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Artigo de método

Hipóxia altera os níveis de miRNAs envolvidos na herança não mendeliana do transtorno do espectro autista em camundongos

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DOI:

10.3791/68435

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11 de julho de 2025

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1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir hipóxia em camundongos neonatais, entregando-os em ambientes controlados com concentrações variáveis de oxigênio. Modelos de camundongos submetidos a variações de oxigênio ao nascimento variaram de forma duradoura a expressão de miRNAs envolvidos na indução de alterações fenotípicas comportamentais, como o autismo.

Resumo

A hipóxia pode ocorrer em graus variados por diferentes razões durante o período perinatal, afetando o desenvolvimento. Nosso objetivo é examinar as consequências da hipóxia neonatal leve a grave em camundongos, com foco em sua potencial ligação com disfunções cerebrais fetais neurodegenerativas relacionadas ao transtorno do espectro do autismo (TEA).

Induzimos hipóxia em camundongos neonatais, entregando-os em ambientes controlados com concentrações variáveis de oxigênio. Os resultados mostraram níveis elevados de HIF-1α (um marcador de hipóxia) no córtex cerebral e no hipocampo, bem como aumento da neurodegeneração nessas regiões. Além disso, observamos expressão alterada de miRNAs relacionados ao TEA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p e miR-499a-5p) em grupos hipóxicos, consistente com resultados anteriores em modelos humanos e animais de TEA. Essas alterações moleculares foram acompanhadas por mudanças comportamentais, como diminuição do movimento, velocidade, interação social e comportamentos repetitivos, bem como uma tendência aumentada de exibir comportamento de busca de canto em camundongos submetidos a condições hipóxicas. Embora alterações comportamentais e moleculares tenham sido detectáveis no grupo 12% O2 (hipóxia leve), as alterações mais pronunciadas foram observadas nos grupos de hipóxia mais grave, em 10% O2 e 8% O2.

No geral, os resultados sugerem que a hipóxia neonatal pode induzir mudanças moleculares duradouras associadas a doenças neurodegenerativas com consequências comportamentais. Além disso, mesmo no parto normal, a exposição à hipóxia durante o desenvolvimento inicial pode prejudicar a memória e o aprendizado. Os resultados destacam a necessidade de detecção e intervenção precoce em recém-nascidos expostos à hipóxia para prevenir problemas neurológicos de longo prazo. Os níveis de miRNAs são regulados durante o desenvolvimento, e suas modificações nos tecidos, especialmente nas células germinativas, constituem um fator de risco para a próxima geração. As análises fornecem uma base para estudar as vias regulatórias que afetam as mudanças funcionais e comportamentais sob hipóxia.

Introdução

Definida como um estado de deficiência de oxigênio, a hipóxia pode provocar respostas celulares e moleculares únicas que são críticas para a compreensão de seu papel em várias patologias. Pode interromper as sequências de desenvolvimento, levando a alterações e lesões moleculares, celulares e neuronais. Além disso, a exposição precoce à hipóxia interrompe o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC), prejudicando a conectividade axonal e o desenvolvimento das sinapses1.

Além disso, embora a hipóxia tenha demonstrado ter efeitos adversos no desenvolvimento do SNC, ela também pode desempenhar um papel fisiológico crítico em condições específicas, como durante a embriogênese. A hipóxia fisiológica normal refere-se a uma situação em que os níveis de oxigênio são naturalmente baixos durante o desenvolvimento embrionário de maneira benéfica. Esse processo permite que as células embrionárias produzam energia promovendo o metabolismo anaeróbico, auxilia no desenvolvimento do sistema circulatório acelerando a vascularização, garante o desenvolvimento adequado do coração e dos ossos e estimula a migração das células da crista neural2. Por outro lado, a hipóxia que ocorre fora de seu contexto fisiológico pode ter efeitos adversos no desenvolvimento e na saúde geral, incluindo o desenvolvimento embrionário, que pode levar à prematuridade ou mesmo à letalidade embrionária1. Trata-se, portanto, de um grande problema de saúde pública, pois muitos recém-nascidos apresentam condições hipóxicas durante o parto normal, muitas vezes sem reconhecimento imediato pelos cuidadores ou pessoal médico3. Além disso, as alternâncias na conectividade neuronal associadas à hipóxia estão ligadas a distúrbios do neurodesenvolvimento, incluindo transtornos do espectro do autismo (TEA) e deficiências intelectuais1.

Do ponto de vista molecular, a hipóxia pode influenciar o neurodesenvolvimento, alterando a expressão de genes que regulam as funções sinápticas, interrompendo assim a conectividade neuronal e contribuindo para o desenvolvimento de distúrbios do neurodesenvolvimento4.

Clinicamente, a hipóxia neonatal afeta o desenvolvimento do SNC por meio de vias hormonais e metabólicas1. Em resposta à hipóxia aguda, o hipotálamo libera rapidamente o hormônio liberador de corticotropina e arginina vasopressina, que então desencadeia a liberação do hormônio adrenocorticotrófico da hipófise anterior, seguida pela produção de glicocorticóides no córtex adrenal fetal e o grau dessa resposta está correlacionado com a intensidade e duração da hipóxia. Essa rápida resposta do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) ao estresse agudo ressalta o papel crítico dos glicocorticóides na limitação dos impactos fisiológicos do estresse e na manutenção da homeostase fetal, influenciando a expressão gênica associada, a síntese de proteínas e o metabolismo celular 5,6.

A diminuição dos níveis normais de oxigênio ativa várias respostas à hipóxia, a maioria das quais é regulada por fatores de transcrição, fatores induzíveis por hipóxia (HIFs) e sensores celulares de oxigênio, como prolil hidroxilases (PHDs)1. O HIF-1, um regulador da homeostase doO2 , conforme mostrado em estudos in vitro 7, é um heterodímero composto por HIF-1α e HIF-1β8. Em condições hipóxicas, a substituição do átomo de hidrogênio por um grupo hidroxila no complexo é reduzida, levando ao acúmulo de HIF-1α, que então dimeriza com HIF-1β. Como resultado, o dímero HIF-1 se transloca para o núcleo, onde ativa a transcrição de centenas de genes1.

A natureza dependente de oxigênio dos neurônios os torna particularmente suscetíveis ao estresse hipóxico. Portanto, a hipóxia pode ter um impacto significativo na fisiologia cerebral, com implicações de longo prazo na função neuronal, prejudicando a descoberta do caminho axonal e o desenvolvimento das sinapses9. Essas alterações nas conexões neuronais podem predispor a vários distúrbios do neurodesenvolvimento, como TEA e deficiência intelectual 9,10.

A asfixia perinatal é definida como privação de oxigênio durante o trabalho de parto e pode ocorrer como resultado de eventos perinatais, como hemorragia materno-fetal, compressão do cordão umbilical, complicações placentárias, ruptura uterina, distocia de ombro ou falha do recém-nascido em respirar pela primeira vez. Esse grave evento afeta aproximadamente quatro milhões de recém-nascidos em todo o mundo a cada ano e resulta em um milhão de mortes neonatais 11,12,13. Embora a maioria dos bebês sobreviva a episódios de hipóxia, alguns pacientes desenvolvem encefalopatia hipóxico-isquêmica, que pode levar a problemas neurológicos permanentes, como distúrbios convulsivos, paralisia cerebral, atrasos cognitivos e déficits motores. Além disso, asfixia e isquemia podem causar disfunção de vários órgãos e sistemas, como SNC (28%), sistema cardiovascular (25%), rins (50%) e pulmões (23%)11.

Além disso, a imaturidade do sistema de vasculatura cerebral e a má autorregulação são fatores predisponentes aos riscos isquêmicos dos recém-nascidos. Nesses processos, a inflamação e o estresse oxidativo são os principais mediadores da lesão hipóxico-isquêmica neonatal e dos mecanismos de morte celular associados. A apoptose anormal pode expor o cérebro em desenvolvimento a riscos de distúrbios motores e cognitivos14.

Dada a complexidade do TEA, é essencial entender a genética subjacente que parece ter uma estrutura poligênica, bem como os fatores ambientais que determinam seu desenvolvimento. Em particular, a base poligênica do TEA implica uma etiologia multifatorial, na qual as predisposições genéticas interagem com fatores externos, incluindo hipóxia. A concordância de 60% a 92% observada em gêmeos monozigóticos destaca a importância das influências genéticas, enquanto a discordância indica que fatores ambientais também desempenham um papel. A prevalência de autismo é estimada em 13/10.000, e acredita-se que essa taxa tenha aumentado nos últimos anos15. Estudos apóiam a hipótese de que a exposição a fatores ambientais durante a gravidez pode aumentar o risco de autismo, mas os resultados desses estudos são muitas vezes inconsistentes devido a diferenças nos critérios diagnósticos, grupos de comparação, tamanho da amostra e métodos de avaliação da exposição15,16.

Embora os achados neuropatológicos distintos não sejam claros, os estudos revelam anormalidades cerebrais microscópicas e funcionais. Essas anormalidades sugerem que o período etiologicamente relevante pode estar no útero e que a patogênese pode começar durante o período pré-natal15. As exposições durante a gravidez são o foco principal da pesquisa epidemiológica sobre potenciais fatores de risco para o autismo. Em particular, a hipótese de que complicações obstétricas podem aumentar o risco de TEA é apoiada por muitos estudos, mas a magnitude e as consequências desses efeitos variam entre os estudos17.

Além dos fatores genéticos, os mecanismos epigenéticos desempenham um papel fundamental na regulação da expressão gênica em condições hipóxicas. Notavelmente, os miRNAs apresentam um mecanismo regulatório chave na resposta celular à hipóxia, como seu impacto no HIF. Durante os estágios iniciais da hipóxia, alterações específicas nos níveis de miRNA podem contribuir para o acúmulo de HIF-1 e a manutenção de níveis estáveis de HIF-2 e HIF-318. Embora o perfil de expressão de muitos miRNAs seja alterado em condições de hipóxia e isquemia, um número limitado de miRNAs associados à hipóxia demonstrou desempenhar um papel funcional e afetar a expressão do HIF . Isso explica por que diferentes tecidos humanos diferem em respostas hipóxicas devido à expressão de miRNA específico do tecido18.

Dados emergentes também indicam que miRNAs específicos foram implicados na patologia do TEA. Em nosso trabalho anterior, demonstramos que o miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p e miR-499a-5p, que são conhecidos por regular a sobrevivência celular, diferenciação e respostas ao estresse no câncer, exibem expressão aberrante em pacientes com TEA, potencialmente influenciando os resultados do neurodesenvolvimento. Em seguida, confirmamos esses achados em amostras de sangue, hipotálamo e esperma de modelos de camundongos com TEA, mostrando uma associação consistente de alterações regulatórias gênicas com a doença19. Esses resultados indicam que a regulação negativa desses miRNAs em estágios cruciais de crescimento e desenvolvimento pode ter um impacto significativo no desenvolvimento de doenças como o TEA. Isso demonstra ainda mais a profunda influência da hipóxia neonatal nas características moleculares e comportamentais.

Neste estudo, testamos o impacto da hipóxia neonatal leve a moderada no risco de desenvolver autismo na idade adulta. Para fazer isso, camundongos neonatais foram expostos a diferentes níveis de hipóxia. De fato, camundongos que experimentaram hipóxia ao nascer exibem mudanças comportamentais na idade adulta e, mais importante, no nível molecular, alterações associadas ao TEA. Assim, nossos resultados forneceram informações valiosas sobre os efeitos a longo prazo da hipóxia.

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Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos Animais Locais da Universidade de Erciyes (HAYDEK) e realizados sob a licença número 21/216.

1. Animais

NOTA: Este estudo envolveu camundongos Balb / c da Unidade Transgênica do Centro de Genoma e Células-Tronco Betül-Ziya EREN (GENKÖK) da Universidade de Erciyes.

  1. Use camundongos Balb/c de 2 meses pesando em média 18-25 g. Manter os ratos a uma temperatura de 20 ± 2°C, com uma humidade de 52 ± 3% num ciclo claro/escuro de 12 h (6-18 h).
  2. Alimente os ratos com pellets de rato padrão, com trocas semanais de roupa de cama, e permita acesso ilimitado a comida e água.
    NOTA: Os estudos moleculares foram realizados nos Laboratórios de Genômica e Hipóxia do GENKÖK e no Laboratório de Histologia e Embriologia da Universidade de Bozok. Um 'ponto de parada' indica onde você pode pausar e preservar seu trabalho na temperatura especificada.

2. Estabelecimento do modelo de hipóxia

  1. Projete o experimento para incluir 4 grupos, incluindo 3 grupos de controle hipóxicos e 1 simulado.
  2. Acasalar camundongos fêmeas saudáveis com camundongos machos saudáveis para formar camundongos fêmeas grávidas saudáveis, que eventualmente serão classificados nos seguintes grupos: hipóxia grave (8% O2) (n = 4), hipóxia moderada (10% O2) (n = 4), hipóxia leve (12% O2) (n = 4) e normóxia (21% O2) como grupo controle simulado (n = 4).
  3. Para induzir a hipóxia, transfira os camundongos prenhes para o laboratório de hipóxia e comece a monitorá-los 72 h antes do dia E21.5.
  4. Detecte o ponto de parto dos camundongos prenhes nos grupos hipóxicos e coloque-os imediatamente em câmaras de hipóxia. Ajustar os níveis de oxigénio para cada câmara conforme descrito para cada grupo (indicado no passo 2.2.).
  5. Mantenha os recém-nascidos em condições hipóxicas por apenas 5 minutos e, em seguida, transfira-os imediatamente para condições normais de alojamento.
    NOTA: Manter os indivíduos em condições hipóxicas por períodos mais longos pode resultar em letalidade.
  6. Use 2 neonatos (escolhidos aleatoriamente) de cada grupo para confirmar o dano induzido por hipóxia e determinar o sexo. Mantenha os filhotes restantes ao lado de suas mães em condições normais de alojamento até o final do período de lactação para testes moleculares e comportamentais adicionais para a fase adulta (ver projeto experimental na Figura Suplementar 1).

3. Determinação do sexo para avaliar possíveis diferenças nos efeitos hipóxicos entre os sexos na fase neonatal

  1. Pese cada camundongo (selecionado aleatoriamente (x2 / grupo)) individualmente para calcular a dose necessária de anestésicos. Administre cetamina a 100 mg / kg e xilazina a 10 mg / kg por via intraperitoneal.
  2. Assim que o camundongo estiver totalmente anestesiado, prossiga com a eutanásia por luxação cervical e colete imediatamente os tecidos da cauda em tubos estéreis marcados de 1,5 mL (um ponto STOP, -80 ° C)
  3. Colete e transfira imediatamente todos os tecidos cerebrais para tubos de centrífuga contendo formaldeído a 10% para análise posterior (um ponto STOP, 25 ° C).
  4. Prepare tecidos para extração de DNA.
    1. Preparar amostras de cauda e descongelar a 25 °C (se necessário). Adicione 300 μL de tampão de lise contendo 1 M Tris, 0,5 M EDTA, 4% de SDS, dH2O e proteinase K às amostras.
  5. Homogeneizar as amostras.
    1. Misturar bem as amostras por vórtice e incubar durante a noite a 55 °C.
    2. No dia seguinte, adicione 100 μL de acetato de amônio e misture brevemente por vórtice. Centrifugue a 12.000 g por 20 min a 25 °C
  6. Execute a separação de fases.
    1. Transfira cuidadosamente a fase aquosa transparente para novos tubos estéreis, rotulados de 1,5 mL.
    2. Adicione 500 μL de isopropanol e incube por 5 min a 25 °C (um ponto STOP, -20 °C). Centrifugue a 12.000 g por 10 min a 25 °C
  7. Lave o pellet de DNA.
    1. Depois de inspecionar o pellet no fundo do tubo, descarte cuidadosamente o sobrenadante.
    2. Adicione 1000 μL de etanol a 70% e bata suavemente no tubo para flutuar o pellet. Centrifugue a 7500 g por 10 min a 25 °C
  8. Purifique o DNA.
    1. Depois de inspecionar o pellet no fundo do tubo, descarte cuidadosamente o sobrenadante.
    2. Use uma micropipeta de 10 μL para remover o etanol residual e deixe secar completamente.
    3. Adicione 100 μL de água livre de nuclease (NFW) para ressuspender o pellet. Incubar a +4 °C durante 10-15 min.
  9. Quantifique e armazene o DNA.
    1. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Conservar amostras de ADN a +4 °C até nova utilização. (um ponto de PARADA).
  10. Realize a reação em cadeia da polimerase (PCR).
    1. Projete primers SRY-F, SRY-R e PAX6-F e PAX6-R indiretos (consulte a Tabela Suplementar 1).
    2. Prepare uma mistura de PCR da seguinte forma (por amostra): 5 μL de tampão PCR (10x), 4 μL de MgCl2, 4 μL de dNTPs, 0,5 μL de cada um dos quatro primers, 31 μL de dH2O e 0,5 μL de Taq polimerase.
      NOTA: A taq polimerase deve ser adicionada por último e imediatamente antes do uso para garantir a amplificação ideal.
    3. Prepare os tubos PCR rotulados e coloque-os em um rack de resfriamento de +4 °C. Distribua 45 μL da mistura nos tubos.
    4. Bata suavemente no bloco para garantir que as gotículas da mistura de PCR estejam no fundo do tubo.
    5. Adicione 5 μL de amostras de DNA e pipete brevemente. Vortex brevemente e depois centrifugue os tubos.
    6. Coloque os tubos na máquina de PCR e defina o programa para as seguintes condições: Inicialmente, incubação a 95 °C por 5 min, 40 ciclos de desnaturação a 94 °C por 1 min, recozimento a 57 °C por 45 s e extensão a 72 °C por 1 min. Após os ciclos, uma extensão final a 72 °C por 10 min, seguida por uma retenção a 40 °C indefinidamente.
  11. Visualize as amostras de resultados usando eletroforese em gel de agarose a 2%.
    NOTA: As amostras que mostram duas bandas são machos e aquelas com apenas uma banda são fêmeas.

4. Confirmação de danos por hipóxia em camundongos neonatais

  1. Avalie microscopicamente os tecidos cerebrais coletados de camundongos sacrificados para confirmar o dano hipóxico e examine imuno-histoquimicamente para testar o HIF-1α.
    1. Fixe e embuta em parafina o tecido.
      1. Conservar os tecidos em formaldeído durante 12 h e depois lavar em água durante 6 h.
      2. Fixe os tecidos desidratando em séries de álcool etílico por 1 dia para cada concentração: 70%, 80%, 90% e 3 h em álcool etílico 100%. Coloque os lenços de papel no xileno por 15 min para limpar.
      3. Transfira os tecidos para as séries de parafina I, II e III por 1 hora cada. Após a terceira hora, oriente as amostras cerebrais adequadamente e incorpore-as em parafina limpa.
      4. Usando um micrótomo rotativo, corte seções de 5 μm de espessura dos blocos de parafina.
    2. Prepare slides.
      1. Para coloração de hematoxilina e eosina (HE), coloque seções em lâminas de vidro comum.
      2. Para imuno-histoquímica, coloque seções em lâminas de vidro carregadas positivamente.
        NOTA: (um ponto STOP), os slides podem ser arquivados nesta fase para avaliação e trabalho posteriores.
    3. Realize a coloração HE.
      1. Mergulhe as amostras em solução de xileno I por 10 min.
      2. Mergulhe as amostras em solução de xileno II por mais 10 minutos.
      3. Transfira as amostras para uma série de concentrações decrescentes de álcool, cada uma por 1 min: 100%, 96% e 80%.
      4. Lave as amostras com água destilada por 2 min.
      5. Mergulhe as amostras em hematoxilina por 8 min e depois lave-as em água destilada por 2 min.
      6. Após a lavagem, trate as amostras com álcool ácido por 1 s, seguido de uma lavagem de 1 min.
      7. Coloque as amostras em água com amônia por 10 s e repita a lavagem de 1 minuto.
      8. Coloque as amostras em álcool 70% por 30 s.
      9. Mergulhe as amostras em eosina por 10 min.
      10. Transfira gradualmente as amostras aumentando as concentrações de álcool por 1 min cada: 96%, 96% e 100%.
      11. Mergulhe as amostras em soluções de xileno I, xileno II e xileno III por 1 min cada.
      12. Cubra com uma lamínula.
    4. Examine usando um microscópio.
      1. Após a coloração HE, examine todos os tecidos cerebrais de cada grupo sob um microscópio óptico.
      2. Avalie as áreas hipocampal e cortical quanto à degeneração neuronal e edema pericelular / perivascular.
  2. Realize a coloração HIF-1α.
    1. Incubar amostras em lâminas carregadas positivamente durante a noite a 67 °C numa incubadora para garantir uma fixação adequada.
    2. Passe seções pelas soluções de xileno I e xileno II para completar a desparafinização.
    3. Reidrate as seções colocando-as sequencialmente em soluções de etanol a 100%, 96%, 80% e 70% por 5 min cada, seguidas de enxágue em água destilada por 5 min.
    4. Desmascarar epítopos por seções de micro-ondas em ácido cítrico 0,01 M (pH 6,0) a 665 W por dois ciclos de 5 minutos.
    5. Resfrie as seções em temperatura ambiente (RT) por 20 min.
    6. Delineie o perímetro das seções com uma caneta hidrofóbica e, em seguida, lave as seções 3 vezes em PBS por 5 min cada.
    7. Incube seções em peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 10 min para bloquear a atividade da peroxidase endógena.
    8. Lave as seções novamente 3 vezes em PBS por 5 minutos de cada vez.
    9. Para evitar a ligação inespecífica de imunoglobulinas, incube seções com um reagente de bloqueio de UV por 7 min.
    10. Incubar secções durante a noite a 4 °C com o anticorpo primário anti-HIF-1α (diluição 1:200).
    11. Lave as seções 3 vezes em PBS por 5 minutos de cada vez.
    12. Aplique o anticorpo secundário biotinilado nas seções e incube em RT por 40 min.
    13. Lave as seções novamente 3 vezes em PBS por 5 minutos de cada vez.
    14. Aplicar a solução de estreptavidina nas secções e incubar durante 30 min à RT.
    15. Lave as seções 3 vezes em PBS por 5 minutos de cada vez.
    16. Desenvolva a reação de coloração aplicando 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) e observando ao microscópio óptico.
    17. Contra-core as seções com solução de hematoxilina Gill II modificada para corar os núcleos.
    18. Desidrate as seções passando-as por concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 96% e 100% de etanol).
    19. Limpe as seções incubando-as em soluções de xileno I e xileno II por 10 minutos cada.
    20. Monte as seções com um suporte de montagem e uma lamínula.
    21. Examine as seções montadas sob um microscópio óptico e avalie as áreas do hipocampo e do córtex pré-frontal.
    22. Meça os níveis de imunorreatividade usando software de processamento de imagem de código aberto.

5. Experimentos comportamentais

  1. Após a confirmação da hipóxia, permita que os camundongos restantes completem o período de lactação com suas mães.
  2. Realize a determinação do sexo no dia 21 pós-natal com base na distância anogenital e, em seguida, aloje os animais em gaiolas diferentes com base em seu sexo. Quando os camundongos dos grupos de controle hipóxico e simulado atingirem 2 meses de idade, submeta-os a experimentos comportamentais.
  3. Antes de realizar testes comportamentais, aclimate os sujeitos ao ambiente de teste por 15 a 30 minutos antes do teste.
  4. Certifique-se de desinfetar todos os dispositivos/aparelhos entre os sujeitos e os ensaios usando etanol a 70%.
  5. Execute o teste de reconhecimento de novos objetos (NOR).
    1. Coloque a câmera em uma posição em que os assuntos possam ser vistos e monitorados com clareza.
    2. Instale o software de rastreamento de vídeo apropriado.
    3. Prepare a arena de teste (uma caixa de 60 cm × 60 × cm × 40 cm) com dois objetos não maiores que o mouse. Certifique-se de que os dois objetos sejam de tamanho e forma semelhantes e facilmente acessíveis (10 cm × 10 cm de distância das paredes e paralelos).
    4. Dia 1: Fase de familiarização:
      1. Coloque o mouse na arena com os dois objetos idênticos. Permita que o mouse explore livremente os objetos por um determinado período de tempo (por exemplo, 10 min).
      2. Durante esta sessão, observe e registre a quantidade de tempo que o mouse passou com cada objeto. Além disso, registre o número de vezes que o mouse se virou ou interagiu com cada objeto
    5. Dia 2: Introdução do novo objeto:
      1. Substitua um dos objetos familiares do dia 1 por um objeto novo (diferente em aparência, textura ou forma).
      2. Retorne o mouse para a arena, permitindo que ele explore livremente novamente pelo mesmo período de tempo da primeira sessão.
    6. Registre o tempo total que o mouse passou com o objeto familiar (do dia 1) e o novo objeto. Registre o número de vezes que o mouse se virou ou interagiu com cada objeto.
    7. Calcule o Índice de Discriminação (DI) para avaliar a memória e o aprendizado do mouse usando a fórmula:
      Índice de Discriminação (DI) = {(Tempo gasto com objeto novo − Tempo gasto com objeto familiar)/(Tempo total gasto com ambos os objetos)} × 100.
      NOTA: Um DI mais alto indica maior interesse no novo objeto, sugerindo melhor memória e habilidades de aprendizado. Um DI próximo a 0 indica nenhuma preferência, sugerindo interesse igual ou uma memória ruim para o objeto familiar.
    8. Use o DI para avaliar objetivamente as habilidades de aprendizado e memória do mouse, com base em sua curiosidade natural e capacidade de reconhecer e diferenciar entre objetos familiares e novos.
  6. Realizar o teste de suspensão traseira (TST)
    1. Instale a câmera em uma posição em que os mouses sejam claramente visíveis e possam ser monitorados. Instale o software de rastreamento de vídeo apropriado.
    2. Prepare a configuração experimental com espaço para acomodar 3 mouses simultaneamente.
    3. Use painéis de papelão de 25 cm de altura com intervalos de 20 cm para isolar os camundongos para que eles não possam se ver durante o teste.
    4. Corte tiras de fita adesiva de 12 cm de comprimento e prenda-as cuidadosamente na cauda de cada mouse, garantindo que a cauda esteja bem presa sem causar danos. Posicione a fita na extremidade da cauda (2 cm) para que o mouse possa ser suspenso sem se machucar.
    5. Grave os mouses por 6 minutos enquanto eles estão suspensos.
    6. No final da duração, pare a gravação, remova o mouse e coloque-o de volta na gaiola da caixa. Analise os vídeos para determinar a duração do movimento ativo e a duração da imobilidade.
      NOTA: Isso fornecerá informações sobre a resposta ao estresse, pois a imobilidade geralmente indica um estado de desamparo ou estresse aprendido. O grau de imobilidade é comumente usado para medir o desespero comportamental ou a resposta ao estresse em camundongos, o que pode estar relacionado aos efeitos do estresse ou estados depressivos.
    7. Com base nos padrões observados de movimento e imobilidade, avaliar o estado emocional e os mecanismos de enfrentamento do estresse de camundongos em resposta à suspensão forçada.
  7. Execute o teste de enterramento de mármore
    1. Encha uma gaiola vazia (20 cm × 35 cm × 15 cm) com 5 cm de altura de espiga de milho. Disponha 20 bolinhas em 5 fileiras com 4 bolinhas cada. Certifique-se de que as bolinhas estejam distribuídas uniformemente pela superfície.
    2. Coloque o assunto em um canto da gaiola, garantindo livre acesso a toda a gaiola.
    3. Dê ao mouse 20 minutos para explorar a gaiola. Durante esse período, o rato pode exibir algum comportamento de enterrar, tentando cobrir as bolinhas de gude com espiga de milho. Após 20 minutos, remova o mouse da gaiola.
    4. Conte o número total de bolinhas de gude que o rato enterrou sob a espiga de milho durante o período de 20 minutos. Registre o número total de bolinhas enterradas, pois esta é a principal medida de comportamento.
      NOTA: O número de bolinhas de gude enterradas é comumente usado como um indicador de ansiedade, comportamento compulsivo ou neofobia em roedores. Um número maior de bolinhas enterradas é frequentemente associado a níveis mais altos de ansiedade ou tendências compulsivas.
    5. Com base no número total de bolinhas de gude enterradas, avalie comportamentos relacionados à ansiedade e tendências compulsivas em camundongos, que podem ser usados para avaliar os efeitos de tratamentos ou condições experimentais.
  8. Realize o teste de interação social.
    1. Instale a câmera em uma posição em que os mouses sejam claramente visíveis e possam ser monitorados.
    2. Conecte a câmera ao computador e configure o software de rastreamento de vídeo apropriado. Monte uma caixa retangular (60 cm × 40 cm × 25 cm) com duas paredes (40 cm × 25 cm) com duas portas (8 cm) para separar as três câmaras.
    3. Coloque uma gaiola (15 cm × 10 cm) contendo um camundongo familiar ao sujeito do experimento e outra gaiola (15 cm × 10 cm) contendo um camundongo que não teve interação anterior com o sujeito do experimento.
    4. Comece a gravar e coloque o assunto no compartimento do meio.
      NOTA: Os camundongos usados neste teste, exceto os animais experimentais, devem ser do mesmo sexo e saudáveis.
    5. Monitore o assunto por 5 minutos e grave-o com a câmera de vídeo. No final da duração, pare a gravação, remova o mouse e coloque-o de volta na gaiola da caixa.
    6. Usando o software SIT, analise o tempo de interação social e as tendências de novidade social dos camundongos e compare-os com o grupo de controle simulado.
      NOTA: Mais tempo gasto em comportamentos sociais (por exemplo, aliciamento ou cheiro) e menos tempo gasto evitando ou exibindo agressão podem ser interpretados como demonstração de alta sociabilidade. Evitar a interação, passar mais tempo isolado ou exibir maior agressividade pode sugerir ansiedade, retraimento social ou redução da capacidade de interagir socialmente.
  9. Realize o teste de campo aberto.
    1. Posicione a câmera onde os mouses possam ser vistos claramente e monitorados. Conecte a câmera ao computador e configure um software de rastreamento de vídeo adequado.
    2. Monte a arena de teste (uma caixa de 60 cm × 60 cm × 40 cm) e divida a caixa com linhas imaginárias para criar 16 quadrados.
    3. Comece a gravar e coloque cuidadosamente o mouse no centro da arena. Observe e registre o comportamento do mouse por 5 min.
    4. No final da duração, pare a gravação, remova o mouse e coloque-o de volta na gaiola da caixa.
    5. Usando o software de rastreamento, meça os comportamentos externos e internos de caminhada, escalada, fuga, higiene, imobilidade, travessias totais, defecação e micção para avaliar os níveis de ansiedade, atividade locomotora, exploratória e emocional dos sujeitos.
  10. Realize o teste do labirinto aquático de Morris (MWM).
    1. Preparar o labirinto de 120 cm de diâmetro e 60 cm de profundidade numa posição estável num laboratório comportamental a 23 ± 1 °C.
    2. Divida o labirinto em quatro quadrantes imaginários e pendure diferentes pistas visuais (em forma e cor) no centro de cada quadrante das paredes do labirinto a aproximadamente 20 cm da base. Posicione uma plataforma de 17 cm de comprimento e 10 cm de diâmetro a 20 cm da parede.
      NOTA: O labirinto, as pistas e a plataforma não devem mudar de posição ou localização para que os ratos possam treinar sua memória com precisão.
    3. Encha o labirinto com água a 21-26 °C até 1 cm abaixo da plataforma e tinga-o com um corante acrílico preto multi-superfície.
      NOTA: no caso de usar outras linhagens de camundongos, a água deve ser colorida com uma cor de contraste dos camundongos para poder monitorá-los.
    4. Coloque a câmera em uma posição que capture a imagem completa e conecte-a ao software MWM no computador.
      NOTA: O local da plataforma deve ser atribuído no programa para o quinto dia de teste.
    5. O teste dura 5 dias com quatro tentativas cada. Nos primeiros quatro dias, comece a gravar e inicie o teste colocando cuidadosamente o sujeito em um quadrante diferente a cada dia, com o rosto voltado para a parede do tanque.
    6. Atribua o local da plataforma no cronograma de teste do dia 5.
      NOTA: Isso evita que os sujeitos formem uma memória associativa. A colocação cuidadosa dos objetos na água e a manutenção da temperatura correta são essenciais para evitar a adição de estresse externo. Os testes duram 5 minutos e terminam automaticamente quando (i) a plataforma é atingida (ii) o limite de tempo de 5 minutos expira. Ao longo dos dias, os participantes devem aprender a localização da plataforma e encontrá-la em menos tempo.
    7. No quinto dia, remova a plataforma e coloque cuidadosamente os ratos em um quadrado do labirinto, conforme descrito anteriormente.
      NOTA: O teste termina automaticamente quando (i) o mouse encontra e pisa na plataforma, (ii) o limite de tempo de 5 minutos expira. Indivíduos saudáveis devem encontrar a localização da plataforma anterior. O software calculará automaticamente o tempo que o mouse levou para encontrar a plataforma em cada tentativa e ajudará a avaliar a memória de curto e longo prazo e as habilidades de aprendizado dos sujeitos.

6. Confirmação de danos por hipóxia em camundongos adultos

  1. Após a conclusão do teste comportamental, sacrifique os sujeitos por luxação cervical.
  2. Colete tecido hipocampal e amostras de sangue de 6 camundongos de cada grupo, incluindo o grupo de controle simulado, para análise molecular (seção 7).
  3. Coloque os cérebros dos 4 camundongos restantes em solução de formaldeído a 10% para examinar os efeitos da exposição à hipóxia durante o período neonatal na morfologia do cérebro adulto.
  4. Use a mesma técnica explicada anteriormente na seção 4 para realizar análises histológicas de cérebros de camundongos adultos.

7. Isolamento total de RNA de amostras de fase adulta

  1. Adicione 500 μL de trizol a cada amostra de tecido e 500 μL de sangue.
  2. Para o tecido cerebral, homogeneizar as amostras usando uma seringa.
  3. Incubar a mistura em RT durante 5 min.
  4. Adicione 200 μL de clorofórmio a cada tubo e incube por mais 5 min em RT.
  5. Centrifugue a 12.000 g por 20 min a +4 °C.
  6. Transfira cuidadosamente a fase aquosa (RNA) para um novo tubo estéril.
  7. Adicione isopropanol (proporção de 1:1 para a fase aquosa) e incube a mistura durante a noite. (um ponto de PARAGEM/-20 °C).
  8. No dia seguinte, centrifugue a 12.000 g por 10 min a +4 °C.
  9. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 1000 μL de etanol a 75% ao sedimento.
  10. Centrifugue a 7.500 × g por 5 min a +4 °C.
  11. Repita a etapa de lavagem com etanol duas vezes.
    NOTA: se o pellet for muito pequeno, uma lavagem é suficiente.
  12. Rejeitar o sobrenadante e deixar o pellet secar ao ar em RT.
  13. Depois de completamente seco, ressuspenda o pellet com 50 μL de NFW e incube em gelo a +4 °C por 10-15 min.
  14. Meça a concentração de RNA espectrofotometricamente.
  15. Armazene amostras de RNA a -80 °C até uma análise posterior.

8. Síntese de DNA complementar (cDNA)

  1. Trabalhando em um rack de resfriamento de +4 °C, prepare as amostras de RNA isoladas do sangue e dos tecidos cerebrais.
  2. Prepare os tubos de PCR rotulados.
  3. Misture os reagentes do kit de síntese de cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Preparar um total de 14 μL da mistura de reacção para cada amostra e distribuí-la pelos tubos.
  5. Adicione 6 μL de amostra de RNA à mistura.
  6. Realize a síntese de cDNA no dispositivo de PCR seguindo as condições de temperatura e tempo especificadas pelo fabricante.
    NOTA: O cDNA sintetizado nesta fase pode ser armazenado a -80 °C até uso posterior.
  7. Diluir o cDNA sintetizado na proporção de 1:5.
  8. Armazene o cDNA diluído a -80 °C para análise futura de qPCR.

9. PCR quantitativo em tempo real para expressão de miRNA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p e RNA nuclear pequeno U6 como controle de normalização)

  1. Projete os primers para cada miRNA (consulte a Tabela Suplementar 2 para sequências).
  2. Prepare a mistura de reação PCR de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Dispense 14 μL da mistura de reação em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços.
  4. Adicione 6 μL do cDNA diluído 1:5 a cada poço para um volume total de reação de 20 μL.
  5. Realize PCR em duplicata para cada amostra para minimizar a variação seguindo este programa: Desnaturação inicial a 95 ° C por 120 s, 45 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 10 s, recozimento e amplificação a 56 ° C por 60 s e análise da curva de fusão a 60 ° C por 15 s, depois a 95 ° C.
  6. Analise os resultados usando valores de Ct (limite de ciclo) e normalize os dados usando o método 2-ΔΔCt .

10. Análise estatística

  1. . Avalie a normalidade dos dados usando histogramas, gráficos Q-Q e o teste de Shapiro-Wilk para analisar os dados de expressão de miRNA.
    1. Se os dados forem distribuídos normalmente, use ANOVA unidirecional.
    2. Se os dados não forem normalmente distribuídos, aplique o teste de Kruskal-Walli, teste t de Student ou teste U de Mann-Whitney.
  2. Ao avaliar as diferenças de gênero dentro de cada grupo, use o teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney, dependendo da distribuição dos dados. A significância estatística é determinada por um valor de p de <0,05.
    NOTA: Todas as análises devem ser realizadas usando software estatístico apropriado. Aqui, o GraphPad Prism 8 é usado.
  3. Avalie a normalidade dos dados usando histogramas, gráficos Q-Q e o teste de Shapiro-Wilk para analisar os resultados dos experimentos comportamentais.
    1. Se os dados forem distribuídos normalmente, use uma ANOVA bidirecional.
    2. Para dados que não são normalmente distribuídos, execute o teste de Kruskal-Walli, teste t de Student ou teste U de Mann-Whitney.
    3. Avalie as diferenças de gênero dentro de cada grupo usando o teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney, dependendo da distribuição dos dados. Novamente, considere os resultados estatisticamente significativos se o valor de p for < 0,05.
  4. Para análises imuno-histoquímicas, use ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Tukey para comparar grupos femininos e masculinos.
  5. Para comparar grupos femininos e masculinos dentro de cada condição de hipóxia, use o teste post-hoc de Sidak. A significância estatística é determinada se o valor de p for < 0,05.

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Resultados

Neste estudo, camundongos Balb/c prenhes foram expostos a condições hipóxicas de 8% O2 (grave), 10% O2 (moderado) e 12% O2 (leve) durante o parto, e os camundongos recém-nascidos foram mantidos sob essas condições hipóxicas por 5 min para estabelecer modelos de hipóxia neonatal leve, moderada e grave. O grupo designado como grupo de controle simulado foi submetido a condições de nascimento normóxicas (21% O2) e, em seguida, foi autoriz...

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Discussão

A hipóxia perinatal, um importante problema de saúde neonatal, pode causar alterações moleculares, celulares e neuronais ao interromper processos críticos de desenvolvimento e tem sido associada a vários distúrbios do neurodesenvolvimento, incluindo transtorno do espectro do autismo (TEA)1. Embora a hipóxia grave tenha sido amplamente estudada por seus efeitos imediatos, as consequências a longo prazo da hipóxia leve a moderada durante o período perinatal permanec...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TÜBİTAK), e os autores agradecem a Celalettin Göktaş (instalação de animais transgênicos) e à bióloga Selda Taşdemir (laboratório comportamental).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(-20 ° C) FreezerSiemens KD86NAWE0N
(+4 & deg; C) BlocoBiociência Antagenhttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 & deg; C) GeladeiraSiemens KD86NAWE0N
(-20 ° C) BlocoClivagem Cientificohttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
Etanol AbsolutoMerck1070172511
Acetato de AmônioSigma238074-500G
Balanço Analítico  Adam EquipmentLAB214i
ClorofórmioMerck1024451000
Ácido Cítrico  Merck100241
ComputadorHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTASigmaE9884-1KG
Entellan Merck107961
EosinaMerck109844
Ependorf (1,5 mL)?solab078.03.021
Sistema EthovisionNoldushttps://noldus.com/ethovision-xt
EtuvNUVEEN 400/500 N/A
Falcon Tubes (15 mL)Isolab078.02.001
FormaldeídoMerck104002
Câmera de CalorSamsungSC2000
HematoxilinaMerck105175
HIF-1 & alfa; AnticorpoBiossbs-20398R 
Câmaras de Hipóxia BiospherixCâmara A
IsoproponenteMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Gaula do Teste de Enterramento de MármoreVishnu https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
Tubos de microcentrífuga (1,5 mL)Greiner616201
Ponteiras de micropipeta (100 & micro; L)Greiner774353
Pontas de micropipeta (1000 & micro; L)Greiner778353
Micropipetas (10 & micro; L)GilsonFD10001
Micropipetas (100 & micro; L)GilsonFD10004
Micropipetas (1000 & micro; L)GilsonFD10003
Pontas de Micropipeta (10 & micro; L)Greiner772353
Micropipetas (2 & micro; L)GilsonGFAM00064
MicroscopiaOlympusBx53
Kit de Síntese de Sintese de DNA MIRCURY (Kit de Síntese de CDNA)Qiagen339340
Kit de PCR Verde MIRCURY LNA SYBRQiagen339346
Placas multipoçoRoche4729692001
Nano EspectrofotômetroShimadzuC101-E112
Arena do Teste de Reconhecimento de Objetos NovosBiotecnologia Global137
Arena do Teste em Campo AbertoBiotecnologia Global117
Oxycycler BiospherixA42OC
Parafina Leica 39602012
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
Dispositivo de PCRSensoquestT3-0140
Giro de placasPeqlab91-PSPIN-P
PrismaGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Proteinase KSigmaP6556-10MG
Reagente de Isolamento do Reagente de Lise QIAzolQiagen79306
SDSSigma8170342500
Anticorpo Secundário  AbcamA0545-1ML
As três câmaras do Teste de Interação SocialBiotecnologia Global118
SpinGilsonPMC880
Seringa (2 mL)Baybihttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
Configuração do Teste de Suspensão TraseiraSelf Made, você pode encontrar algo semelhante na Harvard ApparatusSelf Made, você encontra algo semelhante em (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
TermomisturadorEppendorf#5355
Base TrizmaSigma1503-1KG
VórticeHeidolph541-10000-00-1
Xilenes Isolab 9,90,01,92,501

Referências

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