Este protocolo permite o isolamento de condrócitos primários suficientes em 6-8 h, facilitando investigações mais aprofundadas da biologia da cartilagem e dos mecanismos da doença da cartilagem.
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Artigo de método
Isolamento in vitro e cultura de condrócitos primários de camundongos para biologia da cartilagem
Neste artigo
Resumo
Resumo
A destruição da cartilagem articular leva à alteração da atividade dos condrócitos, que é um importante fator causador de uma variedade de doenças da cartilagem, incluindo osteoartrite (OA) e artrite reumatóide (AR). Como o tipo de célula mais abundante na cartilagem, um estudo aprofundado das propriedades biológicas dos condrócitos é essencial para o desenvolvimento de estratégias eficazes de tratamento de doenças. O isolamento e a cultura de condrócitos primários fornecem materiais experimentais importantes para a investigação da doença da cartilagem e contribuem para desvendar os mecanismos de lesão e reparo da cartilagem. Este protocolo fornece uma descrição detalhada dos métodos de isolamento e cultura in vitro para condrócitos primários derivados de camundongos. Usando o protocolo otimizado de colagenase II, o isolamento de condrócitos pode ser concluído em 8 h para amostras de cartilagem da articulação do joelho de camundongos neonatais. O rendimento celular é de aproximadamente 1-2 × 10³ células/mg de tecido cartilaginoso, variando com o frescor do tecido e a densidade celular inicial; As células isoladas exibem >90% de viabilidade. Este protocolo usa condrócitos primários de camundongos como exemplo, mostrando as características morfológicas e o estado de adesão das células cultivadas por 1, 2 e 5 dias após o isolamento. A reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR) e western blotting mostraram que o tratamento com interleucina-1β (IL-1β) reduziu a expressão do colágeno tipo II alfa 1 (Col2a1) e aumentou a expressão da metalopeptidase 13 da matriz (Mmp13), confirmando que os condrócitos isolados respondem a estímulos inflamatórios. Comparado com os métodos convencionais, este protocolo emprega uma concentração de colagenase mais alta para reduzir o impacto do tempo de isolamento prolongado na viabilidade celular, evitando possíveis danos celulares causados pelo tratamento com tripsina. Os condrócitos primários obtidos são puros e viáveis, adequados para estudos aprofundados sobre mecanismos relacionados à lesão da cartilagem, que têm implicações importantes para a pesquisa in vitro e o tratamento clínico da doença da cartilagem.
Introdução
A destruição da cartilagem articular é uma das principais causas de várias doenças da cartilagem, como OA e AR 1,2. Os condrócitos, o tipo de célula predominante na cartilagem, são essenciais para manter a homeostase e facilitar o reparo em resposta à lesão3. Alterações na atividade dos condrócitos não afetam apenas a integridade estrutural da cartilagem, mas também induzem respostas inflamatórias e degeneração tecidual progressiva4. Portanto, uma investigação aprofundada das propriedades biológicas dos condrócitos é crucial para elucidar a etiopatogênese dessas doenças.
Nos últimos anos, o papel dos condrócitos nas respostas inflamatórias tem recebido cada vez mais atenção. Estudos têm demonstrado que citocinas inflamatórias, como IL-1β e fator de necrose tumoral-α (TNF-α), comprometem significativamente os processos metabólicos dos condrócitos, resultando em aumento da expressão de enzimas degradadoras da matriz e diminuição da síntese da matriz 5,6,7. Essas mudanças acabam levando à degeneração gradual da cartilagem e à disfunção articular. Portanto, investigar as alterações biológicas dos condrócitos em condições patológicas em modelos in vitro tornou-se particularmente imperativo. Com base na cultura tradicional de monocamada bidimensional (2D), avanços recentes na cultura de condrócitos tridimensionais (3D) e tecnologias de organoides têm sido cada vez mais adotados na pesquisa relacionada à cartilagem. Esses sistemas refinados oferecem um microambiente fisiologicamente mais relevante e fornecem informações valiosas sobre o comportamento dos condrócitos em contextos de doenças8.
A seleção de uma fonte celular determina criticamente se os achados in vitro recapitulam com precisão a fisiopatologia das articulações. Ao contrário das linhas de condrócitos imortalizadas ou explantes de cartilagem, os condrócitos primários retêm o fundo genético nativo, as vias de sinalização de cálcio mecanossensíveis e a estabilidade fenotípica da cartilagem articular, exibindo assim capacidade condrogênica superior e comportamentos biológicos que refletem mais de perto os das células de cartilagem residentes9. Diferenças sistemáticas nas fontes de sinalização de cálcio e nos principais canais iônicos e vias a jusante foram documentadas entre os condrócitos primários e a linha celular ATDC510. Consequentemente, ao investigar a fisiologia ou patologia articular, os condrócitos primários devem ser priorizados. Portanto, otimizar o isolamento e a cultura de condrócitos primários é essencial para modelar com precisão a biologia relacionada à doença e explorar potenciais drogas terapêuticas 11,12,13,14,15. No entanto, os métodos existentes comprometem a viabilidade celular ou a integridade do fenótipo devido à digestão prolongada16,17.
Aqui, descrevemos um protocolo para o isolamento in vitro e cultura de condrócitos primários derivados de tecido de cartilagem de camundongo, que rapidamente produz células suficientes. Em comparação com os protocolos convencionais de digestão prolongada e de baixa concentração enzimática, este estudo otimizou as condições de digestão enzimática e as etapas de pré-tratamento do tecido. Essa otimização reduziu significativamente o tempo de digestão para 6-8 h, evitando possíveis danos celulares causados pelo tratamento comtripsina 15,17. Usando este método, aproximadamente 1-2 × 103 condrócitos podem ser obtidos de cada mg de tecido de cartilagem de camundongo. Este protocolo oferece um guia confiável para isolar e cultivar condrócitos primários in vitro, fornecendo um modelo robusto para estudos de doenças da cartilagem.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Xi'an Honghui (nº 202309009), e os procedimentos experimentais aderiram estritamente aos princípios 3R de substituição, redução e refinamento para experimentação animal.
A Figura 1A ilustra um diagrama esquemático da preparação de reagentes e equipamentos. A Tabela de Materiais inclui informações sobre os reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Ratos experimentais
NOTA: Quatro camundongos C57BL / 6J do tipo selvagem com 3 dias de idade foram usados neste estudo.
- Manter as gaiolas a uma temperatura constante de 25 °C ± 2 °C e umidade de 50%-60%, com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h. Fornecer dieta de camundongo estéril de grau livre de patógenos específicos (SPF) (esterilizada por irradiação de 60Co) e água estéril ad libitum.
- Colete cartilagem da articulação do joelho (~ 10 mg / camundongo) de quatro camundongos de 3 dias de idade post mortem para isolar os condrócitos primários.
2. Coleta e processamento de amostras de cartilagem
- Processamento de camundongos e dissecção de tecidos
- Eutanásia de camundongos neonatais dentro de 3 dias após o nascimento. Esterilize a superfície do corpo limpando com álcool medicinal a 75%.
- Isole as articulações do joelho do camundongo com instrumentos cirúrgicos estéreis. Coloque-os em 1x PBS estéril.
- Extirpar cuidadosamente os músculos, ossos, sinóvia e outros tecidos conjuntivos proliferativos ao redor da articulação do joelho com instrumentos cirúrgicos estéreis. Retenha apenas o tecido cartilaginoso da articulação do joelho.
- Enxágue as amostras de tecido 3x com PBS estéril 1x. Descarte o líquido.
NOTA: A Figura 1B ilustra um diagrama esquemático simplificado da aquisição e pré-processamento do tecido cartilaginoso.
Figura 1: Fluxo de trabalho simplificado de preparação de material e processamento de amostras de cartilagem. (A) Diagrama esquemático da configuração de reagentes e equipamentos, incluindo reagentes, consumíveis e principais instrumentos. (B) Protocolo passo a passo para processamento de tecidos de cartilagem de articulações do joelho de camundongos. Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Isolamento e cultura de condrócitos primários
- Transfira o tecido cartilaginoso isolado para uma nova placa de cultura de células de 6 poços. Usando uma lâmina cirúrgica estéril nº 11, pique o tecido em pedaços pequenos de aproximadamente 0,25 mm e3 de tamanho. Enxágüe uma vez com PBS estéril pré-resfriado. Descarte o líquido.
- Adicione 2 mL de solução de digestão pré-aquecida (37 ° C) contendo colagenase II de alta concentração (25 mg / mL, dissolvida em meio de águia modificado estéril de Dulbecco / mistura de nutrientes F-12 [DMEM / F12] meio basal) para cobrir o bloco de tecido.
- Incubar a placa de cultura de células numa incubadora humidificada de CO2 a 5% a 37 °C durante 15 min para digestão enzimática. Após a incubação, descarte o líquido.
- Repita as etapas 3.2 e 3.3.
NOTA: A digestão enzimática de alta concentração é uma etapa preliminar. Tem como objetivo pré-digerir o tecido, quebrar parcialmente sua estrutura para melhor digestão subsequente e remover aderências de matriz que possam existir devido ao corte da periferia do tecido. - Adicione 2 ml de solução de digestão pré-aquecida (37 °C) contendo colagenase II de baixa concentração (5 mg/ml, dissolvida em meio basal DMEM/F12 estéril) para cobrir o bloco de tecido.
- Incubar a placa de cultura celular em uma incubadora umidificada de CO5 2 a 37 °C por 6-8 h para digestão e observar o progresso da separação celular. Ocasionalmente, execute agitação horizontal lenta (80-120 rpm) ou pipetagem suave para aumentar a eficiência da lise.
NOTA: Para tecido de camundongo neonatal, a liberação celular é visível em torno de 3 h, com isolamento total alcançável entre 6 e 8 h. Durante o tratamento de 6-8 h com colagenase II, observe a lise a cada hora e termine a digestão quando nenhum pedaço de tecido óbvio for visível a olho nu e 90% das células estiverem livres e em suspensão ao microscópio. Durante o processo de digestão, os condrócitos semelhantes a vacúolos podem ser observados gradualmente se desprendendo da massa de tecido cartilaginoso sob um microscópio óptico. Esta etapa pode ser repetida várias vezes para minimizar os danos aos condrócitos causados pela digestão prolongada, e a solução de digestão pode ser substituída por uma solução de digestão de colagenase II de baixa concentração para aumentar o rendimento celular. - Filtre todos os produtos da digestão através de um filtro de células de 100 μm em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
NOTA: Use um filtro de células de 100 μm para evitar a perda de agregados de condrócitos e aumentar o rendimento. Fragmentos de tecido residual são removidos durante a troca do meio. - Enxágue a placa de cultura de células com PBS estéril 1x. Filtre novamente através do filtro de células.
- Coletar todo o filtrado da etapa anterior em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente com o freio desligado. Rejeitar o sobrenadante após centrifugação.
- Adicione 2 mL de PBS 1x estéril e ressuspenda suavemente o precipitado soprando levemente e aspirando com uma pipeta. Transfira para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Centrifugue a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente com o freio desligado. Rejeitar o sobrenadante após centrifugação.
- Ressuspenda o precipitado da etapa 4.10 com 2 mL de meio completo DMEM/F12 estéril recém-preparado, que contém 15% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de P/S. Enumere a suspensão de células colhidas usando um hemocitômetro e, em seguida, coloque as células em uma placa de cultura estéril de 10 cm a 2-2,5 × 105 células/cm2. Suplemento para um volume final de 10 mL com meio completo.
NOTA: A densidade de semeadura de condrócitos deve ser de 2-2,5 × 105 células/cm2, pois a semeadura de baixa ou média densidade pode levar a uma mudança fenotípica dos condrócitos articulares em direção aos fibroblastos. A atividade de proliferação e a viabilidade das células primárias isoladas podem ser avaliadas usando ensaios opcionais de MTT ou coloração de exclusão com azul de tripano (Etapa Opcional). - Incubar em uma incubadora umidificada de CO5 2 a 37 °C.
- Substitua por meio completo DMEM / F12 fresco (contendo 10% FBS, 1% P / S) depois que as células estiverem completamente aderidas à parede sob um microscópio óptico.
- Troque o meio a cada 2 dias. Continue cultivando até que a confluência atinja 70%, momento em que experimentos subsequentes podem ser realizados.
NOTA: A concentração sérica no meio de cultura pode ser aumentada para 15% com base na condição da célula. A Figura 2 ilustra um diagrama esquemático simplificado da digestão, isolamento e cultura de células primárias do tecido cartilaginoso.
Figura 2: Procedimento simplificado para digestão do tecido cartilaginoso, isolamento de células primárias e cultura. A cartilagem foi picada e digerida continuamente com solução de digestão de colagenase II de alta concentração por 15 min, repetida uma vez, depois digerida com solução de digestão de colagenase II de baixa concentração por 6-8 h para isolar as células. O tecido digerido foi então filtrado e o filtrado foi coletado e centrifugado. O pellet celular foi lavado com 1x PBS e cultivado em meio DMEM/F12 até que a confluência atingisse 70%, momento em que as células estavam prontas para experimentos subsequentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Verificação funcional dos condrócitos primários
- Metabolismo e alterações dos condrócitos em condições inflamatórias.
- Trate as células com 10 ng/mL de IL-1β por 24 h para simular condições inflamatórias.
- Para RT-qPCR e western blotting, extraia RNA total ou proteína total para detectar os indicadores metabólicos da matriz extracelular de condrócitos, como COL2A1, MMP13.
NOTA: A Figura 3 ilustra um diagrama esquemático da validação funcional dos condrócitos primários e os procedimentos experimentais subsequentes. As informações de anticorpos são fornecidas na Tabela de Materiais. Os procedimentos detalhados para western blotting e RT-qPCR são fornecidos na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5. Todos os métodos seguiram protocolos padrão11,18.
Figura 3: Diagrama esquemático do programa de validação funcional de condrócitos primários. Condições inflamatórias induzidas pelo tratamento com IL-1β; efeitos sobre os fenótipos associados à cartilagem avaliados por RT-qPCR e Western blotting. Abreviaturas: IL-1β = interleucina-1β; RT-qPCR = Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Condições do fluxo de trabalho Western Blotting | |
| Passo | Condição / Reagente |
| Preparação de gel SDS-PAGE | 8 % (m/v) de gel de separação Tris-HCl |
| Eletroforese de empilhamento | 80 V, 30–40 min |
| Resolvendo eletroforese | 120 V, 1–1,5 h |
| Transferência | Semi-seco, 15 V, 30–60 min |
| Bloqueio | Tampão de bloqueio rápido, 2 h à temperatura ambiente |
Tabela 1: Condições do fluxo de trabalho de Western blotting. Resumo das condições de western blotting, incluindo composição SDS-PAGE, parâmetros de eletroforese, configurações de transferência e procedimento de bloqueio.
| Mistura de reação de transcrição reversa | |
| Componente | Volume (μL) |
| 5× Tampão de reação de transcriptase reversa do transcritor | 4 |
| Mistura de desoxinucleotídeos (10 mM cada) | 2 |
| Inibidor de RNase Protetor (40 U/μL) | 0.5 |
| Transcritor: transcriptase reversa (20 U/μL) | 0.5 |
| Água livre de nuclease | até 20 |
| Volume total | 20 |
Tabela 2: Mistura de reação de transcrição reversa. Composição da reação de transcrição reversa para síntese de cDNA.
| Informações do primer para RT-qPCR de condrócitos primários de camundongos | ||||
| Nome do gene | Sequência (5'3 ') | Temperatura de recozimento (°C) | ||
| mGapdh | Encaminhar | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC | 60 | |
| Inverter | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | Encaminhar | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| Inverter | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| mMmp13 | Encaminhar | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| Inverter | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
Tabela 3: Informações do primer para RT-qPCR de condrócitos primários de camundongos. Sequências e temperatura de recozimento (60 ° C) de primers usados para quantificar transcritos de Gapdh, Col2a1 e Mmp13 em condrócitos primários de camundongos.
| Mistura de reação RT-qPCR | |
| Componente | Volume (μL) |
| 2 × SYBR Green qPCR Master Mix | 10 |
| Molde de cDNA diluído | 8 |
| Primer direto (10 μM) | 1 |
| Primer reverso (10 μM) | 1 |
| Volume total | 20 |
Tabela 4: Mistura de reação RT-qPCR. Mistura de reação RT-qPCR (20 μL) com master mix SYBR Green, modelo e primers.
| Protocolo de ciclagem RT-qPCR | ||
| Passo | Temperatura (°C) | Hora |
| Desnaturação inicial (×1) | 95 | 10 minutos |
| Desnaturação (×40) | 95 | 5 segundos |
| Recozimento/extensão (×40) | 60 | 15 s |
| Extensão (×40) | 72 | 30 s |
| Curva de fusão (×1) | 95 55 95 | 60 s 30 s 30 s |
Tabela 5: Protocolo de ciclagem RT-qPCR. Desnaturação a 95 °C por 5 s, recozimento/extensão a 60 °C por 15 s e uma análise final da curva de fusão foram realizadas por 40 ciclos.
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Resultados
Conforme descrito na Figura 1, Figura 2 e Figura 3, realizamos o protocolo e isolamos com sucesso os condrócitos primários das articulações do joelho de camundongos. De aproximadamente 10 mg de cartilagem de camundongo neonatal, obtivemos cerca de 1 × 104 células com viabilidade >90%. No primeiro dia de cultivo in vitro , os condrócitos primários de camundongos exibiram uma morfologia arredond...
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Discussão
O isolamento e a cultura de condrócitos primários são essenciais para elucidar a fisiopatologia das doenças da cartilagem22. Na cultura primária de condrócitos, otimizar a concentração de colagenase e o tempo de digestão é crucial, pois equilibra a degradação da matriz extracelular e reduz o dano celular potencial17. Aqui, descrevemos um método confiável e reprodutível para isolar condrócitos primários de tecidos de cartilagem de camundongos. Usando este método, aproximadam...
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Divulgações
Os autores declaram não ter conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82370909). A Figura 1, a Figura 2 e a Figura 3 foram criadas com o Figdraw.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 e vezes; PBS em pó (2 L) | Biografia do serviço | G0002-2L | |
| Placas de cultura de células de 100 mm | Biografia do serviço | CCD-100 | |
| 100 μ peneira de célula m | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| Tubo de centrífuga cônico de 15 mL (estéril, sem enzimas) | Biografia do serviço | EP-1501-J | |
| Tubo de centrífuga cônico de 50mL (estéril, sem enzimas) | Biografia do serviço | EP-5001-J | |
| Placa de cultura de células de 6 poços | Biografia do serviço | CCP-6H | |
| Anticorpo policlonal anti-COL2A1 de coelho | Imunovia | YT1022 | Anticorpos Primários; WB: 1/500 |
| Anticorpo monoclonal de camundongo anti-GAPDH | Tecnologia de proteína | 60004-1-IG | Anticorpos Primários; WB: 1/2000 |
| Anticorpo policlonal anti-MMP13 para coelhos | Imunovia | YT2796 | Anticorpos Primários; WB: 1/1000 |
| Bancada asséptica ultra-limpa | Thermo Fisher | 51029704 | |
| Incubadora para cultura celular | Thermo Fisher | 51033782 | |
| Colagenase II | Solarbio | C8150 | |
| Primers personalizados (Gapdh, Col2a1, Mmp13) | Sangon Biotech | Projetado usando Primer BLAST | |
| Meio DMEM/F12 | Hyclone | SH30023.01 | |
| Soro fetal bovino | ExCell | FCS500 | |
| Anticorpo policlonal HRP-Goat Anti-Mouse | Imunovia | RS0001 | Anticorpos Secundários; WB: 1/10000 |
| HRP-Goat Anti-Rabbit anticorpo policlonal | Imunovia | RS0002 | Anticorpos Secundários; WB: 1/10000 |
| Microscópio de contraste de fase invertida | OLIMPO | CKX53 | |
| Micropipeta | Thermo Fisher | ||
| Centrífuga de bancada em miniatura | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| Lâmina cirúrgica nº 11 | Biografia do serviço | QXJZ-11 | |
| Solução de penicilina-estreptomicina (100X) | Beyotime | C0222 | |
| Conjunto de instrumentos de dissecação de pequenos animais | Biografia do serviço | QXTZ01 |
Referências
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