Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Summary

Este protocolo combina citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única para isolar e caracterizar os estados das células microgliais no cerebelo de cérebros de camundongos pós-natais precoces. Ele usa dissociação enzimática, centrifugação de Percoll e imunocoloração para revelar a heterogeneidade da microglia e melhorar a compreensão de seus papéis no desenvolvimento e doença cerebelar.

Abstract

A microglia, as células imunes residentes no cérebro, exibe perfis transcricionais específicos da região e do contexto durante o desenvolvimento e a doença. Este protocolo apresenta dois métodos complementares para o estudo de populações microgliais em tecido cerebelar de camundongos: citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única.

Como o primeiro método usado, o protocolo baseado em citometria de fluxo é otimizado para cérebros pós-natais precoces, garantindo isolamento celular robusto e consistência em condições experimentais. Começa com a dissociação do tecido usando digestão enzimática, seguida pela remoção da mielina por centrifugação com gradiente de densidade de Percoll para produzir uma suspensão de células neurais de alta qualidade e uma estratégia de gating baseada na expressão de CD45 e CD11b. A coloração viva/morta garante a viabilidade celular, e anticorpos conjugados com fluorocromo são usados para traçar o perfil da expressão de marcadores de superfície selecionados na microglia. Os controles de compensação são realizados usando esferas de látex com estratégias de gating validadas usando controle de fluorescência menos um (FMO).

O segundo método envolve o sequenciamento de RNA de célula única usando genômica 10X, seguindo as mesmas etapas de isolamento upstream, que permitem o perfil transcriptômico da microglia em todas as condições. Os clusters microgliais são identificados usando análise de expressão gênica e a análise de expressão diferencial é conduzida entre os grupos experimentais. Um classificador de floresta aleatória é aplicado apenas para distinguir amostras masculinas e femininas quando multiplexadas.

Juntos, esses protocolos reprodutíveis e adaptáveis fornecem uma estrutura robusta para investigar a diversidade microglial no cerebelo durante o desenvolvimento inicial do cérebro e sua potencial alteração após perturbações experimentais.

Introduction

O período pós-natal precoce é uma fase crítica para o desenvolvimento cerebral, caracterizada por processos celulares e moleculares complexos que estabelecem as bases para as funções cognitivas, emocionais e comportamentais¹. No entanto, esse período também é marcado pela vulnerabilidade, pois as interrupções podem alterar as trajetórias do neurodesenvolvimento e levar a distúrbios neurológicos ou psiquiátricos de longo prazo. A microglia, as células imunes residentes no cérebro, desempenham um papel central na formação do cérebro em desenvolvimento por meio de poda sináptica, fagocitose, vigilância imunológica e respostas a insultos ambientais ^2,3. Essas células exibem notável plasticidade, adotando perfis transcricionais que variam de acordo com a região cerebral, estágio de desenvolvimento e contexto patológico ^4,5.

A análise precisa da ativação da microglia no cérebro em desenvolvimento requer metodologias robustas e repetíveis capazes de analisar seus fenótipos dinâmicos no contexto de tecidos cerebrais imaturos. A citometria de fluxo fornece uma solução confiável, permitindo a caracterização de alto rendimento de populações celulares e expressão de marcadores⁶. No entanto, sua aplicação no estudo da micróglia de cérebros pós-natais precoces é tecnicamente desafiadora devido à natureza delicada do tecido e à necessidade de protocolos eficientes de isolamento e enriquecimento celular ^7,8.

O protocolo apresentado aqui combina citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) para isolar e caracterizar a micróglia de cérebros de camundongos pós-natais precoces, com foco particular no cerebelo do dia 3 pós-natal (P3) ao dia 30 pós-natal (P30)⁹, uma região e estágio de desenvolvimento para o qual as referências metodológicas detalhadas permanecem limitadas.

Esse fluxo de trabalho inclui dissociação enzimática, centrifugação por gradiente de densidade para remoção de detritos e enriquecimento celular e imunocoloração usando um painel de marcadores extracelulares e intracelulares. Para caracterizar a diversidade da microglia, uma variedade de marcadores de superfície e intracelulares é empregada^10,11. Em vez de atribuir rótulos fixos (inflamatórios ou reparadores), o protocolo define subpopulações com base em perfis discretos de expressão de marcadores. Por exemplo, microglia expressando CD80, CD86 e iNOS, CD206 e Arg1, CD86 e CD64 ou CD163 e CD206 são identificados e analisados como subconjuntos molecularmente distintos. Esses marcadores refletem diferentes estados de micróglia ativada^10,11 e são apresentados como perfis de expressão.

Essa estratégia de gating multiparamétrico permite a identificação precisa de subconjuntos microgliais com base na expressão de marcadores de superfície, oferecendo uma estrutura simplificada para analisar a heterogeneidade imunológica durante o desenvolvimento cerebral pós-natal. Para estender o perfil fenotípico e descobrir a diversidade transcricional, o sequenciamento de RNA de célula única é realizado após o isolamento celular. Este estudo estabelece um fluxo de trabalho consistente e escalável para avançar na compreensão dos processos de neurodesenvolvimento e do impacto a longo prazo da ativação microglial. Ao integrar citometria de fluxo otimizada e scRNA-seq dentro de uma estrutura informada de desenvolvimento e regionalmente, este protocolo serve como uma ferramenta poderosa para investigar a biologia microglial no início da vida e sua relevância para os resultados do neurodesenvolvimento.

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética do Centro de Pesquisa CHU Sainte-Justine e estão em conformidade com as diretrizes e políticas do Centro de Pesquisa Ste-Justine e da Universidade de Montreal (Montreal, Quebec, Canadá).

1. Isolamento celular do cérebro

1. Após os procedimentos de anestesia / eutanásia, remova rapidamente todo o cérebro da cavidade craniana e coloque-o em um tubo de 15 mL contendo meio de cultura de células microgliais (consulte a Tabela de Materiais). Mantenha o tubo no gelo. Repita o mesmo procedimento para ratos adicionais, se necessário.
   Todos os camundongos usados neste estudo foram derivados de colônias de reprodução internas no laboratório do Dr. Tremblay. Os camundongos experimentais foram gerados pelo cruzamento de camundongos B6.129-Cx3Cr1 ^{CreERT2-EYFP/WT} com camundongos B6-Rosa26^iDTR/WT, ambos originalmente provenientes da Jackson Laboratories. Essa estratégia de reprodução produziu descendentes heterozigotos para o alelo IDTR, permitindo a depleção condicional de células que expressam Cx3Cr1 (principalmente microglia) por meio de um sistema Cre-loxP induzível por tamoxifeno. Antes da coleta de tecido, os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina (150 μg/g) e xilazina (10 μg/g). A eutanásia foi realizada por decapitação sob anestesia profunda, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.
2. Preserve todo o cérebro ou prossiga com a dissecação de regiões específicas, se desejar. Realize a dissecção em uma pequena placa de Petri contendo meio de cultura de células microgliais (consulte a Tabela de Materiais) em gelo para manter a viabilidade celular.
   NOTA: Este protocolo foi validado para todo o cérebro e cerebelo de P1 a P30.
3. Remova o meio de cultura de células microgliais e corte finamente o tecido cerebral usando um bisturi em uma placa de Petri.
4. Para a digestão enzimática , transfira o tecido homogeneizado para tubos de 5 mL. Adicione 2 mL de HBSS (1x) suplementado com 2 mg / mL de colagenase D e 14 μg / mL de DNase I (ver Tabela 1). Sele as tampas dos tubos com parafilme. Incubar os tubos em banho-maria a 37 °C durante 15 min, agitando o tubo de 5 em 5 min. Para interromper a digestão, coloque os tubos no gelo.
5. Passe o homogeneizado por um filtro de malha metálica de 140 μm (ver Tabela de Materiais) para remover detritos grandes. Use um pilão de vidro para dissociar as células.
6. Lave o filtro várias vezes com meio de cultura de células microgliais (3 mL por lavagem).
7. Recolha o filtrado com uma pipeta de 10 ml e transfira-o para um tubo de 15 ml. Centrifugar a solução a 500 g durante 7 min a 4 °C.
8. Rejeitar o sobrenadante invertendo cuidadosamente o tubo. Ressuspenda o pellet raspando suavemente em uma prateleira.
9. Adicione 10 mL de uma solução de meio coloidal à base de sílica a 37% (ver Tabela 1) para remover mielina e detritos. Centrifugar a solução a 500 g durante 10 min a 4 °C com uma força de travagem mínima.
10. Aspire a camada de mielina no topo da solução usando uma pipeta de 10 mL.
    NOTA: A aspiração contínua evita que a mielina se misture de volta à solução.
11. Lave as células adicionando 10 mL de HBSS (1x) e centrifugue a 500 × g por 7 min a 4 °C.
12. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet raspando suavemente com um rack e, em seguida, adicione 10 mL de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (consulte a Tabela 1). Centrifugar a solução a 500 g durante 10 min a 4 °C.
13. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o projétil final e retenha as células. As células isoladas estão agora prontas para coloração por citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única.
14. Para isolamento de sequenciamento de RNA de célula única, conte as células ao microscópio usando reagentes fluorescentes estáveis em bancada (consulte a Tabela de Materiais) para distinguir células nucleadas vivas e mortas, juntamente com o Azul de Tripano (consulte a Tabela de Materiais). Garantir que as células estejam em excelentes condições, com viabilidade de até 90%, e atingir uma concentração de 1000 células/μL). As próximas etapas são descritas na seção 9.1.
    NOTA: Mantenha os tubos no gelo durante todo o protocolo. Todas as fases de centrifugação devem ser executadas a 4 °C com um travão máximo, com excepção da etapa de Percoll, em que é especificado um travão mínimo. Para obter melhores resultados, execute todo o protocolo no mesmo dia. Para o filtro de protocolo de sequência de RNA de célula única todas as soluções usadas para isolamento, na etapa 1.11, use HBSS (1x) para a segunda lavagem e, na etapa 1.12, retenha 70-100 μL da solução celular.

2. Protocolo de coloração extracelular por citometria de fluxo

1. Transfira todas as células para uma placa de 96 poços com fundo cônico (consulte a Tabela de Materiais). Centrifugar a placa a 500 g durante 5 min a 4 °C.
2. Inverta rapidamente a placa para remover o sobrenadante em um movimento.
3. Ressuspenda o sedimento celular em 25 μL de solução de bloqueio (ver Tabela 1). Incubar por 15 min em temperatura ambiente (RT).
4. Para preparar a mistura de coloração de anticorpos extracelulares (ver Tabela 2), centrifugue estoques de anticorpos a 10.000 × g para remover agregados potenciais. Sem perturbar o pellet, aspire cuidadosamente o volume desejado do sobrenadante para preparar a mistura de coloração e ajuste o volume para 25 μL com o FACS Buffer.
5. Adicione 25 μL da mistura de anticorpos extracelulares a cada poço. Incubar por 20 min em RT.
   NOTA: Antes do uso experimental, todos os anticorpos foram titulados em suspensões cerebelares (ou cerebrais) de células únicas para determinar a concentração ideal de trabalho. A titulação foi realizada por diluições seriadas para gerar uma curva de saturação, e a diluição correspondente a um platô de sinal com fundo mínimo foi selecionada para o estadiamento do sinal.
6. Sem misturar, adicione 150 μL de tampão FACS aos poços. Centrifugar a placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Inverter a placa para remover o sobrenadante num único movimento.
7. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão FACS. Centrifugar a placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Inverter a placa para remover o sobrenadante num único movimento. Repita a lavagem mais uma vez usando 200 μL de tampão FACS nas mesmas condições.

3. Coloração intracelular

1. Ressuspenda as células em 100 μL de tampão saponina-paraformaldeído (PFA) (ver Tabela 1) para fixar e permeabilizar as células. Incubar durante 10 min à temperatura de saída, protegido da luz.
2. Sem misturar, adicione 100 μL de tampão saponina (ver Tabela 1). Centrifugar a placa a 500 × g durante 6 min a 4 °C. Inverter a placa para remover o sobrenadante num único movimento.
3. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão saponina. Prepare os controles de compensação adicionando 20 μL de grânulos (consulte a Tabela de Materiais) a 11 poços vazios. Centrifugar a placa a 500 × g durante 6 min a 4 °C. Inverter a placa para remover o sobrenadante num único movimento.
4. Para preparar a mistura de coloração de anticorpos intracelulares (ver Tabela 3), centrifugue estoques de anticorpos a 10.000 × g para remover agregados potenciais. Sem perturbar o pellet, aspire cuidadosamente o volume desejado do sobrenadante para preparar a mistura de coloração e ajuste o volume para 50 μL com tampão de saponina.
5. Ressuspenda o pellet em 50 μL de mistura de anticorpos intracelulares (ver Tabela 3). Adicione 1 μL de cada anticorpo aos poços do grânulo. Incubar por 30 min em RT.
6. Sem misturar, adicione 150 μL de tampão de saponina a cada poço de amostra de célula e adicione 100 μL de tampão FACS a cada poço contendo os controles de compensação para lavar as contas. Centrifugar a placa a 500 × g durante 6 min a 4 °C. Inverter a placa para remover o sobrenadante num único movimento.
7. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão saponina e ressuspenda os controles de compensação em 200 μL de tampão FACS. Centrifugar a placa a 500 × g durante 6 min a 4 °C. Inverter a placa para remover o sobrenadante num único movimento. Repita a lavagem mais uma vez usando 200 μL de tampão saponina nas mesmas condições.
8. Ressuspenda as células e os controles de compensação em 200 μL de tampão FACS. Transferir a suspensão para um tubo FACS e conservá-la a 4 °C até à aquisição da citometria de fluxo.
   NOTA: Certifique-se de que todas as etapas envolvendo reagentes sensíveis à luz sejam realizadas em condições mínimas de luz. Um poço de esferas não contém anticorpos, o que corresponde ao tubo de esferas não corado.

4. Aquisição por citometria de fluxo

1. Ligue o citômetro de fluxo e depois o computador.
2. Abra o software do citômetro de fluxo e inicie a inicialização de fluidos selecionando Executar na guia citômetro.
3. Crie uma nova pasta de experimento clicando em Nova pasta e atribuindo um nome. Em seguida, clique em Novo experimento para nomear o experimento e selecione Novo tubo para adicionar um espécime e um tubo de amostra.

5. Configure controles de remuneração

1. Prepare contas de compensação de coloração única para cada fluorocromo usado no painel, juntamente com um controle não corado.
2. Carregue os tubos de compensação no citômetro. Defina as tensões de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para aproximadamente 250.
3. Ajuste as tensões para cada canal fluorescente para que a população negativa esteja na primeira década do eixo.
4. Adquira pelo menos 5.000 eventos por tubo.
5. Use a matriz de compensação para ajustar a sobreposição espectral até que todos os picos positivos estejam claramente separados da população negativa e centralizados acima de 10⁴ no respectivo eixo.
   NOTA: Os controles de compensação devem ser realizados para cada experimento, pois as configurações do citômetro ou o desempenho do fluorocromo podem afetar significativamente a sobreposição espectral. Embora os controles de compensação baseados em células sejam recomendados em algumas aplicações de tecido cerebral, contas de captura de anticorpos foram usadas neste protocolo devido ao menor número de microglias obtidas do cerebelo de camundongo P3, o que limita a viabilidade da compensação baseada em células. A fluorescência de anticorpos foi inicialmente validada em células derivadas do cérebro e considerada comparável a sinais baseados em contas. Inclua uma suspensão de células derivadas do cérebro não coradas durante a otimização inicial do painel para avaliar a autofluorescência do tecido e estabelecer os níveis de sinal da linha de base. Esse controle é essencial para definir adequadamente as populações negativas em cada canal fluorescente.

6. Preparar e adquirir controles FMO

1. Para cada marcador-chave, prepare um controle de fluorescência menos um (FMO) que inclua todos os anticorpos, exceto o que está sendo testado.
2. Execute os controles FMO usando as mesmas configurações de aquisição que as amostras totalmente coradas.
3. Use gráficos FMO para definir limites de passagem para populações baixas ou sobrepostas e para discriminar verdadeiros positivos do ruído de fundo.
   NOTA: Os controles FMO devem ser realizados durante a otimização inicial do painel para definir limites de passagem precisos e confiáveis, especialmente em tecidos com alta autofluorescência, como o cérebro. Se o painel de coloração, as configurações do instrumento ou as condições experimentais forem modificados, os controles FMO devem ser repetidos. Para experimentos subsequentes usando as mesmas configurações validadas de painel e citômetro, os limites de passagem previamente definidos podem ser reutilizados para garantir a consistência entre as réplicas biológicas.

7. Preparar e adquirir controles de Isotype

1. Manchar a amostra de controlo com anticorpos de controlo de isotipo combinados em fluorocromo e concentração com os anticorpos de ensaio.
2. Adquira dados usando as mesmas configurações do citômetro.
3. Use controles de isotipo apenas para avaliar a potencial ligação não específica, particularmente no caso de marcadores intracelulares ou anticorpos mal caracterizados. Não use controles de isotipo para gating, pois eles não refletem a mesma cinética de ligação que anticorpos específicos.
   NOTA: Os controles de isotipo não são adequados para gating e não devem ser usados para definir populações. Seu uso é opcional e deve ser reservado para validar a especificidade do anticorpo em casos selecionados.

8. Estratégia de controle por citometria de fluxo

1. Crie os seguintes gráficos de pontos para o fechamento sequencial:
   FSC-A vs. SSC-A para excluir detritos
   FSC-A vs. FSC-H para selecionar singletos.
   FSC-A vs. Amcyan (corante de viabilidade) para bloquear células vivas.
2. Identifique a microglia como CD11b ⁺ CD45 ⁺ usando CD11b (FITC) vs CD45 (AF700).
   NOTA: Devido ao estágio de desenvolvimento (P3-P15), ao contexto inflamatório e à digestão enzimática, TMEM119 e P2RY12 não foram confiáveis para separar claramente a micróglia de outras populações mieloides por citometria de fluxo. A estratégia de gating CD11b ⁺ CD45 ⁺ , previamente validada no cérebro pós-natal, foi, portanto, usada para identificar populações de micróglia, minimizando a contaminação. Em condições de controle, o rendimento típico varia de 30.000 a 200.000 células microgliais por cérebro inteiro, de P3 a P15. Para experimentos focados especificamente no cerebelo, o rendimento médio é de aproximadamente 5.000 células microgliais por cérebro.
3. Use os controles FMO para definir limites de passagem para marcadores de ativação.
4. Identifique subpopulações de microglia com base na expressão de marcadores relacionados ao sistema imunológico:
   CD80⁺ (436 super brilhante)
   CD86⁺ (PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. Caracterizar ainda mais os subconjuntos de microglia por combinações de expressão de marcadores:
   CD206⁺ (APC)^{então Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE)^{depois CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (600 super brilhante) ^{e depois CD206+} (APC)
   NOTA: Combinações de marcadores são usadas para descrever a heterogeneidade molecular dentro da população microglial. Esses subconjuntos são relatados com base apenas na expressão do marcador e não recebem papéis funcionais específicos, de acordo com os padrões atuais que reconhecem a plasticidade microglial e os fenótipos dependentes do contexto.
6. Carregar amostra experimental. Defina FSC como 300 e SSC como 200. Use uma taxa de fluxo baixa e registre o número desejado de eventos.
7. Após a aquisição, lave o citômetro e exporte os dados como . FSC para análise.
8. Analise os dados usando o software do citômetro de fluxo.

9. Amostra de sequenciamento de RNA de célula única

1. Usando o mesmo protocolo de isolamento celular descrito para citometria de fluxo (consulte a etapa 1.14), ressuspenda as células dissociadas no tampão FACS. Use o tampão FACS nos tubos de coleta e em todas as etapas de manuseio subsequentes para manter a estabilidade da célula.
2. Não execute a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) se o objetivo for capturar todos os tipos de células de uma região do cérebro. No entanto, se o experimento exigir enriquecimento para microglia, inclua uma etapa de classificação FACS antes do sequenciamento.
3. Avalie imediatamente a viabilidade celular usando corantes de viabilidade fluorescente estáveis em bancada e azul de tripano (consulte a Tabela de Materiais). Conte as células ao microscópio usando um hemocitômetro (consulte a Tabela de Materiais).
4. Verifique se a suspensão celular apresenta uma viabilidade de pelo menos 90% e ajuste para uma concentração final de aproximadamente 1.000 células/μL antes de prosseguir com o sequenciamento de RNA de célula única.
5. Mantenha todas as amostras no gelo e processe imediatamente após a dissociação para minimizar o estresse celular e as alterações transcricionais.
6. Multiplexar as amostras em pares seguindo as instruções do fabricante.
   NOTA: Um macho e uma fêmea do mesmo grupo experimental foram agrupados para reduzir os custos experimentais.
7. Prepare as bibliotecas scRNAseq (consulte Tabela de materiais) e siga as diretrizes recomendadas do fabricante.
   NOTA: A preparação da biblioteca foi realizada pela Plataforma de Genômica do Instituto de Pesquisa em Imunologia e Câncer (IRIC) da Universidade de Montreal.
8. Sequencie as bibliotecas scRNA-seq usando um sistema de sequenciamento a uma profundidade média de 3200M de leituras por pista.
   NOTA: O sequenciamento foi realizado no Genome Quebec em Montreal.

10. Análise de sequenciamento de RNA de célula única

1. Realize a análise de contagem de identificadores moleculares exclusivos (UMI) usando o software Cell Ranger da 10X Genomics (v8.0.0) com o genoma de referência Mouse GRCm39 2024-A. Use o pacote Seurat R (v5.1) para análise downstream.
2. Realize o controle de qualidade excluindo células com RNA mitocondrial excedendo, por exemplo, 30% do RNA total (Figura 1A) ou um limite mais rigoroso escolhido para remover células com estresse potencial. Filtre células de baixa qualidade com log10GenesPerUMI maior que 0,75 (Figura 1B), contagens de características únicas ("nUMI") abaixo de 500 e número de genes detectados por célula ("nGene") maior que 300 (Figura 1C). Em seguida, remova as gotículas com o pacote "scDblFinder" em R. Com um gráfico de correlação do nUMI e nGene mostrando os limites, o efeito de filtragem agora deve ser visível (Figura 1D).
3. Reduza os efeitos do lote identificando 2.000 genes altamente variáveis por amostra usando a função SelectIntegrationFeatures da Seurat.
4. Integre conjuntos de dados usando análise de correlação canônica (CCA) e execute a análise de componentes principais (PCA) para redução de dimensionalidade. Use a função RunPCA com 50 componentes principais (PCs), dimensionando os dados e regredindo fontes indesejadas de variação (por exemplo, conteúdo mitocondrial). Avalie o número de PCs retidos com base no gráfico de cotovelo e na análise JackStraw.
5. Visualize clusters usando o algoritmo de aproximação e projeção de variedade uniforme (UMAP) por meio da função Seurat RunUMAP . Identifique perfis de expressão gênica específicos do cluster com a função FindAllMarkers . Anote clusters com base em assinaturas transcricionais por referência cruzada de genes marcadores identificados com recursos de célula única selecionados, como PanglaoDB e CellMarker (Figura 2). Os tipos de células, incluindo a microglia, são inferidos a partir desses perfis transcriptômicos e não de marcadores de superfície predefinidos.

11. Separação celular baseada no sexo

1. Identifique células masculinas e femininas com base na expressão de genes específicos do sexo: quatro específicos do sexo (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) e três específicos do sexo masculino (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. Classifique as populações masculinas e femininas filtrando as células que expressam contagens normalizadas de UMI > 1 para qualquer um desses genes usando a função Subconjunto de Seurat.
3. Gere objetos Seurat subdefinindo células masculinas e femininas separadamente. Armazene e analise esses objetos de forma independente para comparações downstream.
4. Valide a classificação visualizando a expressão gênica específica do sexo usando as funções FeaturePlot e VlnPlot , garantindo uma separação clara entre as populações de células masculinas e femininas.
   NOTA: As etapas 12.1 e 12.2 devem ser executadas somente quando a amostra tiver sido multiplexada misturando um macho e uma fêmea.

12. Classificação da micróglia baseada em modelo estatístico

1. Crie cinco modelos estatísticos em R (floresta aleatória, regressão logística, Bayes ingênuo, máquina de vetores de suporte, árvore de decisão) usando um conjunto de treinamento de ~1.000 células com rótulos de grupo conhecidos.
2. Avalie o desempenho do modelo usando validação cruzada de 10 vezes e curvas ROC (receiver operating characteristic) (Figura 3). Identifique os principais genes que contribuem para a classificação usando a função FindAllMarkers no Seurat.
3. Selecione o modelo com a área mais alta sob a curva ROC (AUC). O modelo de floresta aleatória foi selecionado com base em sua pontuação AUC superior.
4. Aplique o modelo selecionado a células não classificadas usando a função de previsão do pacote RandomForest R. Mescle as classificações previstas com conjuntos de dados anotados anteriormente no Seurat usando merge.
5. Valide as classificações visualizando a expressão gênica do marcador com FeaturePlot e VlnPlot. Para garantir a consistência das identidades celulares previstas, avalie os enriquecimentos do conjunto de genes marcadores sobrepostos antes e depois de adicionar as células classificadas com um teste estatístico apropriado (por exemplo, teste exato de Fisher).

13. Análise da expressão gênica diferencial da microglia

1. Realize a análise de expressão gênica diferencial (DEG) entre dois grupos específicos de interesse usando a função Seurat "FindMarkers", com ident.1 representando o grupo de interesse e ident.2 representando o grupo de referência.
   NOTA: A saída lista genes que são diferencialmente expressos em ident.1 em relação a ident.2. Nesse contexto, os genes regulados positivamente são aqueles com maior expressão no ident.1 em comparação com o ident.2, enquanto os genes regulados negativamente apresentam menor expressão no ident.1. Suas comparações são usadas para gerar gráficos de vulcões e interpretar mudanças transcricionais específicas da condição.
2. Identifique genes diferencialmente expressos (DEGs) com um valor P ajustado≤ 0,05. Para comparações entre dois grupos específicos, use a função FindAllMarkers com os seguintes critérios: genes expressos em pelo menos 10% das células (min.pct = 0,1) e um limite de mudança de dobra log2 de 0,25 (logfc.threshold = 0,25). Para comparações de vários grupos em todas as microglias, use a função FindAllMarkers com os mesmos parâmetros. Genes com um valor P ajustado ≤ 0,05 são considerados significativamente expressos diferencialmente. Para visualizar padrões de expressão DEG, gere um gráfico de vulcão usando a função integrada no pacote EnhancedVolcano (Figura 4).
3. Compare os resultados da citometria de fluxo examinando primeiro os marcadores de citometria usados para encontrar a microglia, especificamente CD45⁺ e CD11b⁺, que correspondem aos genes PtprceItgam. Confirme a expressão gênica usando as funções FeaturePlot em Seurat.
4. Avalie os marcadores comumente associados a estados microgliais distintos, incluindo CD80eNOS2, bem como Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163. Use as funções Seurat FeaturePlot e DotPlot para visualizar sua expressão em clusters de células.
5. Gere um gráfico de pontos usando a função DotPlot no Seurat para resumir expressões de marcador e validar a classificação da população.

Results

Este protocolo utiliza efetivamente a citometria de fluxo para caracterizar populações de células microgliais em amostras de cérebro de camundongos, com base na expressão de marcadores de superfície e intracelulares selecionados. As seções a seguir detalham os resultados obtidos nas principais etapas do fluxo de trabalho, destacando a distribuição e heterogeneidade dos subconjuntos de microglia em resposta às condições experimentais.

Validação da estratégia de compensação e gating
Contas de compensação foram usadas para calibrar os sinais de fluorescência e corrigir a sobreposição espectral entre os fluorocromos. As populações positivas e negativas para cada fluorocromo foram claramente separadas, permitindo a geração precisa da matriz de compensação. Os limiares de bloqueio foram inicialmente validados usando o controle Fluorescence Minus One (FMO) durante a otimização do painel para distinguir o sinal verdadeiro do fundo, principalmente para marcadores ruins ou sobrepostos. Esses limiares foram posteriormente reutilizados em experimentos usando o mesmo painel de coloração e configurações de citômetro para garantir a consistência. Controles de isotipo foram incluídos para monitorar possíveis ligações não específicas, particularmente para marcadores intracelulares, mas não foram usados para decisões de gating.

Identificação de células microgliais
A estratégia de bloqueio de células vivas / mortas (Amcyan) excluiu com sucesso as células mortas. A estratégia de gating isolou efetivamente as populações de células microgliais com base na expressão de CD45 (AF700) e CD11b (FITC). Os parâmetros de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) foram otimizados (FSC = 300, SSC = 200) para centralizar a população de microglia dentro do gráfico de pontos (Figura 5).

Fenotipagem de células microgliais
A análise de gráficos de pontos permitiu a identificação de subpopulações de microglia com base na expressão diferencial de marcadores de superfície e intracelulares. Usando estratégias específicas de gating no software FlowJo, um subconjunto de células microgliais expressando CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) e iNOS (PE-eFluor 610) foi identificado (Figura 6A). O duplo gating também foi usado para definir subconjuntos que expressam CD206 (APC) e Arg1 (PE-Cy7) (ver Figura 6B). Populações adicionais foram caracterizadas pela co-expressão de CD86 (PE) e CD64 (PerCP-eFluor 710), bem como CD163 (Super Bright 600) e CD206 (APC) (Figura 6C,D). Esses perfis fenotípicos refletem a heterogeneidade definida por marcadores dentro da população de microglia e demonstram a capacidade deste protocolo de distinguir vários subconjuntos transcricional e imunologicamente distintos sem inferir estados funcionais fixos.

Análise de célula única da Microglia
A Aproximação e Projeção Uniforme de Variedades (UMAP) foi usada para visualizar a heterogeneidade celular e identificar os aglomerados de células microgliais entre outros tipos de células cerebrais. Cada ponto representa uma única célula e o cluster é codificado por cores com base na similaridade transcricional (Figura 2).

A análise de expressão diferencial foi realizada dentro do cluster de microglia para identificar genes modulados em condições experimentais. Genes com um valor de P ajustado ≤ 0,05 foram considerados diferencialmente expressos.

Um gráfico de vulcão foi gerado para visualizar esses genes diferencialmente expressos de células microgliais, destacando aqueles com alta mudança de dobra e significância estatística (Figura 4).

Para comparar esses resultados de células únicas com dados de citometria de fluxo, a expressão dos marcadores de microglia CD45 e CD11b (Ptprc e Itgam) foi examinada. Um UMAP mostra sua expressão em diferentes populações de células (Figura 7).

Finalmente, a expressão de marcadores relacionados ao sistema imunológico selecionados foi avaliada para caracterizar a heterogeneidade transcricional entre as células microgliais. Um gráfico de Violino exibe a expressão de genes como CD80 e NOS-, bem como Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163 no nível de célula única (Figura 8). Esses padrões de expressão de marcadores permitem a comparação com o perfil baseado em citometria de fluxo e destacam a diversidade molecular de subconjuntos microgliais em condições experimentais.

Figura 1: Controle de qualidade de dados transcriptômicos de célula única. (A) Distribuição do conteúdo de RNA mitocondrial entre as células. Células com RNA mitocondrial de >30% foram excluídas para remover células potencialmente estressadas ou moribundas. (B) Células com log10GenesPerUMI > 0,75 foram filtradas para garantir uma proporção consistente de gene para UMI e reduzir o ruído de bibliotecas de baixa complexidade. (C) Células com menos de 500 transcritos detectados (nUMI) ou mais de 300 genes detectados (nGENE) também foram excluídas para eliminar células múltiplas ou de baixa qualidade. (D) Gráfico de correlação de NUMI versus nGene ilustrando o impacto dos limiares de filtragem. Os gibões detectados foram removidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visualização UMAP de transcriptomas de célula única. Gráfico UMAP mostrando a distribuição de células individuais com base em perfis transcriptômicos obtidos de dois animais individuais. Cada ponto representa uma célula, codificada por cores pela identidade do cluster. O aglomerado de células microgliais é identificado entre outras populações de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Curva ROC do classificador Random Forest avaliada por validação cruzada. Curva ROC (Receiver Operating Characteristic) que ilustra o desempenho do modelo Random Forest usado para distinguir a microglia de outros tipos de células cerebrais com base em perfis de expressão gênica. O modelo foi treinado em um conjunto de ~ 1000 células com rótulos conhecidos e avaliado usando validação cruzada de 10 vezes. Dentre os cinco modelos estatísticos testados (Random Forest, regressão logística, Naive Bayes, support vector machine e decision tree), o modelo Random Forest obteve o maior desempenho de classificação. A área sob a curva (AUC) reflete a precisão do modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise diferencial da expressão gênica em células microgliais. Gráfico de vulcão representando a mudança de log 2 vezes versus o valor P ajustado para genes diferencialmente expressos na microglia entre os dois grupos experimentais (controle vs. lesão cerebral cerebelar). O gene regulado positivamente é mais altamente expresso no grupo de interesse (ident.1), e os genes regulados negativamente mostram expressão reduzida em comparação com o grupo de referência (ident.2). Os principais genes significativamente expressos diferencialmente são rotulados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Estratégia de gating para identificação de microglia por citometria de fluxo. (A) Estratégia de gating aplicada a células cerebelares de um camundongo controle pós-natal dia 3 (P3). (B) Singlets foram selecionados para excluir duplets. (C) As células viáveis foram identificadas usando um corante de viabilidade; eventos com FSC-A baixo foram excluídos para remover detritos e garantir a análise de células intactas. (D) Microglia foram identificadas como CD45⁺ e CD11b⁺ com duas populações distintas: CD45 low-CD11b^int para microglia quiescente e CD45^int -CD11b^high para microglia ativada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Caracterização de perfis de expressão de marcadores de microglia por citometria de fluxo. (A) Gating sequencial de células CD45 ⁺ CD11b ⁺ com base na expressão de CD80, CD86 e iNOS. (B) Identificação de um subconjunto expressando CD206, seguido de gating com base na expressão de Arg1. (C) Identificação de um subconjunto que expressa CD86, seguido de gating com base na expressão de CD64. (D) Identificação de um subconjunto que expressa CD163, seguido de gating com base na expressão de CD206. Essas estratégias de gating ilustram a heterogeneidade fenotípica das populações de micróglia com base na expressão de marcadores de superfície e intracelular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Confirmação da identidade da microglia usando a expressão de Itgam e Ptprc em dados de sequenciamento de RNA de célula única. O UMAP exibe a paisagem transcricional das células cerebelares em P15, com a expressão gênica de Itgam e Ptprc sobreposta aos clusters. A co-expressão desses marcadores mieloides canônicos suporta a identificação de populações de micróglias e se alinha com marcadores usados na citometria de fluxo, fornecendo validação cruzada entre análises transcriptômicas e de nível proteico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Perfis de expressão de genes relacionados ao sistema imunológico selecionados em células microgliais identificadas por sequenciamento de RNA de célula única. Os gráficos de violino exibem a distribuição da expressão gênica para CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163 em células microgliais individuais. Esses marcadores são comumente associados a processos relacionados ao sistema imunológico e ilustram a heterogeneidade transcricional observada na população microglial. Os dados são mostrados para condições de controle e lesão cerebral cerebelar (CBI). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição das soluções usadas para isolamento e coloração de células neurais. Esta tabela fornece uma composição detalhada das soluções necessárias para isolamento e coloração celular, incluindo suas respectivas concentrações e componentes. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Concentrações de mistura de anticorpos para coloração extracelular. Esta tabela detalha as concentrações de anticorpos e solução viva/morta usada para coloração extracelular, especificando os volumes e diluições necessários para cada anticorpo na mistura de coloração para uma amostra. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Concentrações de mistura de anticorpos para coloração intracelular. Esta tabela detalha as concentrações de anticorpos usados para coloração intracelular, especificando os volumes e diluições necessários para cada anticorpo na mistura de coloração para uma amostra. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Este estudo apresenta um protocolo detalhado e otimizado que combina citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) para o isolamento e caracterização de células microgliais durante o desenvolvimento cerebral pós-natal inicial. Embora a citometria de fluxo continue sendo uma técnica econômica e acessível, sua integração com a transcriptômica de célula única fornece informações complementares, vinculando a expressão de marcadores em nível de proteína com perfis transcricionais em nível de gene. O protocolo aborda os desafios técnicos específicos do tecido cerebral imaturo, incluindo dissociação eficiente, remoção de detritos e mielina e estratégias otimizadas de imunocoloração, para garantir reprodutibilidade e confiabilidade na análise de populações microgliais em pontos-chave de desenvolvimento.

A citometria de fluxo foi usada para identificar subconjuntos microgliais com base na expressão de marcadores de superfície e intracelulares selecionados. Em vez de inferir estados funcionais, os subconjuntos foram distinguidos por seus perfis de expressão de marcadores, como CD80 ⁺ / CD86 ⁺ / iNOS ⁺ ; CD206⁺/Arg1⁺ ; Fenótipos CD86⁺/CD64⁺ ou CD163⁺/CD206⁺ . Essas populações definidas por marcadores refletem a heterogeneidade molecular dentro do compartimento da microglia e fornecem uma abordagem prática para caracterização de alto rendimento. Embora essas classificações baseadas em marcadores de superfície possam não capturar toda a complexidade da diversidade da microglia, elas permanecem informativas, especialmente em contextos em que ferramentas moleculares de alta dimensão podem não estar disponíveis. Classificações binárias, como o paradigma M1/M2, foram deliberadamente evitadas, em reconhecimento à natureza dependente do espectro e dependente do contexto dos fenótipos microgliais, conforme descrito na literatura recente¹².

Essas observações são consistentes com estudos anteriores que destacam o papel da microglia tanto na maturação cerebral normal quanto na resposta a estímulos ambientais ou patológicos^13,14. A capacidade de diferenciar a heterogeneidade da microglia oferece informações valiosas sobre como a polarização das células microgliais pode contribuir para distúrbios do neurodesenvolvimento^15,16.

Embora o sequenciamento de RNA de célula única ofereça maior resolução e permita a identificação de subpopulações de células microgliais transcricionalmente distintas, seu custo e complexidade analítica limitam sua acessibilidade. No conjunto de dados atual coletado no dia 15 pós-natal após lesão perinatal, o pico da resposta inflamatória é amplamente resolvido, resultando em um baixo número de micróglias ativadas. Consequentemente, técnicas de redução de dimensionalidade, como UMAP, não recuperaram subclusters microgliais bem separados, e a análise transcricional em nível de cluster não foi incluída neste manuscrito de protocolo.

Uma inovação significativa deste protocolo é sua otimização para isolar e caracterizar células microgliais do cerebelo durante os estágios pós-natais iniciais (P3 a P30). Essa região e o contexto específico da idade apresentam desafios distintos, incluindo baixo rendimento celular, conteúdo de mielina e aumento da fragilidade tecidual. Para lidar com essas restrições, o protocolo integra um fluxo de trabalho de dissociação adaptado, remoção eficiente de detritos e mielina e condições de imunocoloração cuidadosamente ajustadas adequadas para tecido cerebelar de pequeno volume. Apesar do crescente reconhecimento da micróglia cerebelar como funcional e transcricionalmente distinta daquelas em outras regiões do cérebro, protocolos detalhados para seu isolamento e análise permanecem limitados. O método atual oferece um fluxo de trabalho confiável e acessível, particularmente adaptado para estudos de desenvolvimento da micróglia cerebelar.

O principal objetivo deste manuscrito é fornecer uma estrutura metodológica reprodutível e adaptável, em vez de relatar descobertas biológicas específicas. O fluxo de trabalho é adequado para adaptação a outros estágios de desenvolvimento ou modelos experimentais nos quais estados microgliais transcricionalmente distintos podem ser mais proeminentes. Em tais contextos, a citometria de fluxo continua sendo uma ferramenta valiosa, especialmente quando integrada a ensaios complementares.

Um dos principais pontos fortes deste protocolo é sua adaptabilidade em vários estágios de desenvolvimento, desde o dia 3 pós-natal (P3) até o 30º dia pós-natal (P30). Isso permite a análise longitudinal do fenótipo da microglia à medida que a maturação cerebral progride. O uso combinado de citometria de fluxo e scRNA-seq torna possível estudar não apenas marcadores de superfície, mas também vias de sinalização intracelular e fatores de transcrição envolvidos em células microgliais.

No entanto, a digestão enzimática pode afetar a expressão de alguns marcadores de superfície, necessitando de otimização cuidadosa das condições de digestão para objetivos experimentais específicos^17,18. Além disso, nem a citometria de fluxo nem o sequenciamento de célula única fornecem dados em nível populacional, que podem não capturar totalmente as nuances espaciais e funcionais das interações das células microgliais em seu ambiente nativo. A incorporação de técnicas espaciais unicelulares pode ajudar a resolver essa limitação, preservando o contexto espacial das células microgliais. Estudos futuros combinando este protocolo com técnicas de imagem, como imuno-histoquímica, imagem in vivo, western blot ou transcriptômica espacial de célula única, podem oferecer informações complementares sobre a dinâmica das células microgliais.

Este método abre novos caminhos para investigar como insultos no início da vida, como inflamação, hipóxia ou estressores ambientais, influenciam os fenótipos das células microgliais e contribuem para os resultados do neurodesenvolvimento a longo prazo. Ao permitir a caracterização precisa e confiável dos estados de ativação das células microgliais, facilita a identificação de alvos terapêuticos para modular as respostas microgliais no início da vida, visando prevenir ou mitigar distúrbios do neurodesenvolvimento.

Em conclusão, este protocolo oferece uma estrutura robusta e acessível para estudar a diversidade de células microgliais durante o desenvolvimento inicial do cérebro. A combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única permite uma aplicação flexível em vários estágios de desenvolvimento e modelos experimentais, facilitando uma exploração mais profunda da biologia da microglia em contextos fisiológicos e patológicos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 µ M filtro de malha metálica	Sigma-Aldrich	S3895
Tubo de 15 mL	Sarstedt	62.554.205
Tubo de 5 mL	Sarstedt	55.526.006
Placa de 96 poços com fundo cônico	Sarstedt	82.1583.001
Arginase 1 - Conjugado Pecy7 - Clone : A1exF5	Thermo Fisher Científico	25-3697-82
Reagentes fluorescentes estáveis em bancada	Invitrogen	A49905
CD11b - Conjugado Fitc - Clone : M1/70	BD Pharmingen	553310
CD163 - Conjugado SB600 - Clone : TNKUPJ	Thermo Fisher Científico	63-1631-82
CD206 - Conjugado APC - Clone : C068C2	BioLegend	141708
CD45 - Conjugado A700 - Clone : 30-F11	BD Pharmingen	560510
CD64 - Conjugado  PerCP-eF710 - Clone: X54-5/7.1	Thermo Fisher Científico	46-0641-82
CD80 - Conjugado SB436 - Clone : 16-10A1	Thermo Fisher Científico	62-0801-82
CD86 - Conjugado Pe - Clone : GL-1	BioLegend	105008
Colagenase D	Sigma– Aldrich	11088866001
DNase I	Sigma– Aldrich	10104159001
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma– Aldrich	F1051
HBSS (solução salina balanceada de Hank) 10x	Wisent Bioprodutos	311506CL
Hemocitômetro	VWR Internacional	82030-470
HEPES	Wisent Bioprodutos	330.050.EL
iNOS - Conjugado PE- eF610 - Clone : CXNFT	Thermo Fisher Científico	61-5920-82
Kcl	Thermo Fisher Científico	BP366-500
KH2PO4	Thermo Fisher Científico	BP362-500
Amciano vivo/morto	Thermo Fisher Científico	L34957
Meios de cultura de células microgliais	Tecnologias da Vida	A12475-01
Na2HPO4	Thermo Fisher Científico	BP332-500
NaCl	Thermo Fisher Científico	BP358-212
Paraformaldeído	Sigma– Aldrich	Pág. 6148
Rato anti rato CD16/CD32	BD Biosciences	553142
Saponina	Sigma– Aldrich	S7900
Bibliotecas scRNAseq	Genômica 10X	1000121
Meio coloidal à base de sílica	Thermo Fisher Científico	45001747
Azida de sódio	Thermo Fisher Científico	BP922I-500
Azul Trypan	Gibco	1525006