Diagnóstico rápido de infecção por Mycobacterium tuberculosis e resistência a medicamentos com base em PCR de fluorescência em tempo real

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para detecção de Mycobacterium tuberculosis e sua resistência a drogas usando a tecnologia de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real (qPCR).

Resumo

A tuberculose (TB) é um grande problema de saúde que afeta desproporcionalmente as populações vulneráveis. O surgimento e a disseminação da tuberculose resistente a medicamentos representam uma séria ameaça à saúde pública global. Os métodos diagnósticos tradicionais para Mycobacterium tuberculosis (MTB), como baciloscopia e cultura, têm limitações significativas e muitas vezes resultam em atraso no tratamento clínico. Para enfrentar esse desafio, foi desenvolvido um esquema de diagnóstico eficiente baseado em PCR fluorescente em tempo real. Os ácidos nucleicos MTB de alta qualidade podem ser extraídos de amostras de teste e o status de resistência pode ser identificado nos principais locais de resistência. Em comparação com os métodos tradicionais, essa abordagem reduz significativamente o tempo de detecção para apenas algumas horas, permitindo a determinação do status de infecção e resistência logo após a visita inicial do paciente. A sensibilidade de detecção excede 85% e a especificidade chega a 95%. Essa tecnologia não invasiva não apenas minimiza o desconforto do paciente, mas também oferece suporte a diagnósticos precisos em instituições médicas de base devido ao seu baixo custo e alta eficiência. No geral, a abordagem representa uma melhoria significativa no diagnóstico de TB.

Introdução

A tuberculose (TB), uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium tuberculosis (MTB), está entre as dez principais causas globais de morte¹. A tuberculose resistente a medicamentos (TB-DR) representa um desafio significativo para os esforços de controle da TB. O Plano de Ação para a Construção de Comunidades Livres de TB (2022-2027), emitido pelo Centro Chinês de Controle e Prevenção de Doenças (China CDC), enfatiza a necessidade de triagem precoce de resistência a medicamentos em todos os pacientes com TB pulmonar confirmada bacteriologicamente². Ele defende a adoção de novas tecnologias de diagnóstico molecular para aprimorar as capacidades de detecção de TB-DR, encurtar os prazos de diagnóstico, maximizar a identificação de casos de TB-DR, garantir tratamento e gerenciamento padronizados e implementar as medidas de controle de infecção necessárias³. Além disso, o Aviso sobre o Fortalecimento da Prevenção e Controle da TB-DR (nº 4, 2023) determina a promoção nacional de técnicas avançadas de diagnóstico. Ele recomenda a triagem de resistência oportuna para todos os pacientes com TB confirmados bacteriologicamente para alcançar a triagem universal, melhorar a padronização diagnóstica e melhorar a acessibilidade aos cuidados de saúde⁴.

DR-TB refere-se a casos de TB resistentes a pelo menos um medicamento anti-TB. As classificações atuais incluem TB resistente à rifampicina (RR), monorresistente, polirresistente, multirresistente (MDR), pré-extensivamente resistente a medicamentos (pré-XDR) e extensivamente resistente a medicamentos (XDR). Uma metanálise global da epidemiologia da TB-DR revela taxas de resistência alarmantes: TB-MDR em 11.6%, resistência à isoniazida em 15.7%, resistência à rifampicina em 9.4% e monorresistência em 11.8%. Esses dados ressaltam a gravidade e a complexidade da TB-DR⁵.

Rifampicina e isoniazida são medicamentos fundamentais para o tratamento da tuberculose. No entanto, a Organização Mundial da Saúde (OMS) observa que, embora as tecnologias de diagnóstico rápido para resistência à rifampicina estejam disponíveis, faltam ferramentas análogas para a resistência à isoniazida. Essa lacuna impede o diagnóstico oportuno da TB multirresistente (TB-MDR). A definição provisória de "TB resistente à rifampicina" reflete essa limitação diagnóstica, destacando a capacidade insuficiente de detectar rapidamente a resistência a outras drogas ^6,7. A OMS estima que os casos de TB resistentes à isoniazida são duas vezes mais prevalentes do que os casos resistentes à rifampicina. A dependência exclusiva da triagem de resistência à rifampicina corre o risco de negligenciar a TB monorresistente à isoniazida (Hr-TB)⁸. Pacientes com TB-Hr não detectados tratados com esquemas padrão enfrentam riscos elevados de falha do tratamento, recidiva e progressão para TB-MDR⁹. A resistência ao etambutol também é preocupante. Como um medicamento crítico para o tratamento de TB e MDR-TB, a pesquisa de linha de base DR-TB de 2017 da China relatou taxas de resistência ao etambutol de 4,9% em novos casos e 17,2% em casos de retratamento¹⁰.

Atualmente, para a detecção da resistência aos medicamentos da tuberculose residual, a cultura artificial ainda é o método preferido em alguns laboratórios, mas a tecnologia de PCR fluorescente em tempo real é superior aos métodos convencionais na detecção de resistência a medicamentos da tuberculose: detecção e quantificação: a PCR fluorescente em tempo real fornece análise quantitativa precisa por meio do monitoramento em tempo real de sinais fluorescentes, enquanto os métodos convencionais carecem dessa precisão. Os métodos tradicionais de experimento são demorados e trabalhosos, requerem pessoal treinado e são altamente subjetivos. Pelo contrário, a PCR em tempo real captura sondas e sinais fluorescentes por computador, minimizando erros humanos. Os métodos convencionais de análise de dados são mais subjetivos, enquanto a PCR em tempo real alcança uma análise precisa e objetiva por meio de curvas de amplificação, curvas padrão e outros métodos de análise. Esses avanços tornam a PCR fluorescente em tempo real o método preferido para detectar a resistência aos medicamentos da tuberculose¹¹.

Em resumo, a tuberculose resistente a medicamentos (TB-DR) emergiu como uma crise global. A resistência aos principais medicamentos - isoniazida, rifampicina e etambutol - complica ainda mais os esforços de controle da tuberculose. A detecção oportuna e precisa da resistência aos medicamentos é crucial para orientar regimes de tratamento personalizados, melhorar o sucesso terapêutico e mitigar a ameaça da TB-DR.

Para enfrentar o desafio diagnóstico, este estudo utilizou um kit que pode identificar Mycobacterium tuberculosis e detectar mutações resistentes a medicamentos em 3,5 h usando amostras de escarro. Isso foi conseguido com o suporte de qPCR de fluorescência em tempo real. O método é simples, econômico e preciso, tornando-o uma ferramenta valiosa na luta contra a TB-DR.

Protocolo

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética do Hospital da Quinta Divisão do Corpo de Produção e Construção de Xinjiang; O número de ética é LLWYH2025001 e não há conflito ético. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de amostras

1. Use frascos de escarro com tampa de rosca padronizados internacionalmente recomendados pela Organização Mundial da Saúde (OMS) ou caixas de plástico lacradas e caixas de papel encerado para coletar amostras de escarro.
2. Rotule os recipientes de escarro com o nome do paciente, número (o número de sequência ambulatorial para novos pacientes ou o número de registro para pacientes de acompanhamento), itens de exame e números de sequência do recipiente 1, 2, 3 (1 = escarro imediato no mesmo dia, 2 = escarro noturno, 3 = escarro matinal no dia seguinte). Para pacientes sem escarro, colete amostras por meio de coleta de escarro induzido por aerossol.
   NOTA: A equipe deve avaliar a qualidade das amostras de escarro coletadas. O volume da amostra geralmente deve ser mantido em 3-5 mL. As amostras qualificadas incluem expectoração seca, expectoração marrom manchada de sangue, expectoração contendo uma pequena quantidade de sangue fresco ou expectoração mucosa. Amostras não qualificadas, como saliva, devem ser reenviadas para teste após orientação adicional.

2. Pré-processamento de escarro

1. Adicione 1-2 vezes o volume da solução de NaOH a 4% ao recipiente de escarro com base no volume do escarro coletado. Agite e misture o conteúdo por 2 min.
2. Coloque o recipiente em uma cabine de biossegurança em temperatura ambiente por 15 min, agitando-o várias vezes durante este período para garantir a liquefação completa do escarro.
   NOTA: Manuseie o NaOH com cuidado devido à sua natureza corrosiva. Se o escarro não estiver totalmente liquefeito, aumente o tempo de agitação. Esta etapa é particularmente importante ao longo do experimento.

3. Preparação do reagente (área de pré-PCR)

1. Preparação de reagentes: Prepare os reagentes na área de pré-PCR designada. Descongele os reagentes congelados à temperatura ambiente. Vórtice por 5-10 s. Centrifugue a 3000 × g por 5-10 s em temperatura ambiente.
   NOTA: Este reagente é um sistema duplo (A/B) e deve ser preparado separadamente.
2. Preparação da mistura principal de PCR
   1. Mistura A: Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, combine (n + 3) × 19,6 μL de RIF PCR Mix A e (n + 3) × 0,4 μL de enzima TB. Vórtice por 5-10 s. Centrifugue a 3000 × g por 5-10 s em temperatura ambiente (PCR Mix A: 60 μL).
   2. Mistura B: Em outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, combine (n + 3) × 19,6 μL de RIF PCR Mix B e (n + 3) × 0,4 μL de enzima TB. Vórtice e centrífuga como acima (PCR Mix B: 60 μL).
3. Armazenamento e uso: Armazene as misturas master preparadas a ≤−18 °C. Se não for usado imediatamente, use dentro de 4 h.
   NOTA: O mesmo protocolo se aplica aos reagentes EMB e INH.
4. Aliquotação da mistura principal de PCR: Dispense 20 μL de PCR Mix A e Mix B em tubos de reação de PCR de paredes finas separados. Transferir os tubos alíquotos em sacos selados para a área de extração.

4. Extração de ácido nucleico e carregamento de amostras (área de extração)

1. Centrifugue 1,2 mL de escarro totalmente liquefeito a 15.058 × g por 5 min em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e reter o sedimento. Opcional: Centrifugue toda a amostra digerida se o equipamento permitir.
2. Ressuspenda o pellet em 1,2 mL de solução salina, vórtice e centrifugue a 15.058 × g por 5 min em temperatura ambiente. Repita esta etapa de lavagem três vezes.
3. Adicione 250 μL de tampão de extração TB ao pellet. Vórtice e realizar lise térmica a 99 °C por 10 min. Resfrie à temperatura ambiente. Centrifugar a 15,058 × g durante 1 min à temperatura ambiente e recolher o sobrenadante (amostra extraída).
   NOTA: Para amostras viscosas, aumente o volume do tampão de liquefação ou estenda o tempo de vórtice. Se as amostras forem apenas para extração de DNA, prolongue o tempo de liquefação para garantir a digestão completa.
4. Usando uma micropipeta, adicione 5 μL de amostra extraída ou controles negativos/positivos a cada tubo de reação de paredes finas de PCR. Sele os tubos imediatamente e rotule adequadamente.
5. Tubos de PCR carregados em vórtice por 5-10 s e centrifugam brevemente (5-10 s). Tubos de transferência para a área de amplificação de PCR.

5. Amplificação por PCR (área de amplificação)

NOTA: Programas para detecção de resistência à rifampicina, etambutol e isoniazida foram definidos em um termociclador Hongshi (Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3). As condições de ciclismo estão incluídas.

1. Coloque os tubos de reação de paredes finas de PCR carregados no termociclador para amplificação.
2. Acesse a interface do ciclador. Clique em Experiment Wizard e selecione o tipo de experimento como Standard Melt Curve (como mostrado na Figura 1).
3. Clique em Editor de placas, selecione horizontalmente dois poços em branco adjacentes e atribua o modelo de medicamento correspondente no painel direito para definir uma amostra (conforme mostrado na Figura 2).
4. Configure controles negativos/positivos e informações de amostra. Clique em Iniciar para iniciar o programa. A duração é de 2 h e 22 min.
5. Após a conclusão, transfira os tubos de reação de paredes finas de PCR (selados) para um saco lacrado. Prenda o fechamento e manuseie como resíduo de risco biológico.
6. Clique em Analisar no Termociclador para processar os dados.
   NOTA: Os limites de detecção deste método são os seguintes: Grupo composto: 10 bactérias/mL; Rifampicina: 20.000 bactérias/mL; Isoniazida: 10.000 bactérias/mL; Etambutol: 10.000 bactérias/mL. (Os dados de limite de detecção (LoD) são derivados da análise estatística de 765 casos clínicos fornecidos no manual de instruções do reagente.)

6. Interpretação dos resultados

1. Determinar as mutações comparando as diferenças de temperatura de fusão (Tm) entre as amostras de ensaio e os controlos positivos.
   NOTA: Tipo selvagem (sensível a medicamentos): os valores de Tm da amostra correspondem ao controle positivo em todos os quatro canais (desvio ≤1 °C). Mutante (resistente a medicamentos): O valor de Tm em qualquer canal é ≥2 °C menor que o controle positivo (ΔTm ≥2 °C).

Resultados

Este estudo utilizou PCR de fluorescência em tempo real e análise da curva de fusão para testar amostras de escarro de 17 pacientes com tuberculose. Além disso, 30 pacientes foram submetidos a testes de resistência à rifampicina e 20 foram testados quanto à resistência à isoniazida e ao etambutol. O método de PCR de fluorescência em tempo real demonstrou uma taxa de detecção positiva de 88,2% para o complexo Mycobacterium tuberculosis .

Discussão

O surgimento de cepas do complexo Mycobacterium tuberculosis resistente a medicamentos (MTBC) em escala global complicou significativamente o tratamento de pacientes com tuberculose (TB). Particularmente, a tuberculose multirresistente (MDR) e extensivamente resistente (XDR) representa desafios formidáveis para o controle da TB¹². A detecção rápida da resistência aos medicamentos é crucial para projetar regimes de tratamento adequados, prevenir falhas ter...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga
Lysis Buffer	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Kit de detecção de mutação de resistência ao etambutol Mycobacterium tuberculosis	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Kit de detecção de mutação de resistência à isoniazida Mycobacterium tuberculosis	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Detecção de mutação de resistência à rifampicina Ki	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Sistema de PCR em tempo real SLAN-96P	Shanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.	SLAN-96P
Solução de processamento de escarro	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
TopPette Pipetador

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