3. Adicione uma gota de 0,5% de proparacaína antes de injetar o AAV. Injete 2 μL de AAV-PSD95-RFP lentamente intravíteo em ambos os olhos no limbo superotemporal usando uma seringa 26s G 10 μL. Remova lentamente a agulha para evitar o refluxo do VA pelo local da injeção. Aplique pomada antibiótica nos olhos após a injeção.
4. NOTA: A agulha não deve atravessar mais do que metade da circunferência da câmara vítrea. Ao fazer isso, a retina e o cristalino podem ser danificados com a ponta da agulha, levando a uma transfecção irregular ou até mesmo sem sucesso. O desenvolvimento ou hemorragia de catarata indica uma técnica de injeção defeituosa.
5. Após a injeção, confirme que os animais estão alertas antes de devolvê-los às suas gaiolas e quartos originais. Se um animal apresentar dor após a injeção, administre buprenorfina por meio de injeção intraperitoneal. Espere 3 semanas para a expressão do AAV. Se um modelo induzível for usado para elevar a pressão intraocular (ou realizar outras manipulações), espere 3 semanas antes de induzir pressão intraocular elevada em um olho, usando o olho contralateral ou os olhos de um animal ingênuo como controle.

3. Eutanásia e montagem plana retiniana

1. Prepare uma solução fresca 1x de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF, pH 7,4) em 1x PBS contendo os seguintes componentes em mM: 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgCl_{2,6H 2}O, 2,5 CaCl 2,2H₂O, 1 NaHPO ₄, 11 glicose e 20 HEPES).
2. Oxigene a solução por pelo menos 15 minutos antes de usá-la para dissecação aguda. Conecte o tubo a um tanque de oxigênio e coloque uma tampa com um furo no centro para evitar que o gás escape.
3. Eutanasie o camundongo com pelo menos 1 mL de anestesia isoflurana em uma pequena câmara de indução, seguida de luxação cervical. Marque o lado nasal da córnea com um marcador antes de enuclear, para que a localização da retina possa ser acompanhada durante todo o experimento.
   1. Para enuclear olhos injetados com microesferas ou laser, realize uma peritomia conjuntival limitada e coloque a tesoura atrás do olho para dissecar o olho na base do nervo óptico. Isso permite que o olho delicado permaneça intacto.
4. Usando um microscópio de dissecação, faça um pequeno furo com uma agulha de 23 G ou 25 G na córnea, o que permite que o ACSF oxigenado perfunda o olho. Insira tesouras nesse buraco para fazer um corte fiduciário na extremidade nasal.
5. Corte o restante da córnea e íris no limbo.
6. Remova a íris e a lente. Se a retina estiver grudada no cristalino, separe-o usando pinça.
7. Separe a retina da esclera usando pinças para dissecar suavemente entre a EPR e a retina neural.
8. Coloque a retina no lado não gradeado de um papel filtro de membrana de Ésteres de Celulose Mistos (MCE) para visualização clara e imagem.
9. Faça pequenos cortes relaxantes na retina nos outros três quadrantes, sendo o corte mais longo na retina nasal para acompanhar a localização da retina.
   NOTA: A retina deve parecer um trevo de quatro folhas.
10. Transfira a retina do papel filtro para um lenço de laboratório. Use uma gota de ACSF para umedecer a retina e depois use o lenço para secar o papel filtrante. Repita por pelo menos 8-10 gotas para fazer a retina aderir ao papel filtrante.
11. Coloque a retina em uma câmara de oxigenação enquanto disseca o olho contralateral.
12. Quando estiver pronto para a imagem, seque o papel de filtro conforme mencionado no passo 3.10 e inverta a retina sobre uma placa de Petri Matek. Aperte a retina com contas de metal ou um anel. Adicione de 3 a 5 gotas de ACSF.
    NOTA: Pequenas contas metálicas, como as de um banho de contas metálicas ou de um anel, têm tamanho e peso suficientes para evitar deriva sem prejudicar a integridade retiniana.
13. Crie um anel pegando um fio de aço e cordas de náilon esticadas, colando e adicionando um peso para resultar em um anel com cordas paralelas fixas e esticadas.
    1. Enrole o fio em torno de um cilindro de 1/2 polegada de diâmetro e puxe firmemente com um alicate. Corte cada anel do cilindro e achate entre um torno.
    2. Lixe o anel em uma face para que fique com um lado áspero e plano. Estique cordas de nylon sobre a abertura de uma garrafa com 1-2 polegadas de diâmetro e segure no lugar com elásticos.
    3. Coloque o anel sobre as cordas de náilon e cole-o cuidadosamente nas cordas de náilon, aplicando pequenas quantidades de cola ao longo do perímetro interno do anel. Depois, coloque um peso leve sobre o anel, por exemplo, uma moeda ou um fio metálico fino, para segurar o anel no lugar.
    4. Após a secagem, corte as cordas de nylon da borda externa do anel usando tesouras de precisão. O resultado são cordas paralelas fixas que estendem firmemente o diâmetro do anel.
    5. Se a densidade da corda de nylon dentro do anel for muito alta, corte cordas individuais com tesouras de mola de microdissecação para atender às necessidades do experimento.
       NOTA: O processo de dissecação e montagem deve levar apenas ~5 minutos. Quanto mais rápido o tecido demora para ser colocado em condições fisiológicas equilibradas ex vivo, mais saudável o tecido.

4. Aquisição de confocais de disco giratório

NOTA: Ligue a câmara de umidificação a 5% de_CO2 e mantenha-a funcionando por pelo menos 1 hora antes da imagem. Permitir que o sistema e a amostra atinjam o equilíbrio térmico ajudará a reduzir a deriva.

1. Comece a escanear a ocular a 10x para focar na microglia. Ao escanear o tecido em busca de áreas a imagear, use o canal da microglia como referência e foque apenas na microglia que tenha pontos sinápticos brilhantes colocalizados (dentro de 10-20 μm). Como a marcação do AAV não é homogênea em todo o tecido, escaneie áreas que possuem microglia e pontos colocalizados dentro do mesmo plano. Uma vez que uma área que atenda a esses critérios seja localizada, mude para 60x para focar e passe para o modo câmera clicando no botão da câmera .
   1. Usando o software do sistema de imagem, clique com o botão direito na tela para encontrar a navegação xy. Uma tela de pré-visualização aparecerá que pode escanear o tecido criando uma moldura de 3 x 3, 5 x 5, ou um tamanho personalizado para selecionar áreas ideais. Use o tamanho de quadros 3 x 3 ou 5 x 5 e a tela com um canal de referência para evitar o descolorimento contínuo da fotolija.
      NOTA: Para este protocolo, usamos o canal microglia.
2. Observe rapidamente a retina montada usando um microscópio confocal de disco giratório com uma alvo 60x (NA 1,49).
3. Para visualizar a amostra, clique com o botão direito na tela, selecione Viva e clique no botão de ajuste automático para que o sistema possa ajustar a visualização com base nas LUTs atuais. Para ajustar as configurações do laser, selecione cada canal individualmente primeiro e ajuste a potência e a exposição do laser conforme necessário. Depois, clique com o botão direito no fluoróforo para Atribuir Configurações ao Microscope e salve as configurações personalizadas, já que o software não as salva ao mudar para outro canal.
   1. Mude para o próximo canal e ajuste conforme necessário. Clique com o botão direito no fluoróforo para salvar as configurações. Se estiver adquirindo vários canais no mesmo quadro, insira os mesmos valores usados após pré-visualizar cada canal individualmente. Clique com o botão direito no fluoróforo para salvar as configurações.
   2. Para aquisição multicanal, selecione os canais de interesse na aba Lambda . Para imagens ao vivo, combine todos os canais em um único canal para capturar rapidamente movimentos finos da célula de interesse, permitindo que cada canal seja adquirido simultaneamente, em vez de separado, o que pode causar um atraso no timelapse dependendo da velocidade da célula.
4. Prossiga adquirindo um timelapse para o tempo desejado.
   1. Na aba de tempo no canto inferior esquerdo, insira um time lapse de 5 a 10 minutos com intervalo de 20 s.
   2. Na aba de configurações de aquisição à direita, defina a resolução da imagem para 608 x 832 com um tamanho de pixel de 0,12 μm.
   3. Colete imagens em 10 - 20 μm usando um passo de 0,3 μm para garantir uma resolução aceitável dos processos finos da microglia e dos pontos sinápticos ao longo do eixo z. Para garantir o rastreamento bem-sucedido das células, mantenha o intervalo de tempo entre os quadros entre 20 - 30 segundos.
      NOTA: Devido à fragilidade do tecido ex vivo, recomenda-se primeiro a imagem da retina experimental e por não mais que uma hora. Isso serve para normalizar a condição do olho controle contralateral, que deveria estar em uma câmara oxigenada durante a imagem da primeira retina.
5. Use esse protocolo para obter imagens das camadas mais superficiais da retina. Ao adquirir lapsos de tempo maiores que 20 μm, torna-se mais difícil capturar o movimento fino do processo durante os intervalos de 20 s. Portanto, apenas microglia de imagem que se encaixa dentro do stack de 20 μm.

5. Rastreamento, análise e exportação de dados

1. Renderização de superfície para microglia
   1. Converta o arquivo de timelapse para o formato IMS usando o software conversor de arquivos. Insira os seguintes tamanhos de voxel com base nas propriedades da imagem adquiridas no passo 4.2: x = 0,1272423 micrômetros, y = 0,1272423 micrômetros, z = 0,3 micrômetros.
   2. Uma vez lançado, o software de análise começará no Arena. Clique na pasta Observar para abrir o arquivo previamente convertido. Certifique-se de que a imagem esteja em visualização 3D.
   3. Para detectar microglias individuais inteiras, clique no ícone azul da superfície na Barra de Ferramentas de Objetos . Selecione as três últimas opções em Configurações do Algoritmo : Rastrear Superfícies (ao longo do tempo), Classificar Superfícies e Estatísticas Objeto-Objeto. Clique no botão azul de reproduzir para passar para a próxima etapa.
      1. No caso de múltiplas microglias, selecione Segmentar apenas uma Região de Interesse (ROI) para garantir que microglia individual exista dentro de um objeto de superfície. Defina os parâmetros x, y e z de acordo para formar apenas uma superfície das microglias individuais de interesse.
   4. Selecione o canal para o qual uma renderização de superfície será criada. Se desejar, selecione Liso para suavizar a criação da superfície e use uma proporção de 1:1 - 1,25 em relação ao tamanho voxel da imagem. Por exemplo, se a imagem tiver um voxel de 0,12 x 0,12 x 0,3 μm, defina o detalhe da superfície para 0,15 - 0,16 μm. Sob limiar, selecione Segmentação de Aprendizado de Máquina para treinar o software na detecção das células de interesse.
      NOTA: Esse próximo passo consiste em fornecer dados de treinamento para a IA da Imaris por meio da Segmentação de Aprendizado de Máquina.
   5. Em Dados de Treinamento, observe as duas ferramentas de pincel: Fundo (para detectar o fundo) e Primeiro Plano (para detectar o sinal verdadeiro da amostra). Desenhe pinceladas selecionando o pincel desejado e usando Shift + Clique esquerdo . Certifique-se de que Interpolar Exibição esteja selecionada em Configurações. Selecione Treinar e Prever para inserir os dados de treinamento das pinceladas feitas.
      NOTA: Alimentar mais de seis traços resulta em um tempo de processamento mais longo para a IA e captura imprecisa da célula.
      1. Use o ponteiro amarelo no meio para se mover pelo z-stack. Desenhe múltiplas pinceladas nos planos x, y e z, assim como em alguns (não todos) períodos de tempo do timelapse. Faça de 3 a 5 pinceladas curtas por entrada, pois a IA aprende melhor com pequenos pedaços de informação de cada vez. Ajuste essa etapa iterativamente a cada entrada até que uma superfície precisa da célula seja criada.
      2. Selecione o retângulo amarelo para alternar entre o display de treinamento e a superfície real criada como checagem final. Também verifique ao longo do time lapse se a superfície representa a célula com precisão.
   6. Uma vez alcançada a renderização precisa da superfície, passe para a próxima etapa. Desmarque objetos divididos.
   7. Ajuste o número de voxels no histograma. Mova o limiar para remover pequenos objetos que não estejam conectados à superfície principal.
      NOTA: Esta etapa é usada para remover quaisquer superfícies indesejadas pequenas que tenham sido criadas devido ao ruído de fundo. O objetivo é remover quaisquer superfícies que não estejam conectadas ao corpo celular principal de interesse.
   8. Em seguida, edite a superfície conforme necessário. Limpe manualmente quaisquer objetos que não façam parte da superfície principal ou cortes nas bordas usando a ferramenta tesoura, conforme necessário.
   9. Se desejado, estabeleça um limiar de espaços permitidos que ainda possam ser associados ao objeto. Selecione o algoritmo de rastreamento da célula em movimento.
      NOTA: O movimento autorregressivo é a ferramenta mais comumente usada para rastreamento de células, pois rastrea o movimento contínuo durante todo o timelapse.
      1. A distância máxima e o tamanho máximo da lacuna são números definidos pelo usuário que definem pontos significativos dos quais a superfície pode se desviar. Defina uma distância máxima de gap de 0,96 μm e um tamanho máximo de gap de 3 (configurações padrão).
   10. Semelhante a como objetos de superfície foram filtrados no passo 5.1.7, rastreios de filtro que não estão associados à superfície principal. Isso também é ajustado por um histograma. Defina onde definir o limite observando quando pequenas trilhas de pontos, que duram no máximo cinco períodos de tempo, são removidas dos ajustes do filtro.
   11. Em seguida, estabeleça classificações se desejar. Por exemplo, categorize o comprimento de deslocamento entre 0 - 1 μm e 1+ μm para determinar pequenos movimentos de processo ou deslocamento significativamente grande do processo ou célula.
   12. Por fim, coloque etiquetas adequadas em certos eventos usando as classificações da etapa anterior.
       NOTA: Esta etapa é melhor utilizada depois que os pontos forem gerados para o sinal pós-sináptico.
2. Classificação spot para PSD95
   1. Para detectar microglias individuais inteiras, clique no ícone azul da superfície na Barra de Ferramentas de Objetos . Selecione as três últimas opções em Configurações do Algoritmo : Rastrear Superfícies (ao longo do tempo), Classificar Superfícies e Estatísticas Objeto-Objeto. Clique no botão azul de reproduzir para passar para a próxima etapa.
   2. Selecione o canal de origem para o marcador sináptico. Desligue o slicer e quaisquer outros canais para visualizar apenas PSD95. Use o botão ctrl e a ferramenta de seleção de ponteiros para estimar o diâmetro xy do puncta.
      1. Escolha alguns pontos brilhantes que durem durante todo o timelapse (tamanho variando entre 0,6 μm e 1,2 μm).
      2. Desative a subtração de fundo. Se a imagem exigir subtração de fundo, use a ferramenta de subtração de fundo em Processamento de Imagem antes de processar o timelapse.
   3. Em seguida, adicione um filtro baseado na qualidade do spot. Arraste o histograma para que todos os pontos PSD95 sejam capturados com precisão ao longo do timelapse.
      NOTA: A qualidade é baseada na intensidade do centro do^{ponto 9}. Esse filtro captura com maior precisão o sinal real do PSD95, em comparação com o número de filtros voxels ou de diâmetro.
   4. Em seguida, remova quaisquer manchas geradas por ruído usando a etapa de edição. Alterne entre o cursor do cubo ou o cursor do círculo para remover pontos singulares ou múltiplos, respectivamente, que aparecem apenas por 1 ou 2 períodos de tempo devido ao ruído.
   5. Se desejado, estabeleça um limiar de espaços permitidos que ainda possam ser associados ao objeto. Selecione o algoritmo de rastreamento apropriado para o marcador sináptico.
      1. A distância máxima e o tamanho máximo da lacuna são números definidos pelo usuário que estabelecem pontos significativos dos quais as manchas podem se desviar. Defina uma distância máxima de 14,6 μm e um tamanho máximo de 3 (configurações padrão).
   6. Semelhante a como objetos pontos foram filtrados no passo 5.2.3, filtrar trilhas que não estão associadas a pontos distintos. Isso também é ajustado por um histograma. Para definir onde definir o limiar, procure quando as trilhas de objetos pequenos são removidas.
   7. Configure classificações se desejar. Por exemplo, distinga entre pontos engolidos, em contato ou não contato usando a classificação de Menor Distância à Superfície . Colocado engolido como qualquer ponto < 0 μm dentro da superfície, contato entre 0 a 0,5 μm da superfície, ou não contato como 0,5+ μm da superfície.
   8. Por fim, coloque etiquetas adequadas em certos eventos usando as classificações da etapa anterior.
3. Uma vez que superfícies e pontos representarem com precisão a microglia e pontos de interesse, exporte todas as estatísticas de cada objeto na aba de estatísticas . Garanta que as estatísticas detalhadas sejam extraídas, que incluirão o comprimento do deslocamento, velocidade e eventos de contato classificados.
   1. Muitas estatísticas, como área, volume, comprimento de deslocamento e velocidade, são saídas da Imaris. Exporte o comprimento e a velocidade do deslocamento da superfície para definir a dinâmica da microglia no experimento.
      1. Defina comprimento de deslocamento como a distância entre a posição inicial e a posição final da superfície, medida em μm²².
      2. Defina velocidade como a velocidade instantânea da superfície de um intervalo de tempo para o outro, medida em μm/^{s 22}.
         NOTA: Eventos de contato são um fenômeno descrito pelos autores como pontos pós-sinápticos intactos compartilhando 0 μm de distância entre microglias individuais por pelo menos cinco períodos de tempo consistentes dentro do timelapse.

Results

Microglias das retinas murinas CX3CR1-GFP foram analisadas usando o protocolo descrito. Os camundongos variavam de P30 a P60 no momento da injeção de AAV-PSD95-RFP, e pelo menos 21 dias haviam se passado para permitir a expressão de AAV. Imagens representativas da microglia e suas interações com os pontos PSD95 antes e depois da análise são mostradas na Figura 2. Para induzir a ativação da microglia, usamos o modelo de hipert...

Discussion

Esse protocolo permite a visualização e o acompanhamento da interação individual da microglia com sítios pós-sinápticos ao longo dos dendritos dos RGCs. Em uma doença neurodegenerativa como o glaucoma, a microglia se colocaliza com as sinapses na camada plexiforme interna (IPL) da retina. O papel da microglia na desmontagem das sinapses não é bem compreendido. No entanto, a microglia pode contribuir por meio de vários mecanismos potenciais, incluindo a absorção aberrante das sinapses, a ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agulha de calibre 25	Alcon	8065420920
26s Bitola 10 & micro; Seringa L	Hamilton	701RNWG
7m8	Addgene	64839	http://n2t.net/addgene:64839
Fio Multiuso de Aço Inoxidável 304	Materiais Avançados de Stanford	SS3368	Fio de aço para fazer anéis
Cloreto de Cálcio Hexahidratado	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Microscópio de Dissecação	Amscope		Dissecar e montar retinas
Tesoura de Dissecação	FST	15024-10
D-(+)-glicose	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Pinças	Dumont	11252-21
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Imaris 10.0.2	Oxford Instruments		Software de análise
Conversor de Arquivos Imaris	Oxford Instruments
Controle de Gel Ultra Supercola Loctite	Loctite	1363589	Cola para fazer anéis
Cloreto de Magnésio Hexahidratado	Sigma-Aldrich	M9272-100G
Papel filtro de membrana MCE (13 mm)	Millipore	HABG01300	0,45 & mu; m Tamanho dos poros
Câmara Microambiental	Tokai Hit	STXG-TIZBX-SET
Microscópio invertido Nikon Eclipse Ti2-E	Nikon
Elementos do NIS	Nikon
Neomicina e Polimixina B Sulfas e Bacitracina Solução Oftalâmica de Zinco, USP	Bausch + Lomb	24208-780-55
Pincel Tamanho 00	Amazon
Prisma 8.0	GraphPad
Solução Oftalmônica de Proparacaína Cloridrato USP, 0,5%	Sandoz	61314-0016-01
Placa de Petri revestida com PDL (35 mm)	Matek	P35GC-1.5-14-C	Cobertura nº 1.5
PSD95_pTagRFP	Addgene	52671	http://n2t.net/addgene:52671
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Monohidrato de Fosfato de Sódio	Sigma-Aldrich	S9638-25G