Construção de Microarray de Tecido à Base de Cola para Pesquisa de Tumores e Doenças

Summary

Este protocolo descreve uma produção de baixo custo e um método de validação eficiente para a construção de TMA à base de cola, fornecendo uma plataforma de diagnóstico patológico conveniente para a pesquisa de tumores e doenças.

Abstract

A tecnologia de microarray de tecido (TMA) é uma plataforma de alto rendimento para a detecção e análise simultâneas de várias amostras de tecido, facilitando a pesquisa eficiente de biomarcadores de tumores e doenças. No entanto, os métodos convencionais de construção de TMA geralmente enfrentam limitações como complexidade operacional, procedimentos demorados e precisão variável. Um método de construção de TMA à base de cola foi desenvolvido para superar esses desafios, oferecendo melhor fixação do núcleo do tecido e maior estabilidade estrutural. A validação sistemática incluiu avaliação histológica (coloração HE), perfil imuno-histoquímico de proteínas-alvo e análise de hibridização in situ fluorescente (FISH). Os resultados demonstraram que o método baseado em cola manteve excelente integridade de corte, melhorou a relação sinal-ruído e garantiu reprodutibilidade consistente de lote para lote. Embora a abordagem seja limitada à operação manual, ela apresenta uma opção confiável e econômica para a produção de TMA de rendimento moderado. Este método é particularmente adequado para ambientes de pesquisa que valorizam a flexibilidade e a diversidade de amostras em vez da automação em larga escala, expandindo a utilidade do TMA em ambientes acadêmicos e de diagnóstico.

Introduction

O Tissue Microarray (TMA) é uma técnica de alto rendimento para analisar amostras de tecido ^1,2,3. Múltiplos núcleos de tecido doador são obtidos e os blocos de parafina do doador são transferidos para blocos de tecido receptor para análise molecular diferencial e comparativa simultânea sob teoricamente as mesmas condições^{de desempenho 2,4}. A maneira clássica de construir um microarray de tecido (TMA) é usar um perfurador para extrair núcleos de tecido de uma amostra de tecido doador e organizá-los sequencialmente em um bloco de parafina receptor. Este método é adequado para blocos de parafina doadores de profundidade semelhante e permite a análise eficiente de múltiplas amostras em uma única fatia, melhorando muito a eficiência do estudo e a consistência dos dados ^5,6,7. No entanto, esse método ainda possui algumas limitações, incluindo o manuseio inadequado do núcleo de tecido durante o processo de incorporação, o que pode resultar em coloração inconsistente das amostras em análises subsequentes⁸.

O segundo método de construção do TMA é o método da fita ^9,10. Este método inverte o processo de construção fundindo o bloco em torno de núcleos verticais invertidos que, após a conclusão, ficam nivelados com o topo do TMA, independentemente do comprimento do núcleo^11,12. No entanto, esse método requer garantir a colocação adequada do núcleo do tecido e a eficácia da fita, além de limitar o número de amostras que podem ser processadas em comparação com as técnicas tradicionais.

Este estudo propõe um método inovador de cola para a construção da TMA, com o objetivo de resolver problemas como a estabilidade insuficiente dos núcleos teciduais e a complexa operação existente nas técnicas tradicionais¹³. Este método usa cola para fixar com precisão vários núcleos de tecido e tem as vantagens de operação simples e forte firmeza da amostra. Comparado com os métodos tradicionais de seccionamento ou fita, o método de cola pode aumentar a taxa de retenção de núcleos de tecido e reduzir custos. Este método é aplicável a estudos clínicos com um tamanho de amostra médio e é particularmente adequado para projetos de pesquisa que requerem ajuste flexível do plano experimental. No entanto, deve-se notar que a capacidade de processamento desse método não atende às demandas de altíssimo rendimento⁹. Enquanto isso, no processo de aplicação real, um conjunto completo de normas de operação padronizadas e sistemas de controle de qualidade deve ser estabelecido. Os operadores precisam receber treinamento sistemático e passar por avaliações profissionais para garantir a padronização das operações técnicas e a repetibilidade dos resultados. Uma análise abrangente indica que essa tecnologia alcança um bom equilíbrio entre flexibilidade operacional, custo-benefício e confiabilidade técnica, e é particularmente adequada para cenários de pesquisa em que os recursos são limitados, mas o controle de qualidade ainda precisa ser garantido.

Protocol

Todos os blocos de doadores foram obtidos de amostras patológicas de arquivo coletadas entre 2016 e 2018 no Hospital Popular Afiliado Huai'an No.1 da Universidade Médica de Nanjing. As amostras foram desidentificadas antes do uso e processadas em conformidade com os protocolos aprovados (o comitê de ética do Hospital Popular Afiliado Huai'an No.1 da Universidade Médica de Nanjing, KY-2024-250-01).

1. Avaliação e marcação do tecido do dador

1. Selecione blocos de tecido com espessura de ≥5 mm e área de ≥15 mm × 15 mm. Garanta uma margem de segurança de 2 mm nas bordas e exclua regiões que exibem necrose, hemorragia ou calcificação para manter a integridade do tecido.
2. Identificação e marcação da área-alvo
   1. Avalie as seções coradas com H & E usando um microscópio óptico. Localize a área alvo por meio de varredura de baixa potência e, em seguida, mude para alta potência para confirmar as características morfológicas celulares. Marque os limites da área de destino nos slides.
   2. Mapeie as coordenadas da área selecionada para a superfície do bloco de parafina para concluir a conversão de marcação.

2. Extração do núcleo do tecido

1. Preparação de punção e pré-tratamento de amostras
   1. Selecione um furador manual de 2 mm de diâmetro e confirme a suavidade de sua aresta de corte e facilidade de operação.
   2. Colocar o bloco de parafina doador numa plataforma fria a 4 °C durante 15 min.
2. Alinhe a agulha verticalmente com o ponto marcado e aplique pressão rotacional constante para atingir a profundidade limite. Evite inclinar ou vibrar durante o processo⁷ (Figura 1A).
3. Gire suavemente a agulha no sentido anti-horário (≤2 rotações/s) para retirá-la. Ejete cuidadosamente o núcleo de tecido da agulha e transfira-o para um poço individual de uma placa pré-resfriada de 96 poços. Registre a localização do núcleo em cada poço (Figura 1B).
   NOTA: Se a parte inferior do núcleo do tecido for irregular, nivele-a com uma lâmina. Após o corte, verifique novamente a integridade.
4. Pré-registre todos os números de doadores e as posições correspondentes do poço da placa ELISA (A1-H12) no formulário de registro. Durante a operação, verifique novamente para garantir uma correspondência estrita entre o número de doadores e as posições dos poços.
5. Inspecione imediatamente os núcleos quanto à integridade. Descarte os machos que estão fraturados, dobrados ou que apresentam desvios de diâmetro >0,1 mm.
   NOTA: Garanta a consistência do comprimento do núcleo (coeficiente de variação, CV ≤5%) e evite arranhões na superfície ou artefatos de compressão.

3. Fixação do núcleo do tecido

1. Use um marcador à prova d'água para desenhar uma grade diretamente na superfície do molde, garantindo linhas claras e uniformemente espaçadas.
   1. Use um molde padrão com uma área inferior efetiva de 3,0 cm × 2,5 cm e reserve uma área limite em branco de 1,5 mm de cada lado.
   2. Use um marcador à prova d'água de ponta fina de 0,5 mm para desenhar nove linhas paralelas igualmente espaçadas horizontal e verticalmente, formando uma grade de posicionamento de 9 × 9 (81 pontos de interseção no total).
      NOTA: Antes de começar, limpe o interior do molde com um cotonete embebido em xileno para remover a parafina residual, que pode causar delaminação. Durante o processo de desenho, use uma régua de aço para garantir uma espessura de linha uniforme e pontos de interseção claramente distinguíveis.
2. Use uma pipeta para extrair 5 μL de cola e coloque-a suavemente no centro da lâmina pré-rotulada para formar uma única gota. Use imediatamente uma pinça fina para pegar verticalmente o núcleo do tecido em um ângulo de 90° e pressione-o lentamente verticalmente na gota de cola (Figura 1C).
3. Insira os núcleos nas interseções de grade correspondentes no molde usando uma pinça. Aplique uma leve pressão por 5 s para garantir uma adesão segura (Figura 1D).
4. Se o núcleo do tecido for deslocado, ajuste-o e reinicie-o imediatamente usando uma pinça fina antes que a cola solidifique (dentro de 30 s). Descarte os núcleos solidificados e desalinhados para manter a qualidade da preparação, preservando ao máximo as amostras preciosas.

4. Instalação de e incorporação de parafina

1. Coloque verticalmente o de tecido sobre o molde de aço, garantindo o contato com as pontas do núcleo sem aplicar compressão. Prenda o usando grampos magnéticos nos quatro cantos e sele as costuras com parafina derretida.
2. Infundir parafina fundida em um ângulo de 45° em zigue-zague, mantendo uma taxa de fluxo de 1 mL/s. Certifique-se de que o nível de parafina exceda as pontas do núcleo em 2 mm (Figura 1E).
3. Resfrie rapidamente o bloco em uma placa fria a 4 ° C por 5 min para formar uma camada de suporte rígida. Transfira o bloco para um ambiente de 22 °C por 20 min para reduzir o estresse interno. Por fim, use uma pistola de calor a 40 °C para alisar suavemente a superfície e eliminar as marcas de encolhimento.
4. Aqueça levemente a parafina para amolecê-la e, em seguida, corte cuidadosamente ao longo das bordas do para soltar o bloco. Levante suavemente o e remova qualquer parafina residual para garantir a integridade dos núcleos de tecido (Figura 1F).

Results

No presente estudo, microarrays de tecido de alta qualidade foram construídos usando o método de cola. Para verificar a eficácia do método, uma série de experimentos foi realizada, incluindo coloração H&E, detecção imuno-histoquímica de proteínas específicas e análise de hibridização in situ fluorescente (FISH). Um componente crítico do processo de construção é a presença de pontos do núcleo do tecido nas posições e distâncias esperadas entre si, o que é avaliado por inspeção visual. A inspeção visual dos bl...

Discussion

Como um método inovador para a construção de microarrays de tecido (TMA), o método de cola tem mostrado vantagens significativas devido à sua facilidade de procedimentos de construção e custo-benefício. Comparado ao método tradicional de arranjo de agulhas, que conta com instrumentos sofisticados^14,15, o método da cola permite a fixação da amostra por colagem, que pode ser feita apenas com ferramentas básicas, reduzindo muito o l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de detecção de câncer de mama HER2	Anbiping	2502001	Kit de detecção de câncer de mama HER2
anticorpo CDHR4 Abcam	ab166914	CDHR4
anticorpo CDK1 anticorpo Abcam		ab265590	CDK1 anticorpo
CRTAC1 anticorpo	Abcam	ab254691	CRTAC1
anticorpo DNASE1L3 Abcam	ab203669		Máquina
de incorporação de	DNASE1L3 P.S.J MEDICAL	BM450A	Máquina de incorporação
Desidratador de tecidos totalmente automático	Leica Biosystems	ASP3005	Desidratador de tecidos totalmente automático
Lâminas de microscópio de vidro	Citotest	250124A1	Lâminas de microscópio de vidro
Cola	TIZO	200	Cola
GPR146 anticorpo	Abcam	ab117104	GPR146
anticorpo IGSF10	Abcam	ab197671	IGSF10 anticorpo
ITIH1 Abcam		ab233032	ITIH1 anticorpo
Lâminas de micrótomo de baixo perfil	Thermo Fisher	3052835	lâminas de micrótomo de baixo perfil
Caneta marcadora	Deli	SK109	Caneta marcadora
micrótomo	Leica Biosystems	de micrótomo	HistoCore BIOCUT
	Solarbio	YA0012	Anticorpo
SMAD9	Abcam	ab262940	Anticorpo SMAD9
Anticorpo TARBP1 Abcam		ab115896	Anticorpo TARBP1
ZCCHC24 Anticorpo	Abcam	ab88756	Anticorpo ZCCHC24