Medição de Monofosfato de Guanosina Cíclico (cGMP) em Tecidos Sólidos usando Ensaio Imunoenzimático Competitivo (ELISA)

Resumo

Este protocolo mede as concentrações de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) em tecidos sólidos usando ensaio de imunoabsorção enzimática competitiva (ELISA). O protocolo descreve como processar tecido sólido, realizar ELISA competitivo, converter absorbâncias em concentrações de cGMP em picomoles por mililitro e calcular as concentrações finais como nanomoles de cGMP por grama de tecido.

Resumo

Uma das principais vias que produzem monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) é a via do óxido nítrico (NO)-cGMP. Nessa via, o NO estimula a atividade catalítica da guanilil ciclase solúvel (sGC), que converte o trifosfato de guanosina em cGMP. O NO é de interesse porque, em mamíferos, atua como o principal vasodilatador, inibidor da agregação plaquetária, mediador da função imunológica, neurotransmissor e para melhorar a resistência durante a atividade física, entre outras funções fisiológicas. Medir a abundância de NO em diferentes tecidos pode ajudar a elucidar suas funções. No entanto, o NO não pode ser medido diretamente devido à sua meia-vida inferior a segundos. Normalmente, os metabólitos do NO, nitrato e nitrito, são medidos para estimar a abundância do NO. Isso ocorre porque essas moléculas podem ser interconvertidas in vivo por meio de reações redox. Um método menos comum de estimar a abundância de NO requer a medição da concentração de cGMP, uma molécula de sinalização a jusante do NO. No entanto, a medição do cGMP nos tecidos raramente é feita, apesar de criar a possibilidade de entender melhor as funções do NO nos órgãos. Portanto, existe a necessidade de um protocolo para medir as concentrações de cGMP em órgãos e tecidos sólidos. Neste protocolo, os tecidos suínos coletados foram homogeneizados, o ELISA competitivo foi realizado nas amostras processadas e as absorbâncias foram convertidas em nanomoles de cGMP por grama de tecido original. Em suma, este protocolo delineia um método simplista para medir as concentrações de cGMP em tecidos sólidos usando o kit ELISA GMP cíclico.

Introdução

O monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) é uma molécula sinalizadora capaz de induzir alterações fisiológicas através da via do óxido nítrico (NO)-GMPc. Na via NO-cGMP, o NO se liga à guanilil ciclase solúvel, uma enzima citosólica que converte o trifosfato de guanosina em cGMP, aumentando sua atividade catalítica ^1,2. O aumento subsequente nas concentrações de GMPc ativa vias de sinalização que promovem a vasodilatação³, levando à diminuição da pressão arterial ^4,5, principal resposta fisiológica característica da presença de NO in vivo. Além disso, sabe-se que o NO influencia a função imunológica⁶, melhora a resistência durante a atividade física⁴ e previne a coagulação sanguínea inibindo a agregação plaquetária⁷.

A medição direta do NO é dificultada por sua meia-vida in vivo⁸ de menos de segundos na maioria dos tecidos biológicos. Consequentemente, elucidar os efeitos fisiológicos do NO requer um método para medir sua abundância ex vivo. Portanto, métodos quantitativos utilizáveis evitam a medição direta de NO. Um método comum para estimar as concentrações de NO nos tecidos é medir os metabólitos mais estáveis do NO: nitrito e nitrato 4,5,9,10,11. A principal complicação do uso de concentrações de nitrito e nitrato como medidas da abundância de NO é que ambos os metabólitos também servem como precursor de NO e molécula de armazenamento, respectivamente. Os metabólitos do NO, especialmente o nitrato, são abundantes em certos alimentos. Portanto, mudanças nas concentrações de cGMP, cGMP sendo a jusante do NO, são úteis para estimar as quantidades de NO ativo, e a abundância de NO pode ser determinada sem a interferência de nitrito e nitrato previamente presentes.

Pesquisas anteriores se basearam na medição das concentrações de cGMP no plasma¹² e nas plaquetas¹³, mas menos comumente vista é a medição das concentrações de cGMP em tecidos sólidos. A capacidade de medir as concentrações de GMPc em tecidos sólidos permitiria a caracterização da atividade do NO em órgãos específicos. O objetivo foi identificar um método simplista para medir o GMPc em tecidos sólidos usando ELISA competitivo. Uma vantagem de usar o ELISA competitivo é que ele requer equipamentos comumente encontrados na maioria dos laboratórios interessados em NO, como um leitor de microplacas frequentemente usado para outros fins. Em comparação, alguns outros métodos de medição requerem equipamentos raramente usados durante experimentos focados em NO, como microscópios^14,15, contador de cintilação¹⁶ ou laser¹⁷. Além de sua acessibilidade, medir cGMP com ELISA competitivo é sensível; As concentrações de cGMP podem ser detectadas até 0,1 picomol (pmol) de cGMP/mL¹⁸. Com pequenas modificações no protocolo do kit ELISA (Tabela de Materiais)^{cGMP 18}, foi estabelecido um método para medir o cGMP em tecidos sólidos usando ELISA competitivo.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o protocolo Molecular Medicine Branch Animal Study aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIDDK (ASP K049-MMB-23). A coleta de tecidos seguiu as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do MedStar Health Research Institute (número do protocolo: 2006001373 2020-017). Foram utilizados porcos Yorkshire cross adultos jovens (dois machos e duas fêmeas), com 3 meses de idade e pesando entre 30-35 kg. A Figura 1 ilustra um esquema mostrando as etapas do protocolo do kit cGMP ELISA. Os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

Figura 1: Esquema do protocolo. Um esquema ilustrando as etapas do protocolo do kit cGMP ELISA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação de amostras de tecido

NOTA: Os tecidos foram perfundidos com uma solução de heparina sódica antes da coleta e depois armazenados a -80 ° C antes do uso. Consulte Park et ^al.19 para obter detalhes sobre a coleta das amostras de tecido.

1. Processamento de amostras de tecido
   1. Resfrie um pulverizador de tecido, uma pinça e uma colher em gelo seco por 10 minutos antes de iniciar o procedimento.
   2. Pese o excesso de tecido, pois alguns podem ser perdidos durante a pulverização (rendimento em torno de 90%).
      NOTA: Anteriormente, um excesso de 170 mg produzia resultados bem-sucedidos. A massa pode ser aumentada ou diminuída, se desejado. Certifique-se de que a massa de tecido resulta em um volume de amostra suficiente para as etapas de acetilação e diluição da amostra de tecido.
   3. Adicione o tecido ao pulverizador em gelo seco.
   4. Congele rapidamente o tecido com nitrogênio líquido e deixe o nitrogênio líquido vaporizar completamente.
   5. Recoloque a tampa do pulverizador e bata nela com um martelo 15 vezes.
      NOTA: Se a configuração do pulverizador não estiver disponível ou não puder ser usada, a amostra deve ser cortada em pedaços o menor possível usando uma tesoura ou bisturi enquanto mantida congelada ou pelo menos refrigerada com gelo. Esta etapa garante uma boa homogeneização e é crucial, especialmente para tecidos mais duros.
   6. Tara um tubo homogeneizador de esferas e transfira o tecido pulverizado para o tubo usando a colher e a pinça resfriadas.
   7. Registre a massa do tecido adicionado ao tubo homogeneizador de esferas para converter as concentrações de molaridade em moles por massa posteriormente. Mantenha a amostra no gelo.
   8. Ao tubo de homogeneização, adicione um volume em microlitros de ácido clorídrico 0,1 N igual a um múltiplo da massa do tecido em miligramas.
      NOTA: Diluições apropriadas fazem com que as amostras medidas caiam na curva padrão. Essas diluições são encontradas para diferentes tipos de tecido por tentativa e erro. Em experimentos anteriores, uma proporção de diluição de 1:10 para o tecido muscular esquelético e uma proporção de diluição de 1:5 para o tecido hepático produziram resultados bem-sucedidos. Para referência, se diluir 100 mg de tecido, uma proporção de diluição de 1:10 exigiria 1.000 μL de ácido clorídrico 0,1 N e uma proporção de diluição de 1:5 exigiria 500 μL.
   9. Homogeneizar as amostras de tecido usando um homogeneizador de moinho de esferas ou uma técnica comparável.
      NOTA: Ocasionalmente, resfrie a amostra durante a homogeneização usando gelo. Se um homogeneizador de moinho de esferas não estiver disponível, outros métodos de homogeneização que efetivamente interrompem as células e criam homogeneizado de tecido podem ser substituídos, incluindo o uso de um homogeneizador rotativo ou um homogeneizador ultrassônico.
   10. A centrífuga homogeneiza por 30 min a uma velocidade de 17.000 x g , mantendo uma temperatura de amostra de 4 °C.
       NOTA: Homogeneizados de tecido muscular esquelético insuficientemente diluídos tornam-se excessivamente viscosos e semelhantes a gel. Isso pode ser visto melhor após a centrifugação.
   11. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga e centrifugue o sobrenadante por 10 min a 17.000 x g , mantendo uma temperatura de 4 °C.
   12. Transferir uma alíquota de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga e manter a amostra congelada.
       NOTA: A acetilação de 250 μL de sobrenadante produziu resultados bem-sucedidos. Para pausar o protocolo, congele essas amostras a -80 °C e armazene por até 48 h. Recomenda-se que o volume de sobrenadante para o processo de acetilação seja medido no dia da acetilação.

2. Preparação padrão

NOTA: Prepare os padrões no dia da preparação da microplaca ELISA.

1. Preparação do tampão ELISA
   1. Adicione o concentrado tampão ELISA 10x descongelado a um frasco de vidro contendo 90 mL de água ultrapura.
      NOTA: Tome cuidado para enxaguar o concentrado tampão ELISA residual 10x com o tampão ELISA preparado e retorne o tampão ao frasco de vidro. Conservar a 4 °C até 2 meses.
2. Preparação padrão de material
   1. Adicione 1 ml de tampão ELISA ao frasco padrão e agite para dissolver.
      NOTA: Conservar a 4 °C até 6 semanas.
3. Diluição serial padrão
   1. Rotule um tubo padrão B e nove tubos padrão 0 a padrão 8.
   2. Adicione 9,9 mL de tampão ELISA ao tubo rotulado como padrão B.
   3. Transfira 100 μL do estoque padrão (300 pmol/mL de cGMP) para o tubo B padrão e vore completamente.
   4. Transfira 1.000 μL da solução no tubo B padrão para o tubo padrão 1.
   5. Adicione 500 μL de tampão ELISA ao tubo rotulado como padrão 0 e os tubos rotulados como padrão 2 ao padrão 8.
   6. Vortex padrão 1 e, em seguida, transfira 500 μL de solução do padrão 1 para o padrão 2.
   7. Vortex padrão 2 e, em seguida, transfira 500 μL de solução do padrão 2 para o padrão 3.
   8. Continue a transferir 500 μL do padrão n-1 para o padrão n, certificando-se de revirar os padrões completamente após cada adição.
   9. Rejeitar 500 μl de solução do padrão 8.
      NOTA: Certifique-se de que os padrões de vórtice sejam especificados para uma curva padrão ideal. Os padrões 0 a 8 estão em um volume de 500 μL. Conservar os padrões a 4 °C até à utilização. Use padrões no dia de sua diluição.

3. Acetilação

NOTA: Durante a reação de acetilação, um grupo acetil é adicionado ao grupo hidroxila 2 'da molécula de cGMP, o que modifica a estrutura do cGMP e leva a um aumento na afinidade de ligação dos anticorpos, aumentando a sensibilidade do ensaio ~ 10 vezes. Em amostras contendo mais de 1,0 pmol/mL de GMPc, as medições podem ser feitas sem acetilação, e esta etapa pode ser omitida. A necessidade de acetilação deve ser determinada experimentalmente, caso a caso.

1. Preparação de hidróxido de potássio
   1. Adicione 10 mL de água ultrapura ao frasco de hidróxido de potássio para criar uma solução de 4 M.
      NOTA: Não tampe o frasco à medida que o hidróxido de potássio se dissolve. Armazene por meses em temperatura ambiente.
2. Acetilação de amostras de tecido
   1. A uma alíquota de 250 μL da amostra, adicionar 50 μL (5:1) de hidróxido de potássio 4 M e seguir rapidamente a adição com 12,5 μL (20:1) de anidrido acético.
   2. Vórtice por 15 s.
   3. Adicione 12,5 μL de hidróxido de potássio 4 M à amostra e vortex brevemente.
   4. Opcional: Se as amostras de músculo esquelético solidificarem após as etapas de acetilação, centrifugue as amostras a 17.000 x g por 10 min.
3. Acetilação de padrões
   1. Ao tubo rotulado como padrão 0, adicione 100 μL de hidróxido de potássio 4 M, imediatamente seguido por 25 μL de anidrido acético.
   2. Vórtice o padrão por 15 s.
   3. Adicione 25 μL de hidróxido de potássio 4 M ao padrão e vórtice brevemente.
   4. Repita essas etapas para os padrões numerados restantes.
      NOTA: Vortex todas as amostras e padrões pela mesma duração para garantir resultados consistentes.

4. Diluição da amostra de tecido

1. Adicionar proporções pré-determinadas de tampão ELISA e uma alíquota de amostra acetilada a um tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Duas diluições diferentes são necessárias para cada amostra. As taxas de diluição que fazem com que as concentrações de cGMP medidas caiam na curva padrão são encontradas por tentativa e erro. As diluições devem ser determinadas experimentalmente para cada tipo de tecido, a fim de que a percentagem fique compreendida entre 20% e 80%. Em experimentos anteriores que mediram os tecidos hepáticos, as taxas de diluição de 1:2 e 1:3 produziram resultados bem-sucedidos com os valores percentuais apropriados. Essas proporções também produziram resultados bem-sucedidos para o músculo esquelético. No entanto, variações no tecido muscular esquelético podem exigir amostras mais diluídas.
2. Opcional: Se um precipitado se formar quando a amostra de tecido for adicionada ao tampão ELISA, centrifugue a amostra por 10 min a 17.000 x g.

5. Preparação de microplacas ELISA

1. Preparação do marcador de acetilcolinesterase (AChE)
   1. Adicione 6 mL de tampão ELISA ao frasco para injetáveis do traçador AChE e agite suavemente para dissolver.
      NOTA: Armazene a amostra a 4 °C por até 2 semanas. Não vórtice.
2. Preparação anti-soro
   1. Adicione 6 mL de tampão ELISA ao frasco para injetáveis anti-soro e agite suavemente para dissolver.
      NOTA: Conservar a 4 °C durante, pelo menos, 4 semanas. Não vórtice.
3. Incubação de amostra e padrão
   1. Padrão de vórtice 0.
   2. À microplaca ELISA, adicione alíquotas de 50 μL de poços padrão 0 a 5 (NSB e B₀; Figura 2).
   3. Para dois dos poços (NSB; Figura 2) contendo o padrão 0, adicione 50 μL de tampão ELISA.
   4. Use uma ponta de pipeta para adicionar alíquotas de 50 μL dos padrões 1 a 8 à microplaca ELISA em duplicata. Comece com o padrão mais diluído (padrão 8) e, em seguida, prossiga para o próximo mais diluído até que todos os padrões sejam adicionados.
      NOTA: Aspire e dispense cada padrão várias vezes antes de adicioná-lo a um poço. Padrões de vórtice antes de adicioná-los aos poços.
   5. Vortex cada amostra antes de adicionar alíquotas de 50 μL nos poços em duplicata ou triplicata.
   6. Adicione 50 μL de traçador AChE a cada NSB, B₀, padrão e poço de amostra (Figura 2).
   7. Adicione 50 μL de anti-soro a cada B₀, padrão, e sample o poço (Figura 2).
   8. Cobrir a microplaca ELISA e incubar a 4 °C durante 18 h.
      NOTA: Certifique-se de vórtice sempre que instruído para produzir resultados consistentes.
4. Preparação do tampão de lavagem
   1. Em uma garrafa de vidro, adicione 200 mL de água ultrapura e 500 μL de concentrado tampão de lavagem 400x.
   2. Usando uma seringa, adicione 100 μL de polissorbato 20 ao frasco de vidro.
   3. Agite suavemente a garrafa para misturar.
      NOTA: Armazene o tampão de lavagem a 4 °C por até 2 meses. Dobre os volumes de água ultrapura, concentrado de tampão de lavagem 400x e polissorbato 20 para uma microplaca completa de 96 poços de amostras.
   4. Transfira o tampão de lavagem para um frasco de lavagem antes de usar.
5. Preparação do reagente de Ellman
   NOTA: Prepare o dia do desenvolvimento da microplaca ELISA.
   1. Em um recipiente protegido contra luz, adicione 20 mL de água ultrapura.
   2. Use uma alíquota da água ultrapura para dissolver o reagente de Ellman.
   3. Transfira o reagente de Ellman para o recipiente protegido contra luz.
   4. Use o reagente de Ellman para enxaguar o frasco em que veio.
   5. Transfira toda a solução de volta para o recipiente protegido contra luz usando uma pipeta.
6. Lavagem de microplacas ELISA
   1. Descarte o conteúdo da microplaca ELISA invertendo-a. Certifique-se de que os poços sejam esvaziados batendo a microplaca ELISA invertida em uma toalha de papel.
   2. Encha os poços com tampão de lavagem usando o frasco de lavagem.
   3. Agite suavemente a microplaca ELISA por 5 s e, em seguida, despeje o tampão de lavagem e retire o fluido restante em uma toalha de papel.
   4. Encha a microplaca ELISA com tampão de lavagem, agite suavemente a microplaca ELISA por 30 s e despeje seu conteúdo. Repita isso quatro vezes, batendo a microplaca ELISA em uma toalha de papel após cada despejo para remover o fluido restante.
      NOTA: Evite leituras de absorbância imprecisas lavando bem a microplaca ELISA.
7. Desenvolvimento e leitura de microplacas ELISA
   1. Transfira o reagente de Ellman para um reservatório.
   2. Trabalhando rapidamente, use uma pipeta multicanal para alíquota de 200 μL do reagente de Ellman para os poços em branco, NSB, B₀, TA, padrão e amostra.
   3. Adicione 5 μL de marcador AChE ao poço TA.
   4. Cubra a microplaca ELISA com parafilme, coloque-a em um recipiente protegido contra luz e incube em temperatura ambiente por 60-90 min com agitação.
      NOTA: Use os poços B₀ como indicadores para o tempo de incubação apropriado. Os poços ideais B₀ aparecem visivelmente amarelos, mas não escuros.
   5. Remover a película de parafina e ler a microplaca ELISA com uma densidade óptica de 412 nm.
      NOTA: Poços B₀ com absorbância entre 0,3 UA e 1,0 UA, com os brancos subtraídos, indicam que a microplaca ELISA está adequadamente desenvolvida.
   6. Opcional: Se a microplaca ELISA estiver subdesenvolvida, substitua o filme de parafina e deixe-o incubar em um recipiente protegido contra luz por um período adicional. Se a microplaca ELISA estiver superdesenvolvida, despeje o reagente de Ellman, enxágue uma vez com tampão de lavagem e revele novamente a microplaca ELISA com o reagente de Ellman.

Figura 2: Layout da microplaca. Um exemplo de layout de microplacas para o ELISA competitivo. NSB indica um poço de ligação não específico. B₀ indica um poço de ligação máximo. TA indica uma atividade total bem. Std. indica um poço padrão com seu número correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Conversão em concentração

1. Cálculos de rastreador AChE associado
   1. Calcule a média das absorbâncias dos dois espaços em branco e subtraia a média das absorbâncias de cada poço.
      NOTA: Use as absorbâncias subtraídas em branco para o restante dos cálculos.
   2. Calcule as absorbâncias médias do NSB, B₀ e poços em branco.
   3. Utilizar a seguinte equação para calcular a absorvância B₀ corrigida:
      
      NOTA: Corr. significa corrigido, Abs. significa absorbância e Avg. significa média. Se a absorbância média dos poços em branco (com a média em branco subtraída) for um número negativo, use zero para o cálculo.
   4. Calcule a proporção para cada padrão e amostra usando a seguinte equação:
      
   5. Multiplique a proporção de cada amostra por 100 para calcular a porcentagem .
      NOTA: Amostras entre 20% e 80% caem na curva padrão.
2. Cálculos de curva padrão
   1. Calcule a média da proporção de poços duplicados de cada padrão (1 para 8).
   2. Calcule o logit da razão média de cada padrão usando a seguinte equação:
      
   3. Utilizando as concentrações conhecidas de cada norma (quadro 1) como valores X e o logit de cada norma como valores Y, calcular o declive e a intercepção Y.
   4. Calcular o coeficiente de determinação utilizando o log₁₀ das concentrações padrão cGMP conhecidas como valores X e o logit de cada padrão como valores Y.
      NOTA: Verifique se o coeficiente de determinação está próximo de 1.
3. Cálculos de concentração de cGMP em pmol/mL
   1. Calcular o logit de cada amostra utilizando a seguinte equação:
      
   2. Para calcular a concentração de cGMP em cada amostra (em picomoles de cGMP por mililitro de amostra), use a seguinte equação:
      
      NOTA: D.R. significa razão de diluição. A soma homogeneizada de R.D. para amostras de fígado diluídas com uma proporção de diluição de 1:5 de ácido clorídrico é igual a 6. A soma do tampão D.R. para amostras de fígado diluídas com uma proporção de diluição de 1:2 de tampão ELISA é igual a 3. Portanto, os termos agrupados por colchetes são multiplicados por 18.
4. Cálculos de concentração de cGMP em nmol/g
   1. Calcule os nanomoles de cGMP por poço com a seguinte equação:
      
   2. Calcular os gramas de tecido em cada amostra acetilada com a seguinte equação:
      
      NOTA: "mg de tecido" é a massa de tecido adicionada ao tubo de homogeneização em miligramas. "Volume de HCl utilizado", o volume de ácido clorídrico 0,1 N utilizado para diluir as amostras para homogeneização.
   3. Calcular os gramas de tecido em cada amostra diluída com tampão ELISA utilizando a seguinte equação:
      
      NOTA: "volume de amostra diluído" é o volume de amostra diluído por tampão ELISA. "250 μL" é o volume da amostra acetilada. Os "reagentes" mencionados são os reagentes de acetilação 4 M KOH e o anidrido acético.
   4. Calcule os gramas de tecido por alvéolo com a seguinte equação:
      
      NOTA: "volume de tampão" é o volume de tampão ELISA usado para diluir as amostras de tecido antes de adicioná-las aos alvéolos.
   5. Divida os nanomoles de cGMP por poço pelos gramas de tecido por poço para calcular a concentração de cGMP em nmol/g.

Número padrão	Concentrações de GMPc (pmol/mL)
Padrão 1	3.0
Padrão 2	1.5
Padrão 3	0.75
Padrão 4	0.375
Padrão 5	0.1875
Padrão 6	0.09375
Padrão 7	0.046875
Padrão 8	0.0234375

Quadro 1: Concentrações padrão. As concentrações conhecidas dos padrões 1 a 8.

Resultados

Porcos domésticos de Yorkshire tratados com cloreto de sódio dietético (0,15 mmol / kg) ou nitrato marcado ^{com N 15}(0,15 mmol / kg) administrado uma vez por dia por cinco dias consecutivos como bolus em ração foram perfundidos com uma solução de heparina sódica (cloreto de sódio a 0,9%) antes da coleta de tecido; Todos os detalhes da coleta foram publicados anteriormente¹⁹. As concentrações de cGMP nos músculos glúteos e fígados de quatro porcos domésticos de Yorkshire foram medidas de acordo com o protocolo ELISA descrito. Os tecidos hepáticos foram diluídos na proporção de diluição de 1:5 e os músculos glúteos na proporção de diluição de 1:10, com ácido clorídrico (HCl) 0,1 N para precipitar as proteínas. Os homogeneizados diluídos em HCl foram acetilados e depois diluídos com tampão ELISA em uma proporção de diluição de 1:2 e 1:3 para as amostras de fígado e músculo glúteo. As concentrações de GMPc foram medidas conforme descrito acima. As absorbâncias foram convertidas em picomoles de cGMP por mililitro de amostra preparada e, em seguida, em nanomoles de cGMP por grama de tecido (nmol/g de tecido), conforme declarado no protocolo acima.

As concentrações de cGMP medidas nos tecidos hepáticos produziram resultados experimentais ideais nas condições acima. As concentrações de cGMP no grupo controle e no grupo tratado com nitrato no fígado suíno são de 0,0202 nmol/g ± 0,003 nmol/g de tecido e 0,0364 nmol/g ± 0,011 nmol/g de tecido, respectivamente (Figura 3). Vários valores confirmam a confiabilidade dos resultados. As absorbâncias dos poços B₀ com os brancos subtraídos, que variam de 0,466 a 0,475, estão dentro da faixa de 0,3 UA a 1,0 UA, verificando o desenvolvimento suficiente de microplacas com o reagente de Ellman. A alta qualidade da curva padrão é exibida tanto por aumentos incrementais nas absorbâncias do padrão 1 para o padrão 8 quanto pela linearidade da curva padrão, verificada por um coeficiente de determinação de 0,99. A porcentagem para cada poço medido (31,5%-71,2%) está entre 20% e 80%, validando que todas as amostras se enquadram na curva padrão. As amostras que possuem as características declaradas são adequadas para interpretação.

As concentrações de cGMP medidas nos tecidos musculares glúteos produziram resultados experimentais abaixo do ideal. O rótulo subótimo é atribuído aos resultados do músculo glúteo porque a maioria dos valores percentuais dos poços do músculo glúteo (3,69%-27,3%) caiu abaixo de 20%, indicando que mais amostras diluídas foram necessárias para que as absorbâncias caíssem na curva padrão. As concentrações de GMPc no grupo controle e no grupo tratado com nitrato no músculo glúteo suíno são de 1,22 nmol/g ± 0,49 nmol/g de tecido e 0,732 nmol/g ± 0,18 nmol/g de tecido, respectivamente (gráfico não mostrado). As amostras de músculo glúteo compartilham as absorbâncias dos poços B₀ e padrões das amostras de fígado. O uso dessas amostras abaixo do ideal pode levar a conclusões incorretas; portanto, é necessária a preparação de amostras mais diluídas e a remedição das concentrações de cGMP.

Figura 3: concentração de cGMP no tecido hepático. A concentração média de cGMP de fígado suíno tratado com cloreto de sódio (0,15 mmol/kg) ou ^{nitrato marcado com 15}N (0,15 mmol/kg) em nmol/g de tecido. n = 4; as barras de erro indicam desvio padrão; os dados foram analisados pelo teste t de Welch; ns não significa significado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo fornece instruções sobre as etapas necessárias para medir as concentrações de cGMP em tecidos sólidos usando ELISA competitivo. Variações nas concentrações de cGMP podem indicar diferenças na abundância de NO nos tecidos. Ao investigar essas diferenças em tecidos sólidos, informações sobre o NO em vários órgãos podem ser elucidados.

No protocolo, as amostras de tecido foram primeiro homogeneizadas em preparação para o ELISA. Isso começou congelando rapidamente uma massa de tecido sólido e depois pulverizando-a. A quebra dos tecidos antes da etapa de homogeneização destina-se a ajudar o homogeneizador de esferas a lisar as células. Os tecidos foram homogeneizados em ácido clorídrico 0,1 N para precipitar proteínas, técnica utilizada em outros métodos^20,21. Finalmente, os sólidos e precipitados foram separados dos componentes solúveis por centrifugação. Para fazer a curva padrão, um estoque de cGMP (300 pmol de cGMP/mL) foi diluído serialmente para fazer oito padrões diferentes. Padrões e amostras foram acetilados para melhorar a sensibilidade do ensaio, detectando concentrações de até 0,1 pmol de cGMP/mL. Esse aumento na sensibilidade é realizado quando o grupo acetil forma uma ligação com o cGMP, melhorando a capacidade de cada anticorpo (presente no anti-soro) de se ligar ao cGMP acetilado¹⁸. A acetilação dos padrões e das amostras garante uniformidade na ligação cGMP entre os poços. A etapa de acetilação pode ser omitida tanto para os padrões quanto para as amostras se a concentração de cGMP nos poços de microplacas exceder 1,0 pmol/mL¹⁸.

Em preparação para a adição de amostras aos poços, as amostras foram posteriormente diluídas com tampão ELISA. A diluição adicional permitiu que as amostras caíssem na curva padrão e se assemelhassem mais ao conteúdo do NSB, B₀ e poços padrão, criando uniformidade. Junto com as amostras e padrões, várias outras soluções são misturadas nos poços. Nos alvéolos NSB, o tampão ELISA (com e sem os reagentes de acetilação) é adicionado enquanto o anti-soro é retido. Isso é para determinar a quantidade de marcador AChE (acetilcolinesterase ligada ao cGMP) que se liga à IgG de camundongo aderida ao poço na ausência do anticorpo específico que compreende o anti-soro. Os poços B₀ continham tampão ELISA (com os reagentes de acetilação), traçador AChE e anti-soro; portanto, os poços B₀ exibem a capacidade de ligação do traçador AChE sem a competição do cGMP. Depois que todos os poços são preenchidos adequadamente, a microplaca é incubada e depois lavada. O reagente de Ellman foi adicionado aos poços. Por fim, um traçador AChE foi adicionado ao TA bem depois que o reagente de Ellman foi adicionado. Este poço representa a atividade catalítica do traçador AChE, independentemente de quanto marcador foi ligado à microplaca pelos anticorpos. A microplaca foi desenvolvida à temperatura ambiente, permitindo que o traçador AChE catalisasse uma reação colorimétrica.

Várias etapas do protocolo podem alterar os resultados do ensaio; É necessário ter cuidado extra ao executar as etapas a seguir para obter os melhores resultados. A identificação de diluições adequadas para cada tipo de tecido para a fase de homogeneização e após acetilação é necessária para garantir que as amostras se enquadram na curva-padrão. Ao preparar os padrões, as soluções devem ser completamente vórtices ou misturadas antes da remoção de uma alíquota ou após a adição de uma alíquota. Esta etapa é importante para atingir as concentrações esperadas de cGMP de cada padrão. Durante as etapas de acetilação, cada padrão e amostra devem ser submetidos a vórtices durante a mesma duração para obter leituras de absorbância consistentes. Os padrões e as amostras também devem ser submetidos a vórtices imediatamente antes da adição de uma alíquota ao poço apropriado. Essa prática resulta em concentrações mais precisas de cGMP. A lavagem completa da microplaca também melhora a precisão dos valores de absorbância, pois remove todo o traçador AChE não ligado do poço. Após a adição do reagente de Ellman, deve-se dar tempo adequado para o desenvolvimento da microplaca, com atenção à cor e, mais importante, às absorbâncias dos poços B₀ . É importante reconhecer que a concentração de cGMP entre duplicatas ou triplicatas pode variar mais em amostras com níveis mais baixos de cGMP em comparação com aquelas com concentrações mais altas. Medir uma amostra mais concentrada pode ajudar a resolver esse problema. Além disso, para levar em conta qualquer variabilidade entre as microplacas, amostras do mesmo tipo de tecido devem ser medidas na mesma placa, sempre que possível. Espera-se que seguir essas diretrizes melhore a qualidade dos dados resultantes do ensaio.

O protocolo acima pode ser extrapolado para outros tecidos moles e sólidos. O desenvolvimento adicional da subseção de preparação de tecidos do protocolo acima pode resultar em um método adequado para o processamento de tecidos duros, incluindo ossos, que pode ser de interesse devido à sua vascularização. O desenvolvimento contínuo desta técnica pode resultar em um método adequado para medir as concentrações de cGMP em uma ampla variedade de tecidos sólidos, resultando em um método útil para coletar informações adicionais sobre a abundância de NO em praticamente qualquer tecido. Embora o protocolo ELISA competitivo declarado acima seja uma técnica útil para medir o cGMP e estimar a abundância de NO, ele tem duas limitações notáveis: (1) Este ensaio não distingue entre cGMP sintetizado pela guanilil ciclase solúvel e cGMP sintetizado pela guanilil ciclase particulada (pGC). Os peptídeos natriuréticos estimulam a atividade da pGC²² e, portanto, alterações no cGMP por essa via não indicam alterações na abundância de NO; (2) Além disso, as enzimas fosfodiesterase (PDE) influenciam os resultados do ensaio ELISA. Várias EDPs hidrolisam o GMPc, reduzindo sua concentração após a estimulação do sGC pelo NO²³. Portanto, a atividade catalítica das EDPs pode obscurecer a conexão entre as concentrações de cGMP e a abundância de NO. A adição de um inibidor de PDE5, como o sildenafil, para prevenir a perda de cGMP é aconselhável para experimentos focados principalmente na obtenção de concentrações exatas de cGMP, em oposição à obtenção de medições para observar tendências nas concentrações de cGMP. Os inibidores da PDE5 podem ser administrados como sildenafil a animais cerca de 1 h antes da colheita da amostra (os efeitos duram até 4 h²⁴) ou, se tal administração não for possível, o sildenafil pode ser adicionado às amostras recolhidas. Ao inibir EDPs após a coleta de tecidos, adicione sildenafil ao ácido clorídrico 0,1 N para que os tecidos sejam homogeneizados na presença de sildenafil. Medições com e sem sildenafil precisam ser feitas para garantir que não haja interferência entre o tratamento animal e o sildenafil.

Mesmo com suas limitações, o ensaio é usado como uma visão informativa da transmissão a jusante do sinal NO. Em conclusão, o acoplamento da medição das concentrações de GMPc em tecidos sólidos com outros métodos de medição de NO permite uma melhor compreensão dos efeitos do NO nos órgãos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL de seringa oral transparente BD	Becton Dickinson	50382903052177
Tubo de ensaio de fundo redondo de 14 mL	Falcão	352059
Microtubos de 2,0 ml, sortidos	Plásticos Olympus	24-283A
30-300 µ L pipeta multicanal	Eppendorf	3125000052
Anidrido acético (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	400031	98% puro Perigoso: Inflamável, Corrosivo: queima gravemente a pele, danos aos olhos, Toxicidade aguda Manuseio seguro: Mantenha longe de fontes de ignição, trabalhe em uma área ventilada, use luvas
Marcador de acetilcolinesterase cGMP (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	481020	fosfato de potássio dibásico, cloreto de sódio,  fosfato de potássio monobásico, albumina bovina, azida sódica, EDTA, cGMP Traçador AChE Perigo: Perigo para a saúde: toxicidade de órgãos por exposição repetida, Corrosivo: danos oculares Irritante cutâneo e respiratório Manuseio seguro: Trabalho em área ventilada, use luvas
Anti-soro ELISA cGMP (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	481022	fosfato de potássio dibásico, cloreto de sódio,  fosfato de potássio monobásico, albumina bovina,  azida de sódio, EDTA, coelho anti-cGMP policlonal Anti-soro Perigo: Perigo para a saúde: toxicidade de órgãos por exposição repetida, Corrosivo: danos oculares, Irritante cutâneo e respiratório, Toxicidade aguda Manuseio seguro: Trabalhe em uma área ventilada, use luvas
Padrão cGMP ELISA (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	481024	fosfato de potássio dibásico, cloreto de sódio,  fosfato de potássio monobásico, albumina bovina,  azida de sódio, EDTA, padrão cGMP Hazard: Perigo para a saúde: toxicidade de órgãos por exposição repetida, Corrosivo: danos oculares, Irritante cutâneo e respiratório Manuseio seguro: Trabalhe em uma área ventilada, use luvas
Kit ELISA GMP cíclico	Companhia Química Cayman	581021
Concentrado de tampão ELISA 10X (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	400060	1 M de fosfato, 1% de BSA, 4 M de cloreto de sódio, 10 mM de EDTA, 0,1% de azida de sódio Perigo: Perigo para a saúde: toxicidade de órgãos por exposição repetida, Corrosivo: danos oculares Irritante cutâneo e respiratório Manuseio seguro: Trabalhe em uma área ventilada, guarde em um recipiente com tampa que possa ser fechada, use luvas
Reservatório de reagente ELISA	Pierce (agora Thermo Fisher Scientific)	15075
Reagente de Ellman (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	400050	fosfato de potássio dibásico, cloreto de sódio, fosfato de potássio monobásico, acetiltiocolina (iodeto), 5,5'-ditiobio-(ácido 2-nitrobenzóico) Perigo: Toxicidade aguda, Perigo para a saúde: toxicidade de órgãos, Corrosivo: Lesões oculares, Irritante cutâneo, irritante respiratório Manuseio seguro: Trabalhe em uma área ventilada, use luvas
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	320331	Perigo: Corrosivo: corrói o metal, queima gravemente a pele, Danos oculares, Irritante respiratório Manuseio seguro: Trabalhe em uma área ventilada, use luvas
Nitrogênio líquido	Oxigênio de Robert		Nitrogênio Perigo: Gás comprimido: Risco de queimaduras criogênicas, congelamento, asfixia Manuseio seguro: Trabalhe em uma área ventilada, use luvas
Placa revestida com IgG anti-coelho de camundongo (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	400006	Perigo: Nenhum
Novo Classic MF Balance	Mettler Toledo
Agitador Orbital	Stovall Life Science Inc. (agora IBI Scientific)	15-453-211 (varia)
Parafilme	Bemis Company, Inc.	3023-4526 (varia)
Polissorbato 20 (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	400035	Perigo: Nenhum
Hidróxido de potássio (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	400029	85% puro Perigo: Corrosivo: corrói metais e pele, Danos oculares, Toxicidade aguda Manuseio seguro: Trabalhe em uma área ventilada, use luvas
Homogeneizador Precellys Evolution	Tecnologias Bertin	PE000062-PEVO0-A
Kit de Lysing Precellys Homogeneização de Tecidos Duros	Tecnologias Bertin	P000911-LYSK0-A
Leitor de microplacas Sense	HIDEX	425-301
Centrífuga Sorvall Legend Micro 17R	Thermo Fisher Científico	75002441
Pulverizador de tecidos	Britador de células	Kit de britador de células
Vórtice Gênio 2	Indústrias Científicas	SI-0246
Garrafa de lavagem	Sigma-Aldrich	Z423092
Concentrado de tampão de lavagem 400X (no kit cGMP)	Companhia Química Cayman	400062	fosfato de potássio dibásico, fosfato de potássio monobásico, água Perigo: Corrosivo: Danos aos olhos, Toxicidade aguda, Irritante da pele, Toxicidade de órgãos Manuseio seguro: Trabalhe em uma área ventilada, use luvas