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Artigo de método

Armazenamento e transplante de fígado a frio nos esquilos terrestres daurianos adaptáveis ao frio

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DOI:

10.3791/68444

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3 de julho de 2025

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1Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, 3NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 4Key Laboratory of Organ Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Organ Transplantation Clinical Medical Research Center of Hubei Province, 6Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University, 7Guangdong Province engineering laboratory for transplantation medicine, Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, 8Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 9College of Life Science, Shenyang Normal University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de armazenamento e transplante de fígado a longo prazo em esquilo terrestre Daurian (DGS), que tem sido tecnicamente desafiador em modelos padrão de roedores.

Resumo

No transplante hepático, a recuperação funcional dos enxertos de doadores após armazenamento refrigerado prolongado é um grande desafio. O mesmo obstáculo se aplica aos modelos padrão de roedores (por exemplo, camundongos e ratos) para transplante de fígado, apesar de seus protocolos cirúrgicos bem estabelecidos, restringindo assim a pesquisa em tópicos-chave, como recuperação funcional pós-transplante e imunocompatibilidade hospedeiro-enxerto. Aqui, estabelecemos com sucesso um novo modelo de transplante de fígado usando um hibernador obrigatório, o esquilo terrestre Daurian (DGS; Spermophilus dauricus), que demonstra adaptação intrínseca a transições ultraprofundas de hipotermia-reaquecimento e isquemia-reperfusão. Em nossas mãos, o transplante de enxertos hepáticos após armazenamento refrigerado de 24 horas resultou em 100% de sobrevida dos receptores de DGS dentro do período de observação de 7 dias, enquanto o mesmo procedimento em ratos Sprague-Dawley (SD) teve 0% de sobrevida 24 horas após a cirurgia. Assim, o DGS e outros modelos de mamíferos adaptáveis ao frio fornecem uma plataforma única e robusta para investigar os mecanismos subjacentes à adaptação ao frio de órgãos e tolerância ao transplante, o que pode apoiar o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento ou cirurgia no campo da medicina de transplante.

Introdução

O reaquecimento a frio e a isquemia-reperfusão são contribuintes significativos para a lesão do enxerto hepático, aumentando o risco de disfunção precoce do enxerto. Embora o transplante de fígado em organismos roedores padrão, como camundongos e ratos, tenha sido estabelecido com sucesso 1,2, porque os estudos sobre essas espécies intolerantes ao frio fornecem informações limitadas sobre os mecanismos de adaptação ao frio, os avanços na preservação de órgãos e na medicina de transplante foram prejudicados.

O desenvolvimento de modelos de pesquisa de transplante em espécies adaptáveis ao frio adequadas pode preencher essa lacuna. Por exemplo, os hibernadores de mamíferos evoluíram para sobreviver a longos períodos de baixa temperatura ambiente e / ou escassez de alimentos 3,4. Durante a hibernação, sua fisiologia transita em ciclos de estados de excitação entorpecidos e interbout, de modo que eles estão bem adaptados para manter uma temperatura corporal central baixa e suportar um rápido reaquecimento e reperfusão sanguínea. Notavelmente, os esquilos terrestres que podem hibernar demonstram mais resiliência a lesões de isquemia-reperfusão, mesmo em seu estado ativo e eutérmico, do que os ratos 5,6. Nos últimos anos, estudos inspirados em hibernadores revelaram alguns mecanismos de adaptação ao frio e alvos drogáveis que podem ser modulados para aliviar significativamente as lesões induzidas pelo armazenamento refrigerado e melhorar a recuperação funcional de tecidos e órgãos isolados de espécies não hibernantes 7,8,9,10,11.

Adaptado de protocolos desenvolvidos para transplante de fígado em ratos 12,13,14, apresentamos aqui um protocolo para aquisição de fígado, armazenamento refrigerado estático e transplante em esquilo terrestre dauriano (DGS; Spermophilus dauricus), uma espécie de roedor em hibernação que reside no norte da China. Em nossas mãos, os receptores de enxerto DGS tiveram 100% de sobrevida pós-transplante com enxertos de doadores eutérmicos (ativos) ou hipotérmicos (entorpecidos) armazenados a 4 ° C em solução da Universidade de Wisconsin (UW) por 24 h. Em contraste, a taxa de sobrevivência em ratos Sprague-Dawley (SD) submetidos ao mesmo fluxo de trabalho foi de 0%, mostrando claramente a vantagem do modelo de transplante de fígado DGS. Esperamos que o armazenamento refrigerado de longo prazo e o transplante de outros órgãos no DGS ou outras espécies adaptáveis ao frio criadas em laboratório, como o esquilo terrestre de 13 linhas (Ictidomys tridecemlineatus) e o hamster sírio (Mesocricetus auratus), também possam ser alcançados, proporcionando oportunidades únicas para os pesquisadores estudarem a recuperação funcional do enxerto a longo prazo e a compatibilidade hospedeiro-enxerto e testarem novos medicamentos.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional da Universidade de Pequim para Cuidados e Uso de Animais (LSC-WangSQ-2). Os instrumentos apropriados utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais e representados na Figura 1.

NOTA: O manuseio e a reprodução de espécies de roedores hibernantes capturados na natureza, como os esquilos terrestres de 13 linhas, em um ambiente de laboratório foram descritos15,16. Os DGSs usados neste estudo foram produzidos em laboratório por fêmeas grávidas capturadas na pastagem da cidade de Zhangjiakou. Eles tinham cerca de 1-2 anos de idade na época do experimento. Quanto às DGSs fêmeas grávidas originais, os parasitas foram expelidos antes que os animais chegassem ao laboratório. A quarentena e a inspeção de vírus comuns foram realizadas após a chegada dos animais, e aqueles com resultados negativos nos testes foram criados nas instalações.

1. Preparo pré-operatório

  1. Animais experimentais
    1. Utilizar DGS adulto, 1-2 anos, masculino e feminino, com peso entre 180 g e 400 g como dadores e recetores. O peso do receptor foi ligeiramente maior que o do doador, com uma diferença inferior a 50 g.
    2. Use ratos SD adultos, 8-10 semanas, machos e fêmeas, pesando 200-300 g, como doadores e receptores no grupo controle. Durante todo o procedimento experimental, use máscaras cirúrgicas, jalecos e luvas de nitrilo, bem como luvas de couro extra pesadas durante o manuseio e transferência de animais DGS.
  2. Faça manguitos para a veia porta (VP) e veia cava inferior infra-hepática (IHIVC) usando bainhas introdutoras 6 F e 8 F, respectivamente. Cada manguito era composto por um corpo principal e extensões medindo 2 mm de comprimento. Crie vários sulcos ao redor da circunferência do manguito prendendo suavemente com pinça de mosquito (Figura 2).
    NOTA: Os diâmetros do PV e do IHIVC variam significativamente dependendo do tamanho e sexo do DGS. Portanto, é aconselhável preparar os manguitos 5-F, 6-F, 7-F e 8-F no pré-operatório para a seleção apropriada. Normalmente, um manguito 5-F ou 6-F é adequado para o PV, enquanto um manguito 7-F ou 8-F é apropriado para o IHIVC.
  3. Faça stents para o ducto biliar (3 mm) e artéria hepática (2 mm) cortando cateteres intravenosos de 22 G e 24 G em tubos inclinados de dupla face usando um bisturi.
    NOTA: Evite aplicar pressão excessiva nos stents, pois isso pode levar ao estreitamento ou oclusão do lúmen, comprometendo a sobrevida do receptor.

2. Operação do doador

  1. Passos iniciais
    1. Use 5% de concentração de isoflurano a uma taxa de fluxo de ar de 1 L / min para induzir a anestesia e 2% a 1 L / min para manutenção.
    2. Posicione o DGS em decúbito dorsal em uma placa. Raspe o pelo da região abdominal e esterilize a pele com iodopovidona e etanol 70%.
  2. Isolamento hepático antes da perfusão
    1. Faça uma incisão cruzada estendendo-se do apêndice xifóide até a sínfise púbica e lateralmente até as linhas axilares médias. Retraia o processo xifóide usando uma pinça de mosquito e coloque uma seringa de 5 mL sob as costas como suporte.
    2. Transecto do ligamento falciforme. Isole a veia diafragmática esquerda da veia cava inferior supra-hepática (SHIVC) e ligue-a com uma sutura 7-0. Cauterize o ligamento hepato-esplênico.
    3. Libere cuidadosamente o IHIVC acima da veia renal direita dos tecidos circundantes usando cotonetes. Ligue as veias adrenal e lombar direitas que drenam para o IHIVC perto do fígado com suturas 7-0.
    4. Faça uma pequena incisão na parede anterior do ducto colédoco (CBD). Insira o stent do ducto biliar e prenda-o com uma sutura de seda 7-0. Deixe uma extremidade da sutura com aproximadamente 5 mm de comprimento para facilitar a anastomose posterior com o CBD do receptor.
    5. Isole a artéria hepática (HAP), a artéria gastroduodenal (GDA) e a artéria hepática comum (ACS) adequadas dos tecidos circundantes.
    6. Administrar 1,5 mL de soro fisiológico heparinizado (300 UI/mL) na veia peniana (doadores masculinos) ou IHIVC (doadores femininos).
  3. Perfusão hepática
    1. Isole a aorta abdominal abaixo da veia renal esquerda. Insira uma agulha intravenosa 7 G na aorta e prenda-a com uma pinça.
    2. Incise o diafragma e coloque uma pinça vascular na aorta torácica.
    3. Perfunda o fígado através da cânula aórtica com 20-30 mL de solução fria de UW a uma taxa de 180-210 mL / h usando uma bomba de infusão. Incisar a veia cava intratorácica e a IHIVC acima da veia renal direita para permitir o efluxo do perfusato.
      NOTA: Ajuste a posição dos lobos do fígado usando cotonetes para garantir uma perfusão uniforme, prestando atenção especial aos lobos médio e direito. A perfusão é completa quando todo o fígado exibe uma palidez uniforme.
    4. Durante a perfusão, excise a vesícula biliar.
      NOTA: Ao contrário dos ratos, o DGS possui uma vesícula biliar. A remoção da vesícula biliar e a lavagem dos ductos biliares com solução de UW são essenciais para prevenir a obstrução biliar pós-operatória devido à coagulação biliar.
  4. Coleta de enxerto hepático pós-perfusão
    1. Usando microfórceps, isole o PV do tecido conjuntivo circundante. Ligue e corte a veia pilórica com uma sutura 7-0. Passe o tronco PV ao nível da veia esplênica.
    2. Ligue e corte o GDA distalmente. Crie uma pequena incisão na parede anterior do ACS. Insira o stent da artéria hepática no ACS e fixe-o com uma sutura de seda 7-0, deixando uma extremidade com aproximadamente 5 mm de comprimento para facilitar a anastomose posterior com o ACS do receptor.
    3. Disseque o SHIVC o mais próximo possível do diafragma.
    4. Disseque as ligações entre o lobo caudado e o estômago. Depois de cortar os ligamentos dorsais, mobilize totalmente o fígado.
    5. Coloque o fígado em uma tigela de aço de 7 cm contendo solução fria de UW. Transfira a tigela para uma geladeira a 4 ° C para preservação.
      NOTA: Para preservação do resfriado hepático superior a 24 h, adicione antibióticos à solução UW para reduzir o risco de infecção; considere substituir a solução UW a cada 24 horas.

3. Preparo do enxerto ex vivo

NOTA: Prepare um recipiente de gelo aberto. Toda a preparação da mesa de trás foi feita no gelo.

  1. Prenda a alça do manguito PV com uma pinça vascular e estabilize-a usando uma pinça de mosquito. Passe suavemente o PV pelo manguito, garantindo que não ocorra torção. Dobre o PV sobre o manguito e prenda-o com uma sutura 7-0 (Figura 3).
  2. Repita o procedimento acima (etapa 3.1) para o manguito IHIVC.
  3. Perfunda o ducto biliar através do ducto cístico com 2 mL de solução UW. Em seguida, ligue o ducto cístico.
  4. Lave o enxerto hepático com 8-10 mL de solução salina fria através do manguito PV para remover a solução residual de UW após o armazenamento refrigerado.
  5. Coloque uma única sutura de seda 7-0 ao redor do IHIVC entre o manguito anexado e o lobo inferior direito do fígado.
  6. Gire o fígado para expor seu aspecto superior. Lugar 8-0 suturas em ambos os cantos laterais do SHIVC, inserindo-se do exterior para o interior.

4. Operação do destinatário

  1. Para as etapas iniciais, consulte o protocolo de operação do doador e repita a etapa 2.1.
  2. Isolamento do fígado do receptor
    1. Realize uma incisão na linha média do processo xifóide até a sínfise púbica. Retraia o processo xifóide cranialmente usando uma pinça de mosquito e posicione uma seringa de 5 mL abaixo para elevar o SHIVC. Retraia lateralmente os arcos costais bilaterais.
    2. Realize o gerenciamento de ligamentos e vasos conforme descrito na etapa 2.2.2.
    3. Isolar o IHIVC conforme descrito no passo 2.2.3.
    4. Corte as ligações ligamentares entre o fígado e o retroperitônio. Passe cuidadosamente uma pinça cega atrás do SHIVC e coloque uma sutura de seda 7-0 ao redor dele.
    5. Ligue o CBD proximalmente com uma sutura de seda 7-0 e corte-o acima da ligadura. Use uma ponta de algodão para separar suavemente o ducto biliar do PV.
    6. Transeccione o GDA e o PHA entre as ligaduras. Crie uma bifurcação em forma de Y no final do ACS. Deixe um comprimento de sutura de 2 cm na ligadura PHA para uso posterior.
    7. Libere os ramos direito e esquerdo do PV. Coloque suturas de 5 cm, 7-0 em cada ramo para posterior manipulação.
  3. Remoção do fígado do receptor
    1. Reduza a concentração de isoflurano para 0,5% com um fluxo de ar de 0,5 L/min.
      NOTA: Mantenha uma frequência respiratória de aproximadamente uma respiração por segundo ajustando o vaporizador de isoflurano. Avalie continuamente a profundidade da anestesia durante toda a fase anepática para evitar consciência intraoperatória ou anestesia excessiva que leve à depressão respiratória.
    2. Clampeie o IHIVC acima da veia renal direita, seguido pelo clampeamento do PV acima da veia pilórica. Injete 1,5 mL de solução salina no PV direito em 10 s usando uma seringa de 2 mL para liberar o sangue do fígado.
    3. Retraia suavemente o diafragma puxando a sutura de seda 7-0 colocada ao redor do SHIVC e, em seguida, aplique uma pinça de buldogue no SHIVC, incluindo uma parte do diafragma.
    4. Transeccione o SHIVC logo acima do fígado. Prenda as suturas de permanência 7-0 em ambos os ramos PV e corte o PV acima dessas ligaduras. Passe o IHIVC próximo ao parênquima hepático. Remova imediatamente o fígado, cortando quaisquer anexos ligamentares restantes.
  4. Reconstrução SHIVC
    1. Posicione o enxerto hepático ortotopicamente dentro da cavidade abdominal. Utilize o 8-0 anexado suturas para colocar suturas em ambos os cantos do SHIVC do receptor, inserindo de dentro para fora e prendendo com nós.
    2. Puxe suavemente a extremidade solta da sutura direita lateralmente usando um clipe vascular para alinhar o SHIVC.
    3. Suturar a parede posterior com 8 a 10 pontos contínuos, começando no canto esquerdo. Prossiga para fechar a parede anterior com 10-12 pontos, movendo-se da direita para a esquerda usando a mesma sutura. Antes de completar o fechamento da parede anterior, lave a cavidade SHIVC para expelir o ar e evitar embolia gasosa (Figura 4).
  5. Reconstrução de VP
    1. Eleve o VP usando as suturas de 5 cm colocadas em ambas as bifurcações, aplicando tração suave para cima com pinças de vaso. Faça uma incisão no ponto médio dos ramos PV.
    2. Lave o lúmen da VP com solução salina heparinizada (300 UI/mL) e, em seguida, insira o manguito na VP e prenda-o com uma sutura de seda 7-0.
    3. Libere sequencialmente as pinças na VP e SHIVC para restabelecer a perfusão do enxerto e encerrar a fase anepática (Figura 5).
  6. Realize a anastomose IHIVC de forma semelhante ao procedimento de VP. Solte a sutura 7-0 ao redor do lado doador primeiro e, em seguida, remova a pinça do lado receptor.
  7. Reconstrução da artéria hepática
    1. Aplique um clipe microvascular para obstruir o fluxo sanguíneo no ACS do receptor.
    2. Crie uma pequena incisão na bifurcação da configuração Y no terminal do ACS do receptor. Lave o lúmen do ACS com soro fisiológico heparinizado (300 UI/mL) e, em seguida, insira o stent no ACS e fixe-o com uma sutura de seda 7-0.
    3. Amarre as suturas de permanência nos lados doador e receptor para evitar o deslocamento do stent. Solte o clipe microvascular para restaurar o fluxo arterial (Figura 6).
  8. Reconstrução do ducto biliar:
    1. Faça uma pequena incisão na parede anterior do CBD do receptor. Insira o stent do ducto biliar no lúmen do CBD do receptor e prenda-o com uma sutura de seda 7-0.
    2. Amarre as suturas de permanência em ambos os lados doador e receptor para evitar o deslocamento do stent (Figura 7).
  9. Feche a incisão abdominal em duas camadas usando pontos contínuos 3-0 após a conclusão dos procedimentos de reconstrução (Figura 8).

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Resultados

As durações médias dos procedimentos cirúrgicos foram as seguintes: cirurgia do doador em média de 24,8 ± 2,3 min, operação da mesa traseira 15,4 ± 1,3 min, cirurgia do receptor 52,7 ± 5,1 min e fase anepática 14,2 ± 1,5 min.

Os receptores de enxertos hepáticos preservados em solução fria de UW por 24 h apresentaram uma taxa de sobrevida de 100% aos 7 dias pós-transplante, independentemente de e...

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Discussão

Com base na técnica de manguito duplo2 de Kamada, estabelecemos com sucesso o primeiro modelo de transplante de fígado ortotópico no DGS. Devido às diferenças anatômicas entre o DGS e os modelos tradicionais de ratos, considerações específicas na preparação do material, procedimentos cirúrgicos e manejo pós-operatório são essenciais.

Fatores como hibernação e reservas de gordura contribuem para variações significativas de peso individua...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Principal de Ciência e Tecnologia Nacional de Doenças Crônicas Não Transmissíveis (2023ZD0507600) e pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82371794 e 82170671). O trabalho também foi patrocinado pela Fundação de Educação da Universidade de Zhejiang, Fundação de Talentos Acadêmicos Shusen Lanjuan. Também gostaríamos de agradecer à professora Dana K. Merriman, da Universidade de Wisconsin, Oshkosh, por seu trabalho na criação de esquilos terrestres de 13 linhas e por compartilhar generosamente insights úteis e experiências em modelos de roedores hibernantes de criação em laboratório.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Suturas 3-0 com agulhasJinhuan Medical Products Co., LtdR315Para fechamento da pele
Sutura de seda 7-0Braintree, sci, incSUT-S103
7F Introdutor Sheath Beijing Demax Medical Technology Co., Ltd.DQ07083818SBraço para IHIVC
8-0 Suturas com agulhasJinhuan Medical Products Co., Ltd.H821Para anastomse SHIVC
Revestimento de Introdução 8F Beijing Demax Medical Technology Co., Ltd.DQ08083818SBraço para IHIVC
Máquina de AnestesiaRWD life Science Co.R500
Cautério de Paragem de SangueNingbo Shunye Medical Co., Ltd.BDD-YE-DT-1
Grampo de buldogue (levemente curvado)Jinzhong Medical Products Co., Ltd.XEC120SHIVC
BuprenorfinaInstituto de Pesquisa Farmacêutica de Tianjin Pharmaceutical Co., LtdH12020275Analgésico
Cefuroxim sódicoEsseti FarmaceuticiS.r.lH20160013Antibiótico
CotonetesFuqing Health & Medicina Integral20230R
Pinça micro curvaRWD life Science Co.F11031-11Ferramenta cirúrgica
Microtesouras curvas66 Vision Tech Co., Ltd.54108BFerramenta cirúrgica
Swabs de gazeYubei Medical Materials Co., LTD21080274
Injeção de heparina sódicaNorth China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
Bomba de InfusãoHowkmed Co., Ltd.HK-400
IsofluranoRWD life Science Co.21070201
Suporte micro para agulhasWorld Precision Instruments Co., Ltd.555408NTFerramenta cirúrgica
Clipe micro para vasoRWD life Science Co.R31005-06PV e IHIVC
Aplicador de clipe micro VesselRWD life Science Co.R34001-14Ferramenta cirúrgica
Suporte de agulhaRWD life Science Co.F31025-13Fechamento abdominal
Soro fisiológicoZhejiang Tianrui Pharmaceutical Co., Ltd716092103
Micro pinças retasRWD life Science Co.F11029-11Ferramenta cirúrgica
Microscópio cirúrgicoLeicaM650
Plataforma cirúrgicaN/AN/APersonalizado, magnético
Pinças teciduaisRWD life Science Co.F12002-12Ferramenta cirúrgica
Tesoura de tecidoRWD life Science Co.S12003-09Ferramenta cirúrgica
Solução UWSistemas de Recuperação de ÓrgãosSPS-1Perfusão e armazenamento de órgãos & nbsp;

Referências

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  3. Dausmann, K. H., Glos, J., Ganzhorn, J. U., Heldmaier, G. Hibernation in a tropical primate. Nature. 429 (6994), 825-826 (2004).
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  16. Merriman, D. K., Lahvis, G., Jooss, M., Gesicki, J. A., Schill, K. Current practices in a captive breeding colony of 13-lined ground squirrels (Ictidomys tridecemlineatus). Lab Anim (NY). 41 (11), 315-325 (2012).
  17. Lehmann, T. G., Bunzendahl, H., Langrehr, J. M., Neuhaus, P. Arterial reconstruction in rat liver transplantation-a new tubing technique of the common hepatic artery. Transpl Int. 18 (1), 56-64 (2005).

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