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Artigo de método

Gerenciamento pós-transplante de fígado e coleta de amostras em esquilos terrestres daurianos para sequenciamento de RNA de célula única

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DOI:

10.3791/68443

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16 de setembro de 2025

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1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve procedimentos para armazenamento refrigerado prolongado de fígado e transplante ortotópico no esquilo terrestre dauriano (DGS; Spermophilus dauricus), um hibernador sazonal típico. Inclui métodos para colher enxertos de fígado e amostras de sangue para avaliações prognósticas e processá-los para estudos baseados em células únicas.

Resumo

A recuperação funcional do enxerto e a imunocompatibilidade enxerto-hospedeiro representam grandes preocupações prognósticas após o transplante hepático. Criticamente, os modelos convencionais de roedores usando ratos ou camundongos oferecem informações limitadas sobre os mecanismos de lesões do enxerto induzidas por hipotermia durante a preservação. Essa lacuna ressalta a necessidade de modelos alternativos. Como os enxertos de fígado do esquilo terrestre Daurian adaptável ao frio (DGS; Spermophilus dauricus) pode sustentar a preservação prolongada do frio e, portanto, apoiar a alta capacidade de sobrevivência em DGSs pós-transplante, consequentemente, este protocolo detalha os cuidados essenciais com os animais pós-cirúrgicos e o monitoramento fisiológico necessário para indivíduos transplantados com DGS. Além disso, fornece procedimentos padronizados para a preparação de amostras de enxerto hepático de alta qualidade para técnicas analíticas a jusante, incluindo sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) para perfil transcriptômico e exame histopatológico. A geração bem-sucedida de amostras de enxerto DGS bem preparadas é o passo inicial crucial na aplicação de metodologias tradicionais e de ponta para estudar esse modelo não convencional, mas altamente relevante. Este protocolo aborda as informações multiômicas para DGS, facilitando assim pesquisas futuras sobre intervenções cirúrgicas e modelagem de doenças não apenas em roedores hibernantes, mas também em outros organismos especializados.

Introdução

Nas últimas duas décadas, mais e mais pesquisadores reconheceram que as capacidades adaptativas superiores das espécies em hibernação oferecem oportunidades inestimáveis para descobrir novos mecanismos de adaptação biológica e podem inspirar avanços em vários campos médicos, como preservação de órgãos e reabilitação metabólica 1,2,3,4,5,6,7,8 . O primeiro protocolo cirúrgico abrangente para preservação prolongada do fígado com frio e transplante ortotópico em um hibernador, o esquilo terrestre Daurian (DGS; Spermophilus dauricus), foi recentemente estabelecido. Aparentemente, a natureza adaptativa ao frio do DGS permite o armazenamento prolongado a frio dos enxertos do doador e a alta sobrevida pós-transplante dos animais receptores. Assim, é necessário um protocolo de acompanhamento para monitorar a recuperação pós-operatória dos animais e preparar amostras para vários estudos histopatológicos e ômicos.

Dadas as diferenças fisiológicas significativas entre os DGSs e os modelos padrão de roedores, e as mudanças fisiológicas complexas e dinâmicas pós-transplante de fígado nos animais receptores, a obtenção de amostras de alta qualidade deles é crucial para as análises a jusante e, portanto, para a compreensão da fisiologia enxerto-hospedeiro pós-transplante. Além de obter, processar e examinar amostras de sangue e tecido hepático com métodos convencionais, uma dissociação bem-sucedida das células parenquimatosas do fígado que são hepatócitos e das células não parenquimatosas (NPCs) que incluem células endoteliais, células estreladas, células de Kupffer e outras células imunes permitiria a elucidação das complexas interações celulares e moleculares pós-operacionais com as multiômicas baseadas em células únicas em rápido desenvolvimento. Para tanto, o método clássico baseado na perfusão de colagenase foi desenvolvido desde o início da década de 1950 e continuamente refinado 9,10,11. No entanto, a estrutura anatômica distinta do fígado DGS, as aderências pós-operatórias induzidas pela reconstrução vascular e as alterações fisiológicas desencadeadas pela cirurgia nos enxertos hepáticos exigem um ajuste fino das condições de extração.

Este protocolo fornece uma diretriz detalhada para o manejo pós-operatório e coleta de amostras em DGSs após transplante de fígado. Especificamente, este protocolo permite o isolamento de hepatócitos de enxertos hepáticos com alto rendimento e viabilidade celular, e detalha o processamento subsequente de hepatócitos isolados para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq).

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional da Universidade de Pequim para Cuidados e Uso de Animais (LSC-WangSQ-2). Os DGSs usados neste estudo foram produzidos em laboratório por fêmeas grávidas capturadas na pastagem da cidade de Zhangjiakou. Os animais tinham cerca de 1-2 anos de idade na época do experimento. DGS, tanto masculino quanto feminino, e pesando entre 180 g e 400 g, foram utilizados como doadores e receptores. O peso do receptor foi ligeiramente maior que o do doador, com uma diferença inferior a 50 g. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cuidados pós-transplante

  1. Alojar os DGSs pós-transplante de fígado em um ambiente quente e limpo sob um ciclo claro/escuro de 12:12, com ração de laboratório padrão e água fornecida ad libitum.
  2. Monitore o peso corporal diariamente, avalie a incisão abdominal quanto a sangramento e observe o estado mental e os níveis de atividade do receptor.
  3. Imediatamente após a operação, administrar injeção subcutânea de cefuroxima (16 mg/kg) e buprenorfina (0,05 mg/kg) a cada 12 h por 3 dias.
  4. Injete tacrolimo (1 mg / kg) por via intramuscular diariamente até 24 h antes da coleta do tecido.
    NOTA: Uma vez que os DGSs são derivados principalmente de capturas selvagens, os fatores imunológicos do transplante permanecem não negligenciáveis. O transplante entre DGSs é considerado transplante alogênico (não transplante singênico). Se o estudo precisar excluir fatores imunológicos, como rejeição, certifique-se de que o tacrolimo seja padronizado no pós-operatório.

2. Preparação da amostra do enxerto hepático

  1. Preparação de soluções e instrumentos
    1. Prepare 50 mL de HBSS com 500 μM EGTA (livre de Ca2+ e Mg2+; pH 7,4). Pré-aqueça em banho-maria a 40 °C antes de usar.
    2. Dissolva a colagenase IV (0,4 mg / mL) em 50 mL de HBSS (com Ca2+ e Mg2+) e incube em banho-maria a 40 ° C por 30 min.
    3. Solução de Percoll: Misture Percoll com 10× PBS em uma proporção de 9: 1 (v / v) e dilua com 1× PBS em uma proporção de 9: 1 (v / v) em um tubo de 15 mL. Mantenha a solução no gelo.
      NOTA: 5 mL de solução de Percoll a 90% são suficientes por DGS.
    4. Mergulhe os instrumentos cirúrgicos em etanol a 70% por 30 min antes de usar.
    5. Monte o sistema de perfusão composto por uma bomba peristáltica com velocidade ajustável, tubulação de silastic e banho-maria. Lave a tubulação com solução salina morna para purgar as bolhas de ar e conecte um filtro estéril de 0.22 μm à saída da tubulação.
      NOTA: Antes de purgar as bolhas de ar, é necessário enxaguar a tubulação reutilizada executando etanol a 70% completamente por 15 min, seguido de um enxágue completo com ddH2O por 15 min para eliminar o etanol residual.
  2. Procedimento animal
    1. Anestesiar o DGS pós-transplante por meio de injeção intraperitoneal de tribromoetanol a 2,5% na dose de 1 mL / 100 g de peso corporal. Realize testes de perda de reflexos, como reação ao beliscão do dedo do pé, para garantir a anestesia completa.
    2. Raspe o pelo abdominal e prenda o DGS na mesa cirúrgica com o lado ventral voltado para cima.
    3. Pulverize etanol 70% sobre a área abdominal do animal e, em seguida, abra a cavidade abdominal fazendo uma grande incisão cruzada da pele e do peritônio com tesouras afiadas e pinças dentadas.
    4. Mova suavemente os intestinos para a direita fora da cavidade abdominal com um cotonete até que o enxerto de fígado, a veia porta (VP) e a veia cava inferior (VCI) estejam claramente expostos (Figura 1A).
      NOTA: Devido a aderências pós-operatórias na cavidade abdominal após o transplante de fígado, disseque suavemente as aderências usando um cotonete úmido.
    5. Insira uma seringa de 5 mL na VCI abaixo do estoma anastomótico para coletar 1-2 mL de sangue e aplique imediatamente uma leve pressão no local da punção com um cotonete seco para obter hemostasia após retirar a agulha do vaso (Figura 1B).
      NOTA: Para minimizar o sangramento, a agulha pode ser substituída por uma seringa de 1 mL, que é cerca de 30 G.
    6. Com a orientação de chanfro, puncione suavemente o PV usando um cateter 22-G em um ângulo de 15° em relação à superfície do vaso, seguido de retração da agulha do cateter. Assim que a punção bem-sucedida for confirmada, avance suavemente a cânula mais 1-1,5 cm através do vaso. Fixe a posição da cânula usando uma pinça vascular (Figura 1C).
      NOTA: Se a cânula for colocada corretamente, um refluxo de sangue será visível. Se a canulação de PV falhar ou encontrar desafios técnicos, mude para a canulação da VCI infra-hepática e designe a VP como a via de saída do perfuso.
    7. Inicie a bomba de perfusão com solução salina quente a 6-8 mL / min e, em seguida, conecte o filtro de 0,22 μm mencionado acima à cânula.
    8. Uma vez iniciada a perfusão via PV, faça uma incisão na VCI para permitir a drenagem do sangue. São necessários 50-80 mL de soro fisiológico para perfusão adequada (Figura 1D).
      NOTA: A perfusão bem-sucedida é confirmada quando o fígado transplantado faz a transição para uma cor amarelo-esbranquiçada pálida durante este processo. Algumas áreas vermelhas escuras de congestão podem permanecer na superfície do fígado e não podem ser completamente eliminadas, provavelmente resultantes de trauma hepático intraoperatório, como lesão de isquemia-reperfusão.
    9. Após perfusão adequada com 50-80 mL de solução salina morna, pause a bomba.
    10. Ligue o lobo lateral esquerdo em sua base com sutura de seda 2-0, seguida de excisão do lobo distal ao local da ligadura. Da mesma forma, o lobo mediano é ligado em sua base e ressecado usando o mesmo método (Figura 1E, F).
      NOTA: A hepatectomia parcial é realizada para maximizar a utilização do fígado transplantado para vários fins experimentais e para reduzir o consumo de tampão colagenase, facilitando a digestão completa do fígado.
    11. Divida o tecido hepático ressecado em várias partes: uma porção é usada para isolamento de NPC seguido de scRNA-seq, as outras porções são fixadas em paraformaldeído a 4% para seccionamento histológico ou congeladas em nitrogênio líquido para outros experimentos.
      NOTA: A etapa 2.2.11 pode ser executada por outra pessoa simultaneamente com as próximas etapas para economizar tempo.
    12. Isolamento de NPCs. Corte os tecidos em aproximadamente 1-2 mm3 pedaços no meio RPMI-1640 e digeridos enzimaticamente com gentleMACS de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). A viabilidade celular e a concentração celular foram determinadas usando um contador de células automatizado.
      NOTA: As etapas 2.2.12 e 2.2.13-2.3.5 prosseguem simultaneamente.
    13. Corte o diafragma e clampeie a VCI supra-hepática (Figura 1G).
    14. Transfira a tubulação de entrada para o tampão EGTA pré-aquecido. Reinicie a bomba a uma taxa de 6-8 mL / min.
    15. Clampeie periodicamente a VCI por 5-10 s para facilitar a distribuição uniforme da solução de perfusão por todo o parênquima hepático. O fígado incha visivelmente durante o clampeamento e relaxa após a liberação.
      NOTA: É fundamental evitar a interrupção prolongada da drenagem, pois o bloqueio prolongado corre o risco de romper o tecido conjuntivo fino ao redor do fígado, interrompendo a perfusão ou a dinâmica dos fluidos no leito capilar hepático. Além disso, a obstrução sustentada pode comprometer a viabilidade celular e reduzir o rendimento devido à sensibilidade dos hepatócitos às forças mecânicas.
    16. Após a perfusão com 40-50 mL de solução EGTA, inicie a perfusão do tampão colagenase a uma taxa de 4-6 mL/min por 8-10 min. Prenda brevemente o vaso sanguíneo do efluente como nas etapas acima (Figura 1H).
      NOTA: Após 5-6 minutos de perfusão de colagenase, o fígado fica visivelmente mais macio e aparecem fissuras superficiais. Se essas alterações morfológicas estiverem ausentes, reduza a velocidade de perfusão para 3-4 mL / min e estenda o tempo total de digestão para 12-13 min. Após a conclusão de 50 mL de perfusão de colagenase, o fígado exibe uma consistência friável, semelhante ao tofu, que é um indicador de digestão suficiente (Figura 1I).
    17. Pare a bomba e remova a cânula. Corte o fígado do corpo, coloque-o em um prato de 5 cm com 10 mL de meio DMEM/F12 gelado.
  3. Purificação de hepatócitos
    1. Rasgue o fígado para liberar células e transfira a solução celular para um cônico de 50 mL com um filtro de 70 μm colocado por cima.
    2. Após centrifugar a suspensão celular a 50 x g durante 3 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 20 ml de PBS 1×. Repita esta etapa 3 vezes. Ressuspenda o pellet celular com 5 ml de meio DMEM/F12 após a última centrifugação.
    3. Misture suavemente a suspensão celular com um volume igual de solução de Percoll a 90% em um tubo de 15 mL. Centrifugue a 200 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Após a centrifugação de Percoll, a mistura se separa em três camadas distintas: a camada superior (aproximadamente 0,5-1 mL) contém células mortas, enquanto os hepatócitos viáveis estão concentrados na camada inferior (aproximadamente 0,5-0,8 mL) (Figura 2). Um rendimento de 5-8 × 107 hepatócitos viáveis com viabilidade de >80% é normalmente obtido com este protocolo. (Figura 3A, B).
    4. Aspire as células mortas e o sobrenadante com cuidado, evitando perturbações vigorosas das camadas, e ressuspenda as células viáveis com 10 mL de meio DMEM/F12. Centrifugue a 50 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os hepatócitos purificados com 1-5 mL de PBS 1× suplementado com 2% de soro fetal bovino até uma concentração final de 500-1200 células / μL.
    6. Misture os hepatócitos e NPCs em uma proporção de quantidade de 1:1, ou seja, a suspensão celular foi preparada misturando 10.000 hepatócitos e 10.000 NPCs.
  4. ScRNA-seq
    NOTA: As etapas 2.4.1-2.4.3 foram executadas de acordo com o guia do usuário do kit de preparação da biblioteca de expressão gênica de célula única 3 ′ baseado em gotículas12. A plataforma de particionamento microfluídico de célula única baseada em gotículas e código de barras foi empregada, que engloba etapas críticas de geração de grânulos de gel em emulsões (GEM), construção de biblioteca de cDNA e sequenciamento Illumina seguindo protocolos padrão.
    1. Para realizar a geração de GEM e código de barras, use uma suspensão celular contendo 20.000 hepatócitos e NPCs. A eficiência de captura de células não é inferior a 60%.
    2. Para amplificação de cDNA, limpe as amostras pós-GEM-RT de acordo com o guia do usuário12.
    3. Construção de biblioteca
    4. Sequencie bibliotecas de RNA de célula única usando uma plataforma de sequenciamento para atingir uma profundidade de 150 Gb por amostra; Demultiplexar arquivos de chamada base bruta em arquivos FASTQ usando o Cell Ranger (v8.0.0).
    5. Alinhe os arquivos FASTQ ao genoma de Ictidomys tridecemlineatus (acesso NCBI: GCF_016881025.1) para quantificação de expressão, completando o fluxo de trabalho experimental.

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Resultados

O exame histológico dos enxertos armazenados a 4 °C por 24 h e transplantados para DGS revelou arquitetura normal do lóbulo hepático com sinais mínimos de inflamação, necrose ou colestase nos dias 3 e 6 de pós-operatório, comparável ao grupo operado simuladamente (Figura 4A-C).

O isolamento dos hepatócitos decíduos do SGD pós-operatório demora aproximadamente 1 h. Utilizando o protocolo descrito, mais de 5 × 107 hepatóc...

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Discussão

Seguindo o protocolo que descreve a preservação e transplante do frio hepático do doador em DGSs, os procedimentos aqui descritos detalham o monitoramento pós-operatório e o manejo farmacológico personalizado de DGSs transplantados com um fígado armazenado a frio por pelo menos 24 h. Esse protocolo permite a sobrevida do receptor além de 7 dias após o transplante, exibindo claras vantagens dos hibernadores como modelos de pesquisa para preservação de órgãos13,14

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Projeto Principal de Ciência e Tecnologia Nacional de Doenças Crônicas Não Transmissíveis (2023ZD0507600), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82170671, 92254301, 32230048, 82371794, 32301306), Programa Nacional de P&D (2024YFA0916804) e Fundação de Talentos Acadêmicos da Fundação de Educação da Universidade de Zhejiang.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 e vezes; PBSBiografia do serviçoG4202
10 vezes; PBSBiografia do serviçoG4207
4% de paraformaldeídoBiosharpBL539A
BuprenorfinaShafeiH12020276
Cânula (22 G)BBRAUNNº 4254090B
CefuroximaSelleckE4838
Placa de cultura de células (60 mm)NINHO705001
Colagenase IVSigma-AldrichC5138
Tubo cônico (15 mL)NINHO601052
Tubo cônico (50 mL)NINHO602052
CotoneteLoja de material doméstico
Countstar Contagem de Células AutomatizadasRuiyuCountstar Rigel S2
DMEM/F12GibicoC11330500BT
EGTASigma-AldrichE4378
FBSGibco10099-141
Filtrar (0,22 μ m)Merck MilliporeSLGP033RB
Filtro (70 μ m)Biologix15-1070
gentleMACSMiltenyi130-093-235
HBSS (com Ca2+ e Mg2+)Biografia do serviçoG4204
HBSS (sem Ca2+ e Mg2+)Biografia do serviçoG4203
Kit de dissociação de NPCsMiltenyi130-096-730
PercollCytiva17-0891-09
Bomba peristálticaYuyanBT100
RPMI-1640GibicoC11875500BT
SalinoSRBSRB009
SeqüenciadorIllumina NovaSeq X Plus
Tubulação de SilasticTygonE-3603
Sutura de sedaÍCONESA845G
Seringa (1mL)Ciência LigeLG05-124Apenas agulha de seringa será necessária
Seringa (2mL)Ciência LigeLG05-124Apenas o barril da seringa será necessário
TacrolimusSelleckS5003
Pipeta de transferênciaBiologix30-0138A1
Álcool tribromoetílicoSigma-AldrichT48402
Banho-mariaSubvençãoSAP2

Referências

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  3. Zhang, X., et al. Cold-induced Foxo1 nuclear transport aids cold survival and tissue storage. Nat Commun. 15 (1), 2859(2024).
  4. Zhang, L., et al. Cross-species metabolomic profiling reveals phosphocholine-mediated liver protection from cold and ischemia/reperfusion. Am J Transplant. 24 (11), 1979-1993 (2024).
  5. Chen, L., et al. Synergy of 5-aminolevulinate supplement and cx3cr1 suppression promotes liver regeneration via elevated igf-1 signaling. Cell Rep. 42 (8), 112984(2023).
  6. Arnold, C. Hibernation science harnessed to treat obesity and modify metabolism. Nat Med. 30 (10), 2700-2703 (2024).
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  8. Carey, H. V., Andrews, M. T., Martin, S. L. Mammalian hibernation: Cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature. Physiol Rev. 83 (4), 1153-1181 (2003).
  9. Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-c14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
  10. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic Cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
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  13. Hadj-Moussa, H., Storey, K. B. Bringing nature back: Using hibernation to reboot organ preservation. FEBS J. 286 (6), 1094-1100 (2019).
  14. Ratigan, E. D., McKay, D. B. Exploring principles of hibernation for organ preservation. Transplant Rev (Orlando). 30 (1), 13-19 (2016).
  15. Merriman, D. K., Lahvis, G., Jooss, M., Gesicki, J. A., Schill, K. Current practices in a captive breeding colony of 13-lined ground squirrels (Ictidomys tridecemlineatus). Lab Anim (NY). 41 (11), 315-325 (2012).
  16. Vaughan, D. K., Gruber, A. R., Michalski, M. L., Seidling, J., Schlink, S. Capture, care, and captive breeding of 13-lined ground squirrels, Spermophilus tridecemlineatus. Lab Anim (NY). 35 (4), 33-40 (2006).

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