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Artigo de método

Atividade convulsiva induzida por eletrochoque em larvas de Drosophila

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DOI:

10.3791/68431

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6 de junho de 2025

 ,  , 
1Division of Neuroscience, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, Manchester Academic Health Science Centre

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha o uso de larvas de Drosophila para identificar compostos anticonvulsivantes exclusivos para o tratamento da epilepsia.

Resumo

A epilepsia apresenta um fardo de saúde significativo que é exacerbado pelo alto número de indivíduos refratários a medicamentos. Embora alguns pacientes refratários a medicamentos respondam a tratamentos não medicamentosos (por exemplo, estimulação do nervo vago, dieta cetogênica, etc.), o último recurso para muitos é uma cirurgia desafiadora e cara para proporcionar alívio das convulsões. Embora seja geralmente reconhecido que são necessários medicamentos anticonvulsivantes com uma gama mais ampla de alvos, o obstáculo para conseguir isso é a identificação de novos alvos de medicamentos. Animais modelo geneticamente tratáveis são promissores a esse respeito. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tornou-se um modelo poderoso para investigar a base mecanicista e os melhores tratamentos para convulsões. Muitas mutações de moscas identificadas resultam em larvas e adultos exibindo atividade semelhante a convulsões em resposta a fortes estímulos (elétricos, mecânicos e / ou térmicos). Muitas dessas mutações estão em genes homólogos àqueles que contribuem para epilepsias genéticas humanas (por exemplo, o canal de Na+ dependente de voltagem). Agora também é possível substituir um gene de mosca por seu equivalente humano que, além disso, carrega uma mutação relacionada à doença. Assim, a humilde mosca tornou-se um avatar para modelar a doença humana. Este estudo descreve um método adequado para usar larvas de Drosophila para exames de drogas de baixo a médio rendimento para identificar compostos únicos e seus alvos que têm potencial anticonvulsivante.

Introdução

A epilepsia continua sendo um fardo significativo para a saúde, afetando aproximadamente 1% da população mundial. Embora existam mais de 30 medicamentos anticonvulsivantes (ASMs) para tratamento clínico, cerca de um terço das pessoas com epilepsia permanecem refratárias a medicamentos, o que significa que não respondem bem ao tratamentomedicamentoso 1,2. Os medicamentos disponíveis também são apenas paliativos e, como tal, não previnem a epileptogênese, nem proporcionam cura3. Assim, há uma necessidade crítica de identificar melhores tratamentos para a epilepsia. Um obstáculo para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes é a identificação de novos alvos de medicamentos. De fato, quase todos os ASMs atuais afetam alvos semelhantes: canais iônicos, incluindo o canal de sódio dependente de voltagem (Nav), e neurotransmissão inibitória mediada por ácido γ-aminobutírico (GABA) 4 , 5 . É geralmente aceito que o uso continuado de métodos tradicionais de desenvolvimento de medicamentos provavelmente não mudará radicalmente esse cenário.

Animais modelo de laboratório, incluindo, mas não se limitando a, a mosca da fruta Drosophila melanogaster e o peixe-zebra Danio rerio, têm utilidade para a identificação de novos ASMs 6,7,8. De fato, uma pesquisa no PubMed por 'Drosophila + convulsão' retorna 342 resultados, enquanto a mesma pesquisa por peixe-zebra retorna 578 resultados (ambas as pesquisas foram realizadas em 29de janeiro de 2025). Embora ofuscado pelo número de estudos semelhantes em camundongos (~ 15.000), o número de estudos usando sistemas modelo continua a crescer. Esses estudos são possíveis devido à conservação mecanicista da função do SNC em todos os filos. Além disso, as convulsões induzidas em moscas e peixes são efetivamente tratadas com ASMs clinicamente usados, mostrando que, embora as nuances do comportamento convulsivo possam parecer externamente diferentes, os mecanismos subjacentes têm muito em comum 7,9,10.

A mosca da fruta, Drosophila, fez muitas contribuições seminais para a compreensão da biologia humana. Com relação à epilepsia, este sistema modelo fornece uma caixa de ferramentas genéticas incomparável combinada com neurônios identificáveis e experimentalmente acessíveis7. Além disso, os conectomas para o SNC larval e adulto já foram publicados, e numerosas linhagens genéticas específicas de células foram identificadas11,12. Significativamente, uma classe de mutação foi identificada por acaso em que as moscas adultas respondem a uma forte estimulação mecânica por uma perda de postura e atividade semelhante a uma convulsão (por exemplo, zumbido das asas, tremor das pernas, etc.). Esta classe de mutação foi denominada 'sensível ao bang'13,14,15,16. Desde então, foi identificada uma segunda classe de mutação convulsiva que responde ao aumento da temperatura, espelhando as convulsões febris humanas17,18. No entanto, a tratabilidade experimental de moscas adultas é um pouco reduzida em comparação com o estágio larval desse mesmo modelo de inseto. Por exemplo, pode ser difícil alimentar moscas adultas com medicamentos, e técnicas mais invasivas, como eletrofisiologia e optogenética, podem ser mais desafiadoras. Em contraste, a larva de Drosophila come constantemente para expandir seu volume corporal em ~ 100 vezes em apenas 5 dias para permitir a pupação. Portanto, podemos ter certeza de uma alimentação medicamentosa adequada nos estágios larvais. A embriogênese está bem documentada e pode ser encenada com precisão e, por sua vez, identificou marcos importantes no desenvolvimento do SNC, incluindo a primeira aquisição de propriedades elétricas neuronais até a formação do circuito19. Uma vez eclodida, uma larva passa por 3 mudas (ou instares) até que, no dia 5, torna-se 'errante', após o que deixa a comida para encontrar um lugar seguro para a pupa. Após ~ 100 h de pupação, uma mosca adulta emerge com um novo corpo e SNC (Figura 1).

As técnicas para induzir convulsões em adultos não são adequadas para os estágios larvais. As larvas não possuem pêlos sensoriais, cuja ativação sincronizada durante a estimulação mecânica pode levar a uma convulsão. Assim, para superar essas dificuldades, foi desenvolvida uma técnica de eletrochoque para induzir convulsões no estágio larval errante. A análise comparativa subsequente das técnicas de indução de convulsões em larvas e adultos revela que o eletrochoque larval é muito menos dependente do tipo de mutação (por exemplo, sensível ao estrondo vs. temperatura). Assim, sugerimos que essa técnica deve ser o método preferido para testar novas mutações onde o método ideal de indução de convulsões é desconhecido20. A técnica de eletrochoque larval é simples, rápida e requer equipamento mínimo. Essa técnica fornece um meio eficiente de rastrear novos compostos, ou terapias genéticas, para eficácia anticonvulsiva em uma variedade de mutações que refletem a diversidade genética da epilepsia humana.

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Protocolo

A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é usada neste estudo (consulte a seção Resultados para obter detalhes). Esta técnica é mais adequada para larvas errantes de terceiro ínstar (L3). O protocolo experimental é relativamente simples, mas requer prática para ser aperfeiçoado. Em nossa experiência, os novos alunos precisam de cerca de 2 semanas para dominar o ensaio e se beneficiam muito da visualização de outros investigadores mais experientes que realizam o ensaio em tempo real usando um microscópio de dissecção habilitado para câmera ou similar. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Seleção de larvas

  1. Colete larvas das laterais de frascos/garrafas de mosca contendo alimentos padrão (5 L de água, 390 g de glicose, 360 g de milho, 250 g de fermento, 40 g de ágar, 135 mL de nipagina, 15 mL de ácido propiônico).
  2. Use apenas larvas que estão se movendo ativamente e deixaram a comida rastejar pelas laterais do recipiente (terceiros ínstares errantes, L3). Não selecione pré-pupas, que exibem locomoção muito reduzida.

2. Procedimento de eletrochoque

  1. Remova um único L3 errante e transfira-o para uma pequena placa de Petri de plástico (o tamanho não importa) e lave-o suavemente com ddH2O para remover os resíduos de alimentos. Um pincel pequeno (000) é adequado para isso.
  2. Transfira a larva lavada sozinha, usando um pincel, para um prato de plástico vazio (novamente, o tamanho não importa). Seque a larva com um pequeno fragmento de papel toalha preso com uma pinça. Remova o excesso de ddH2O, mas não seque completamente as larvas para evitar que grudem no prato de plástico.
  3. Deixe a larva se recuperar por 30 s. Isso facilitará a colocação fácil da sonda de eletrochoque (veja abaixo).
  4. Veja as larvas sob um microscópio de dissecção de baixa potência (15-20x) e, assim que o comportamento normal de rastreamento for retomado, coloque suavemente a sonda de eletrochoque (consulte a etapa 3 para obter detalhes e a Figura 2A) na superfície dorsal anterior da larva acima da posição aproximada do SNC (consulte a Figura 2C).
    NOTA: Esta etapa é crítica, pressão suficiente deve ser aplicada para fornecer boa condutividade entre o fio da sonda e a cutícula, mas tome cuidado para não danificar as larvas. Assim, esmague a larva em cerca de um terço a metade de sua profundidade.
  5. Aplicar um pulso de 2 s de tensão constante, cuja intensidade foi pré-determinada através de uma curva de titulação (figura 3). Qualquer estimulador de tensão isolado é adequado aqui. O usado aqui é mostrado na Figura 2B.
  6. Após o choque elétrico, inicie um cronômetro. Em resposta ao choque, as larvas iniciam paralisia transitória seguida por espasmos ocasionais de atividade muscular da parede corporal e comportamento de rolamento, interrompendo o comportamento normal de rastejar.
  7. Pare o cronômetro quando a larva se afastar claramente de sua colocação original no prato. A duração da convulsão, ou tempo de recuperação (TR), é definida como o período entre o início do estímulo e a retomada do comportamento normal de rastreamento (por exemplo, uma onda peristáltica completa para frente que resulta em movimento para frente).
  8. No final de cada dia, limpe cuidadosamente os fios da sonda, enxaguando-os primeiro com etanol 100% e, em seguida, com ddH2O. Inspecione cuidadosamente os fios sob ampliação e, se necessário, use uma pinça para raspar suavemente qualquer resíduo dos fios. Tenha muito cuidado para não alterar a distância entre os dois fios ao fazê-lo.

3. Construção da sonda de eletrochoque

  1. Serão necessários 2 comprimentos de 1 m de fio elétrico (devem ser finos e flexíveis, ou seja, classificados para ~ 3 A). Na extremidade de cada fio, solde um fio de tungstênio de 5 cm de comprimento (para maximizar o contato, enrole o fio de tungstênio em torno de uma extremidade exposta do fio elétrico antes de soldar). Solde os conectores de encaixe (por exemplo, plugues banana) na outra extremidade dos fios, adequados para facilitar a conexão ao estimulador de tensão.
  2. Prenda os dois fios de tungstênio a um suporte de eletrodo de forma que os fios fiquem paralelos um ao outro (Figura 2). Pequenas seções de capilares de vidro (~ 2 cm de comprimento) são usadas para manter os fios no lugar sob o parafuso de trava da sonda.
  3. Use uma pinça para dobrar os fios de forma que eles cheguem a 1-2 mm perto de onde saem do suporte do fio. Dobrar fios de tungstênio não é fácil porque os fios retêm uma 'memória' - portanto, é necessária perseverança. Dicas para ajudar nesse processo incluem o uso de fita isolante elétrica e/ou blu-tack (ou massa de modelagem semelhante) para ajudar a manter os fios na orientação/distância correta.

4. Calibração da sonda

  1. Assegurar a existência de unidades populacionais de L3 errantes de tipo selvagem adequado (controlo negativo) e de mutação convulsiva (controlo positivo). ~ 100 de cada será necessário.
  2. Prepare as larvas, uma de cada vez, conforme descrito acima.
  3. Use a sonda para aplicar uma faixa de voltagens a larvas suficientes de cada genótipo para cada voltagem testada. Sugere-se que 0 V, 2 V, 4 V, 6 V, 8 V, 10 V e 12 V sejam aplicados por 2 s entre 10-15 larvas por tensão. Choque cada larva apenas uma vez.
  4. Meça o tempo de recuperação de cada larva e calcule a média de cada etapa de voltagem aplicada para ambos os genótipos.
  5. Plote as médias em um gráfico e ajuste os dados com uma linha reta.
  6. Selecione uma tensão com uma diferença clara e significativa entre o mutante de controle e convulsão. Tenha cuidado para não escolher uma tensão que produza um tempo de recuperação excessivamente longo; caso contrário, a produtividade será prejudicada devido ao longo tempo de espera pela recuperação.
    NOTA: Este estudo freqüentemente usou uma tensão de estimulação que resulta em um tempo de recuperação de 50-100 s para o tipo selvagem e 200-300 s para o parágrafobss. As curvas de calibração exemplares são mostradas na Figura 3. É importante usar 0 V para contabilizar o ato de pressionar a sonda na superfície dorsal de uma larva. Isso causará algum grau de paralisia, que provavelmente é um mecanismo de defesa da larva.

5. Execução de experimentos

  1. Larva de eletrochoque do(s) genótipo(s) desejado(s) ou exposição a medicamentos e mede o tempo de recuperação da convulsão.
    NOTA: Para larvas de teste, um n = 20 geralmente é suficiente, mas um cálculo de poder baseado em uma análise piloto fornecerá um número n mais definitivo.
  2. Sempre execute um controle negativo (por exemplo, um tipo selvagem) e um positivo (por exemplo, parabss) durante cada experimento. Os n números não precisam ser altos; n = 5 é suficiente. Isso fornecerá confiança de que o ensaio funcionou conforme o esperado (por exemplo, sem problemas com a sonda ou estimulador).
  3. Aplique um ponto de corte (por exemplo, 300 s) para evitar tempos de recuperação excessivamente longos e considere apenas convulsões quantificáveis como aquelas com tempos de recuperação acima de 30 s.

6. Triagem de drogas

  1. Adicione os medicamentos, dissolvidos em um solvente apropriado, diretamente na superfície do alimento e deixe de molho (e se estiver usando etanol, tempo para a evaporação do solvente). Ou, alternativamente, pode-se adicionar um medicamento (em solvente apropriado) à comida de mosca derretida. Consulte a seção Resultados para obter detalhes.
  2. Para adicionar o medicamento ao alimento derretido, retire os alimentos dos frascos, derreta novamente e, à medida que o alimento esfria a 40 ° C, adicione o medicamento, misture com um misturador de vórtice e, em seguida, recoloque 5 mL de alimentos derretidos de volta em frascos e deixe esfriar antes de usar.
  3. Execute um gradiente de concentração para identificar a concentração ideal do medicamento.
    NOTA: Um bom ponto de partida é adicionar uma solução de medicamento 3 mM diretamente na superfície do alimento (200 μL por frasco padrão de Drosophila ) ou fazer uma concentração de 3 mM em alimentos derretidos. As fêmeas adultas podem botar ovos diretamente neste alimento, ou as larvas podem ser adicionadas em estágios selecionados, conforme necessário. O(s) solvente(s) utilizado(s) deve(m) ser adicionado(s) isoladamente aos frascos selecionados como controlo(s) do veículo.

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Resultados

Numerosas mutações de Drosophila exibem comportamento semelhante a convulsõesaprimorado 7,20. A base genética dessas mutações é variada, o que imita favoravelmente as causas genéticas igualmente variadas da epilepsia humana. Três das mutações de Drosophila mais estudadas são parabangsenseless (parabss), julius seizure (jus) e easily-shocked (eas). A mutação para...

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Discussão

O método de eletrochoque para induzir convulsões em larvas de Drosophila fornece uma triagem simples, mas eficiente, para identificar novos compostos anticonvulsivantes ou manipulações genéticas. No entanto, por se tratar de um ensaio qualitativo, sua principal limitação é que o método não pode identificar prontamente pequenos tamanhos de efeito. No entanto, o rendimento médio que ele permite, prestando-se à triagem de até ~ 5 compostos por semana, por investigador, fornece um e...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Agradecemos aos muitos funcionários do laboratório Baines que desenvolveram em conjunto essa técnica ao longo de muitos anos e, em particular, a Richard Marley, que se esforçou bastante para torná-la robusta e confiável. Agradecemos a Anna Munro por desenhar as larvas, que é mostrada na Figura 2. O trabalho no laboratório de Baines que contribuiu para o desenvolvimento dessa técnica foi generosamente apoiado pelo BBSRC, MRC e Wellcome Trust. Este trabalho é atualmente apoiado por financiamento de um prêmio de investigador do Wellcome Trust para R.A.B. (Grant 217099/Z/19/Z). O desenvolvimento desta técnica também se beneficiou do Manchester Fly Facility, que foi estabelecido por meio de fundos da Universidade e do Wellcome Trust (Grant 087742 / Z / 08 / Z).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Suporte de eletrodoInstrumentos de Precisão MundiaisM3301
Capilares de vidroInstrumentos de HarvardGC100F-10
Fio de tungstênio (99,95%)Goodfellow Cambridge, Reino Unido0,1 mm de diâmetro
Estimulador de tensãoDigitimer Ltd, Reino UnidoDS2A mkII Estimulador Isolado de Tensão Constante 

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