Método MALDI-ToF MS para a Caracterização de Polímeros Sintéticos com Dispersão Variável e Grupos Finais

Resumo

Este protocolo fornece instruções detalhadas e exemplos para preparação de amostras, aquisição de dados e análise de dados para caracterizar polímeros sintéticos com dispersão variável e grupos finais usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz.

Resumo

A espectrometria de massa por tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-ToF MS) é uma ferramenta analítica eficaz para caracterizar polímeros sintéticos, oferecendo determinação precisa do peso molecular e insights estruturais, como massas unitárias repetidas e identificação de grupos finais. Este protocolo detalha as etapas para análise de polímeros, incluindo a preparação da amostra com seleção apropriada de matriz e cátions, aquisição de dados e um método de calibração para garantir medições de massa precisas. Ele destaca a versatilidade do MALDI-ToF MS na análise de polímeros, de materiais monodispersos a altamente dispersos, ao mesmo tempo em que observa limitações na resolução de amostras altamente dispersas. Ao comparar massas teóricas e observadas, incluindo padrões isotópicos, o método permite a confirmação confiável de unidades de repetição e grupos finais. O protocolo oferece suporte a novos usuários, apresentando dados representativos sobre seleção de matriz, interpretação espectral em faixas de dispersão e caracterização de polímeros com características isotópicas únicas ou formações de íons metaestáveis. As estratégias de solução de problemas incluem a abordagem de problemas como interferência de matriz e amostras que ionizam sem um cátion adicionado durante a preparação da amostra. No geral, este guia serve como base para o uso do MALDI-ToF MS como uma técnica rápida e confiável para análise de polímeros.

Introdução

A espectrometria de massa por tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-ToF MS) é uma técnica analítica altamente eficaz para caracterizar polímeros sintéticos 1,2,3,4. Muitos polímeros podem ser caracterizados por ressonância magnética nuclear (RMN) para confirmar a estrutura da unidade de repetição. No entanto, a maioria dos grupos finais é uma fração dos picos da unidade de repetição, mesmo para polímeros de baixo peso molecular, e à medida que o peso molecular de um polímero aumenta, os sinais do grupo final parecem difíceis de quantificar na RMN⁵. No entanto, os dados do MALDI-ToF MS confirmam que esses são os grupos finais, mesmo com pesos moleculares mais altos. Esta técnica de espectrometria de massa é conhecida por sua capacidade de ionização suave e gera principalmente íons de polímero carregados individualmente com fragmentação mínima². Isso permite a determinação precisa do peso molecular e a análise estrutural detalhada que fornece resultados rápidos e precisos, fornecendo informações valiosas, como massas unitárias repetidas, identificações de grupos finais e, para polímeros de baixa dispersão, a determinação do peso molecular médio numérico (M_n), peso molecular médio ponderal (M_w) e dispersão (Đ)⁶.

O MALDI-ToF MS pode analisar polímeros com dispersão variável, mas tem limitações em maior dispersão. Para polímeros monodispersos, como dendrímeros, este método é ideal para confirmar sua massa e identificar grupos finais⁷. Para polímeros com baixa dispersão (1,01-1,09) e alguns polímeros de dispersão moderada (Đ = 1,1-1,3), o MALDI-ToF MS também pode ser usado para determinar a massa da unidade de repetição do polímero, massa do grupo final, Đ, M_n e M_w⁸. No entanto, para polímeros altamente dispersos (Đ = 1,3-10), isso se torna um desafio. Para polímeros amplamente dispersos, as frações mais baixas exibem uma intensidade muito maior do que suas contrapartes de maior peso molecular, levando a uma dispersão artificialmente menor do que outras técnicas de caracterização, como cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Isso é descrito como um "baixo viés de massa". A massa unitária média de repetição e os grupos finais podem ser confirmados a partir dos resultados de menor peso molecular, mas é impossível determinar o verdadeiro_{M n}, M_w e Đ para polímeros de alta dispersão de MALDI-ToF MS⁹. Portanto, SEC deve ser adicionado como uma técnica de caracterização para polímeros amplamente dispersos para determinar o verdadeiro M_n, M_w e Đ.

A otimização da preparação da amostra é essencial para uma resolução de pico de alta qualidade em um espectro de massa MALDI-ToF ^2,10. A primeira etapa envolve a seleção de uma matriz apropriada com base na polaridade do polímero. Para polímeros apolares, matrizes como trans-2-[3-terc-butilfenil)-2-metil-2-propenilideno] (DCTB), radical livre galvinoxila (TFG) e 9-nitroantraceno (9-NA) são comumente usadas¹¹. Os polímeros polares são mais adequados para matrizes como ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA), ditranol, ácido 2-(4-hidroxifenilazo)benzóico (HABA) e ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB)12,13,14. Para este protocolo, o DCTB foi selecionado como matriz primária devido à sua eficácia com polímeros apolares, e o CHCA foi usado para polímeros polares. A seleção de cátions também desempenha um papel importante, pois metais alcalinos como sódio e potássio ionizam polímeros contendo oxigênio de forma eficaz, enquanto metais de transição como prata são mais adequados para hidrocarbonetos insaturados^10,14.

Uma vez que a matriz e o analito são selecionados, as proporções ideais de cátion:analito:matriz para as misturas de solução de amostra são determinadas. Esta mistura de solução de amostra será adicionada à placa alvo em uma quantidade de 1 μL. Não ter uma ou mais das proporções corretas das seleções de cátion:analito:matriz pode afetar a sensibilidade da aquisição de dados MALDI-ToF MS. Para os dados representativos abaixo, a preparação da amostra foi otimizada para a melhor resolução ^2,15.

Depois de preparar a solução da amostra e adicioná-la à placa-alvo MALDI-ToF MS, esta amostra é inserida no instrumento MALDI-ToF MS para iniciar a aquisição dos dados. Para este estudo, os dados foram coletados exclusivamente no modo de íons positivos, e um espectrômetro de massa MALDI-ToF mais recente foi utilizado, com base no trabalho anterior de Payne et ^al.16. Parâmetros importantes do MALDI-ToF MS, como potência do laser, diâmetro do feixe de laser, ganho do detector e tempo de atraso de extração pulsada, podem ser ajustados para melhorar a resolução durante a aquisição. Dois modos estão disponíveis para aquisição de dados MALDI-ToF MS: linear e refletron¹⁷. O modo Reflectron é preferido para obter uma resolução de sinal mais alta em comparação com o modo linear^18,19. No modo linear, os íons acelerados viajam diretamente através do tubo de vôo para o detector. Em contraste, o modo refletron envolve passar pelo tubo de vôo uma vez e, em seguida, refletir os íons de volta através do tubo de vôo uma segunda vez antes de chegar ao segundo detector, o que aproximadamente dobra sua trajetória de vôo. Essa abordagem permite a diferenciação de íons com massas semelhantes, mas velocidades variadas^20,21. A potência do laser também pode ser um fator no aumento da relação sinal-ruído ou na diminuição da fragmentação de um polímero²². A menor potência de laser possível para ablação de uma amostra melhorará a relação sinal-ruído e também reduzirá a possibilidade de fragmentação²². Depois de otimizar a resolução do sinal e maximizar a relação sinal-ruído, a aquisição pode fornecer dados de alta qualidade para o analito de polímero selecionado.

A calibração é essencial para uma medição precisa da massa em MALDI-ToF MS. Dois métodos principais são usados: calibração interna e externa, ambos contando com calibrantes com massas conhecidas que cobrem a faixa esperada do analito⁶. Para os polímeros analisados nos dados representativos, calibradores de dendrímeros monodispersos foram selecionados para calibração em amplas faixas de massa²³. A calibração interna, em que o calibrante é misturado com o cátion, o analito e a matriz, melhora a precisão da massa porque tanto o calibrante quanto o analito experimentam as mesmas condições, e qualquer mudança de massa de calibração os afeta igualmente. No entanto, esse método pode levar à sobreposição de pico com os sinais de polímero resultantes, complicando a análise²⁴. Em contraste, a calibração externa, empregada neste protocolo, evita a sobreposição de picos preparando e identificando a matriz cátion:calibrante:separadamente do cátion:analito:matriz na placa-alvo. No entanto, pequenas imprecisões de massa podem surgir devido a pequenas diferenças na colocação da amostra e na resposta local do instrumento, como variações na intensidade do laser ou na eficiência de ionização no alvo, de modo que o calibrante e o analito devem estar próximos um do outro²⁴. Nos dados representativos, a diferença de massa observada usando o método de calibração externa foi inferior a 0,100 Da do valor teórico.

Finalmente, para todos os polímeros, os dados MALDI-ToF MS podem ser analisados para determinar a massa da unidade de repetição e realizar a análise do grupo final dos polímeros. A massa da unidade de repetição pode ser confirmada comparando a massa teórica da unidade de repetição usando ferramentas de software com a massa da unidade de repetição observada nos espectros de massa MALDI-ToF. Se eles corresponderem, é provável que o polímero tenha a estrutura unitária de repetição esperada (ou um isômero). A análise de grupo final MALDI-ToF MS para polímeros começa calculando a massa teórica do analito. Isso inclui a massa combinada da unidade de repetição, grupos finais e o cátion selecionado da preparação da amostra. No caso de macromoléculas monodispersas, o cálculo inclui a massa total de um analito juntamente com a massa do catião selecionado. Ferramentas de software para desenhar estruturas químicas podem auxiliar nesses cálculos. A massa teórica do software é então comparada com a massa observada dos espectros de massa MALDI-ToF para verificar se o polímero corresponde à estrutura molecular esperada. No entanto, se a massa unitária de repetição observada corresponder aproximadamente ao valor teórico, mas a massa total de um n-mer especificado, incluindo grupos terminais e o cátion, não, a discrepância pode sugerir a presença de grupos terminais inesperados. Para identificar grupos terminais desconhecidos, as condições de reação são revisadas para determinar moléculas ou reagentes alternativos que poderiam ter reagido para formar os grupos finais observados. Esta etapa é crucial para caracterizar com precisão toda a estrutura do polímero.

Este protocolo fornece um método passo a passo para análise MALDI-ToF MS de polímeros sintéticos, projetado para auxiliar os usuários, principalmente iniciantes, na preparação de amostras, otimização de métodos de instrumentos, aquisição de dados e análise de dados. Dados representativos ilustram a seleção da matriz para um determinado polímero; espectros e análise de polímeros com dispersão variável, incluindo amostras monodispersas, moderadamente dispersas e altamente dispersas; a análise do grupo final de polímeros, que inclui aqueles com padrões de resolução isotópica distintos (por exemplo, halogenados) e aqueles propensos à formação de íons metaestáveis (por exemplo, terminados em azida); a análise de dados de polímeros usando MALDI-ToF MS, que inclui uma comparação de massas observadas e teóricas para confirmar a massa unitária repetida e a massa total do polímero, incluindo grupos terminais e adutos catiônicos; e um exemplo de solução de problemas para interferência de matriz de polímeros de baixa massa e polímeros auto-ionizantes.

Este protocolo não apenas fornece uma base para a caracterização do polímero MALDI-ToF MS, mas também oferece orientação sobre a preparação de amostras, otimização passo a passo do método do instrumento (Figura 1) e a interpretação de espectros para polímeros sintéticos recém-sintetizados e comerciais.

Protocolo

CUIDADO: Review as Fichas de Dados de Segurança (SDS) para todos os produtos químicos antes de usar. Execute todas as preparações de amostras e preparações de placas MALDI-ToF MS em uma capela e use equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados, incluindo óculos de segurança, jaleco e luvas.

1. Preparação da amostra

1. Preparação de solução estoque de matriz, cátion, calibrante e analito
   1. Preparar a solução de reserva catiónica alcalina dissolvendo 2 mg do catião desejado em 1 ml de um solvente seleccionado pela sua compatibilidade com a substância a analisar e com o catião. Para a amostra 1, 2 mg de trifluoroacetato de sódio foram dissolvidos em 1 mL de THF.
   2. Preparar a solução-mãe da matriz dissolvendo 20 mg da matriz desejada em 1 ml de um solvente compatível, com base na solubilidade da substância a analisar. Exemplo: Para os dados representativos (Amostra 1), dissolva 20 mg de DCTB em 1 mL de tetrahidrofurano (THF).
   3. Prepare a solução de estoque calibrante seguindo as instruções do fornecedor.
   4. Preparar a solução da substância a analisar dissolvendo 10 mg da substância a analisar em 1 ml de um solvente adequado. Para a amostra 1, 10 mg do analito são dissolvidos em 1 mL de THF.
2. Preparação da placa-alvo MALDI-ToF MS
   1. Limpe a placa alvo MALDI-ToF MS.
   2. Preparar a amostra de aquisição da substância a analisar e a solução da amostra de calibração. Adicione as soluções de cátion, analito e matriz em uma proporção de 1:5:20 μL no tubo A e no vórtice. Para calibração externa: Adicione as soluções de estoque de cátions, calibrantes e matrizes em uma proporção de 1:5:20 μL no tubo B e no vórtice.
   3. Adicione a mistura de solução de amostra de analito e calibrante à placa alvo MALDI-ToF MS. Pipetar 0,5 μL da mistura de solução de amostra catião:analito:matriz (tubo A) para a placa-alvo MALDI-ToF MS utilizando o método das gotículas secas. Pipetar 0,5 μL da mistura catião:calibrante:matriz (tubo B) para um ponto adjacente à substância a analisar na placa-alvo MALDI-ToF MS utilizando o método das gotículas secas. Registre a localização exata de cada ponto (letra da linha e número da coluna) para localizar facilmente a amostra e o calibrante durante a aquisição de dados.

2. Aquisição de dados

1. Insira a placa alvo MALDI-ToF MS e selecione um método de aquisição
   1. Insira a placa alvo MALDI-ToF MS no instrumento. Coloque a placa alvo no suporte com a orientação correta e não empurre a placa alvo MALDI-ToF MS muito para dentro.
   2. Encaixe a placa alvo MALDI-ToF MS no instrumento usando o software de controle do instrumento.
   3. Selecione e abra um arquivo de método no software de controle do instrumento. Escolha um método de refletor positivo (RP) ou um método linear positivo (LP) dentro da faixa de massa do analito.
   4. Monitore o software de controle do instrumento para confirmar se a placa alvo foi inserida e se a configuração do método está concluída.
      NOTA: Esses polímeros representativos possuem oxigênios; portanto, o modo positivo é selecionado (a maioria dos compostos tem aquisição concluída no modo positivo). Para os dados representativos, um método RP foi selecionado para o modo refletor em todas as amostras.
2. Aquisição inicial de dados
   1. No software de controle do instrumento, localize a câmera exibindo a placa alvo MALDI-ToF MS e um diagrama dos poços com as letras das colunas e os números das linhas exibidos. Clique no poço MALDI-ToF MS que contém a mistura de cátions:analitos:matrizes para selecionar a aquisição de dados.
   2. Ajuste a faixa de detecção de massa no software de controle do instrumento para uma ampla faixa de 500-20000 Da para garantir que a massa esperada do analito seja totalmente capturada. Utilize o cursor para ajustar o intervalo aproximadamente 2x abaixo e acima da massa esperada da substância a analisar após uma aquisição inicial.
   3. Aquisição de dados
      1. Pressione o botão Iniciar no software de controle do instrumento para iniciar a aquisição de dados MALDI-ToF MS.
      2. Pressione Parar ou permita que a aquisição do MALDI-ToF MS seja concluída automaticamente.
      3. Clique em Adicionar para adicionar o espectro único MALDI-ToF MS ao buffer de espectro de soma.
         NOTA: O buffer de espectro único MALDI-ToF MS armazena um espectro de massa MALDI-ToF individual e o buffer de espectro de soma acumula dados de várias aquisições, aumentando a intensidade do sinal.
      4. Reposicione o laser MALDI-ToF MS viewo feed da câmera e clique em Qualquer lugar dentro do mesmo poço selecionado para mover o laser para uma nova posição.
      5. Repita as aquisições do MALDI-ToF MS para adicionar espectros únicos do MALDI-ToF MS ao buffer de soma. Repita as etapas 2.2.3.1 a 2.2.3.4 até que os resultados do MALDI-ToF MS sejam satisfatórios.
      6. Avalie o espectro de massa MALDI-ToF quanto à resolução e ruído de linha de base. Se o espectro MALDI-ToF MS exibir alta resolução e ruído mínimo na linha de base, prossiga para a etapa de calibração. Caso contrário, considere otimizar o método de aquisição de dados (por exemplo, ajustar a potência do laser, o ganho do detector ou as configurações de extração de íons pulsados).
3. Otimização da aquisição de dados (consulte Figura 1)
   1. Ajuste a potência do laser MALDI-ToF MS, o ganho do detector e a extração de íons pulsados, um de cada vez, para melhorar a resolução e/ou diminuir o ruído de fundo
   2. Para duplicar o método MALDI-ToF MS, copie e cole o método MALDI-ToF MS LP ou RP com um novo nome. Abra o arquivo de método MALDI-ToF MS colado que foi criado e renomeie o arquivo.
   3. Adquira um espectro de massa MALDI-ToF inicial seguindo todas as etapas da seção 2.2 para a aquisição inicial de dados, na seção de aquisição de dados. Amplie um conjunto de picos do MALDI-ToF MS com a maior intensidade para avaliar a resolução e o ruído da linha de base no software de controle do instrumento.
   4. Otimização de aquisição
      1. Ajuste a potência do laser MALDI-ToF MS
         1. Comece com uma potência de laser MALDI-ToF MS baixa de ~ 4% e siga as etapas 2.2.3.1 e 2.2.3.2 para a aquisição inicial de dados para iniciar e parar a aquisição de dados.
         2. Observe e compare a resolução e o ruído de linha de base do buffer único MALDI-ToF MS e o espectro inicial no buffer de soma.
         3. Aumente a potência do laser MALDI-ToF MS em incrementos de 2% a 10% para aumentar a ionização. Siga as etapas 2.2.3.1 e 2.2.3.2 para a aquisição inicial de dados para iniciar e parar a aquisição de dados após cada incremento.
         4. Selecione a potência de laser mais baixa que fornecerá picos de alta intensidade com ruído mínimo.
            NOTA: Quando a potência do laser MALDI-ToF MS é de 50% ou mais, há uma possibilidade aumentada de fragmentação da amostra.
      2. Otimize o diâmetro do laser MALDI-ToF MS
         1. Na guia do detector, ajuste o diâmetro do laser MALDI-ToF MS para testar configurações médias, grandes e ultra. Siga as etapas 2.2.3.1 e 2.2.3.2 para a aquisição inicial de dados para iniciar e parar a aquisição de dados.
         2. Observe e compare a resolução e o ruído de linha de base do buffer único MALDI-ToF MS e o espectro inicial no buffer de soma.
         3. Selecione o diâmetro do laser MALDI-ToF MS que fornece resolução ideal com ruído mínimo de linha de base.
            NOTA: O diâmetro do laser MALDI-ToF MS controla o diâmetro do feixe de laser.
      3. Ajuste o ganho do detector MALDI-ToF MS
         1. Por pequenos incrementos, aumente ou diminua o ganho do detector MALDI-ToF MS. Siga as etapas 2.2.3.1 e 2.2.3.2 para a aquisição inicial de dados para iniciar e parar a aquisição de dados para cada aumento ou diminuição no ganho do detector MALDI-ToF MS.
         2. Observe a intensidade e a resolução do sinal dos espectros de massa MALDI-ToF no software de controle do instrumento a cada ajuste do buffer único MALDI-ToF MS e do espectro inicial no buffer de soma.
         3. Mantenha o ganho do detector MALDI-ToF MS que fornece a melhor intensidade e boa resolução de sinal.
      4. Modifique a extração de íons pulsados MALDI-ToF MS
         1. Ajuste a extração de íons pulsados MALDI-ToF MS em incrementos de 10 ns. Siga as etapas 2.2.3.1 e 2.2.3.2 para a aquisição inicial de dados para iniciar e parar a aquisição de dados, para cada aumento ou diminuição no ganho do detector.
         2. Avalie como as mudanças na extração de íons pulsados melhoram a resolução do sinal MALDI-ToF MS.
            NOTA: A extração de íons pulsados MALDI-ToF MS é definida como um atraso de tempo entre a ionização do laser. Ao aumentar ou diminuir a extração de íons de pulso, íons de diferentes energias permanecerão no campo elétrico por tempos mais curtos ou mais longos. O tempo mais longo pode permitir que analitos da mesma massa e íons carregados positivamente que ablam em momentos ligeiramente diferentes acelerem totalmente até a mesma velocidade que os íons analitos da mesma massa quando a tensão é aplicada. Isso pode ser usado para aumentar a resolução e diminuir o ruído de fundo do sinal²⁵.
   5. Assim que a resolução ideal e a maior relação sinal-ruído forem alcançadas, salve o arquivo do método MALDI-ToF MS otimizado para uso atual e futuro.
4. Calibração MALDI-ToF MS
   1. Adquira o espectro de massa de calibração MALDI-ToF selecionando a amostra de calibração na placa alvo e seguindo todas as etapas da seção 2.2 para a aquisição inicial de dados
      1. Acesse os pontos de referência de calibração. Navegue até a guia de calibração no software de controle do instrumento. Abra a lista de controle de massa apropriada correspondente ao calibrante usado.
   2. Combine os picos de calibração do espectro de massa MALDI-ToF com as massas de referência na lista de controle de massa.
      1. Na lista de controle de massa, selecione a massa correspondente ao primeiro pico de calibração no espectro de massa MALDI-ToF. O espectro de massa MALDI-ToF aumentará automaticamente o zoom no pico do calibrante selecionado.
      2. Defina o pico de referência clicando à esquerda do sinal do calibrante. O pico será selecionado.
      3. Selecione Aplicar para definir o sinal do calibrante como a massa de referência na lista de controle de massa.
      4. Repita esse processo para todos os picos de calibração adicionais. Selecione a próxima massa de interesse na lista de controle de massa, alinhe o pico de calibrante correspondente e aplique a configuração de referência.
5. Aquisição de amostra de analito de polímero calibrado
   1. Localize e selecione o poço que contém o cátion:analito:matriz
   2. Execute a aquisição de dados seguindo todas as etapas da seção 2.2 com o método otimizado e calibrado aberto.
   3. Adicione um nome de arquivo apropriado e salve o espectro de massa MALDI-ToF do analito calibrado para análise posterior.
6. Remova a placa alvo MALDI-ToF MS com o software de controle do instrumento. Limpe a placa alvo MALDI-ToF MS

Figura 1: Árvore de decisão para a otimização do método do instrumento. Este guia foi desenvolvido para ajudar os usuários iniciantes a otimizar sistematicamente os parâmetros do método do instrumento. Comece com as configurações padrão ou iniciais e ajuste um parâmetro de cada vez, aumentando ou diminuindo com base nas melhorias observadas. Em seguida, continue na direção que aumenta (1) a intensidade do pico, (2) a qualidade da linha de base (baixo ruído) e (3) fornece resolução de pico e isotópica estreita. Essa abordagem ajuda a identificar as condições ideais para espectros confiáveis e de alta qualidade. Se a amostra de polímero não ionizar ou produzir um espectro utilizável no modo refletor, mude para o modo linear e use essa mesma árvore de decisão para otimizar os parâmetros. Observe que o modo linear geralmente resulta em picos mais amplos e resolução isotópica limitada ou inexistente, mas pode ser eficaz para polímeros de massa mais alta ou polímeros que podem perder ionização no modo refletor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Análise e interpretação dos dados

1. Abra o software de análise de dados MALDI-ToF MS e carregue o espectro de amostra do analito MALDI-ToF MS.
2. Selecione o método de processamento MALDI-ToF MS correto para as amostras de analito. Aqui, todas as amostras tiveram resolução isotópica, e o primeiro pico foi selecionado para todos os picos com o método de processamento MALDI-ToF MS selecionado.
   NOTA: Os parâmetros de processamento MALDI-ToF MS podem ser adaptados para amostras de polímeros sintéticos. Por exemplo, um método de processamento MALDI-ToF MS para polímeros foi desenvolvido durante uma sessão de treinamento técnico pelo técnico de instrumentos MALDI-ToF MS. Um método de processamento em massa médio MALDI-ToF MS foi criado por Payne et al. para aplicações específicas¹⁶. Entre em contato com a equipe técnica de polímeros do fabricante MALDI-ToF MS para obter informações e conselhos sobre como editar o método de processamento MALDI-ToF MS.
3. Encontre picos usando o software de análise MALDI-ToF MS.
4. Comparar a massa teórica e experimental do polímero
   1. Registar a massa teórica do polímero. Desenhe a estrutura esperada da macromolécula, incluindo o cátion, em um software de desenho químico. Abra a janela de análise no software de desenho químico e registre a massa teórica.
      1. Macromoléculas monodispersas: Registre a massa exata e o peso molecular da macromolécula selecionando a estrutura e o cátion juntos.
      2. Polímeros de baixa, moderada e altamente dispersa: Para massa unitária repetida, selecione o backbone do polímero apenas para registrar a massa unitária repetida. Para a massa total de um n-mer especificado, defina o número da unidade de repetição para uma massa dentro da faixa de espectro MALDI-ToF MS exibida no software de análise MALDI-ToF MS. Selecione toda a estrutura do polímero, incluindo o cátion e os grupos finais, para registrar a massa de um n-mer especificado.
   2. Comparar a massa teórica registada com a massa observada do espectro MALDI-ToF MS
      1. Para o cálculo da massa total de macromoléculas monodispersas, siga as etapas descritas abaixo.
         1. Aumente o zoom no pico com a maior intensidade no espectro MALDI-ToF MS, garantindo que a visão inclua uma faixa de massa de pelo menos 2x abaixo e acima da massa teórica.
         2. Comparar a massa teórica com a massa observada no espectro de massas MALDI-ToF. Se a diferença for inferior a 0,100 Da, a massa esperada da macromolécula monodispersa é provavelmente precisa.
         3. Examine o espectro MALDI-ToF MS em busca de picos adicionais que possam indicar a presença de estruturas inesperadas.
         4. Se forem detectadas discrepâncias, avalie possíveis variações estruturais. Revise o esquema de reação e calcule as massas de estruturas alternativas para comparação.
      2. Para repetir o cálculo da massa unitária de polímeros de baixa, moderada e alta dispersão, siga as etapas descritas abaixo.
         1. Selecione e amplie dois picos separados pela massa da unidade de repetição no espectro MALDI-ToF MS que exibem a maior intensidade.
         2. Para cada par de picos adjacentes, subtraia a massa observada do pico de massa mais alto do pico de massa mais baixo para calcular a massa unitária de repetição. Repita esse processo para o próximo conjunto de picos para confirmar a consistência da massa da unidade de repetição.
         3. Compare a massa da unidade de repetição calculada com a massa teórica da unidade de repetição. Se os valores observados e teóricos corresponderem e exibirem diferenças de massa consistentes, a massa unitária de repetição do polímero provavelmente está correta.
      3. Para a massa total de um n-mer especificado de polímeros de baixa, moderada e altamente dispersa, siga as etapas descritas abaixo.
         1. Amplie o pico no espectro de massa MALDI-ToF correspondente à massa total teórica, bem como picos uma unidade de repetição acima e abaixo.
         2. Comparar a massa teórica com a massa observada no espectro de massas MALDI-ToF. Se a diferença for menor que 0,100 Da, os grupos finais esperados provavelmente serão precisos.
         3. Inspecione o espectro de massa MALDI-ToF em busca de picos adicionais que possam sugerir estruturas inesperadas.
         4. Se forem identificadas discrepâncias, avalie grupos finais alternativos ou variações estruturais. Revise o esquema de reação e calcule as massas para potenciais grupos finais alternativos ou estruturas cíclicas.

Resultados

Amostra 1: Tris[G1](OH)₆ monodisperso
A geração 1 de um dendrímero monodisperso consistindo de um núcleo de 1,1,1-tris (hidroximetil) propano com três ácidos bis (hidroximetil) propiônicos protegidos por benzilideno na periferia (Tris [G1] Bnz₃) reagiu com gás Pd / C e H₂ em 1: 1 metanol: clorofórmio para remover os grupos benzilideno e resultou em um dendrímero com 6 grupos hidroxila para formar Tris [G1] (OH) ₆ ( Figura 2A ).

Tris[G1](OH)₆ foi analisado usando NaTFA como agente catiônico com CHCA como matriz. O CHCA foi usado porque é altamente eficaz com compostos polares e interage com grupos hidroxila de Tris [G1] (OH) ₆ para fornecer uma camada homogênea na placa alvo. A preparação da amostra MALDI-ToF MS foi iniciada com a confecção de soluções estoque de NaTFA (1 mg/mL em THF), analito (5 mg/mL em THF) e CHCA (5 mg/mL em THF). Uma vez feitas essas soluções, 1 μL da solução catiônica de Na⁺ , 5 μL da solução analita e 20 μL da solução da matriz foram combinados em um tubo de microcentrífuga e vórtices (proporção de 1:25:100 cátion:analito:matriz para um total de 26 mL). Em seguida, 1 μL dessa mistura foi removido do tubo de microcentrífuga e seco na placa-alvo MALDI-ToF MS. Essa amostra foi analisada em modo refletor, e o pico foi confirmado no espectro MALDI-ToF MS comparando os valores teóricos e observados (Figura 2B, vermelho).

Figura 2: (A) Esquema de reação para modificação da amostra 1 para Tris [G1] (OH) ₆. Os grupos benzilideno foram removidos com uma reação Pd/C e H₂ para formar Tris[G1](OH)₆. MALDI-ToF MS foi usado para determinar a conclusão da reação. (B) Espectros de massa MALDI-ToF da amostra 1, Tris [G1] (OH) ₆ e um espectro de matriz em branco sobreposto, que incluía a matriz e o sal ([CHCA + Na] ⁺). O espectro completo de MALDI-ToF MS e o zoom de Tris [G1] (OH) ₆ mostram um valor de massa observado para [Tris [G1] (OH) ₆ + Na ⁺] ⁺ + é 505,239 Da e tem uma diferença de +0,013 Da da massa teórica de 505,226 Da. Comparando o espectro da matriz MALDI-ToF MS em branco (preto) com o espectro Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF MS (vermelho), todos os picos diferentes de 505,26 Da podem ser desconsiderados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O aduto Na⁺ para Tris[G1](OH)₆ foi observado. O valor de massa teórico de [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ é composto pela massa do pico monoisotópico de Tris[G1](OH)₆ (482,2362 Da) mais a massa do cátion sódio (22,9892 Da) que produz uma massa total de 505,226 Da. O valor de massa observado para [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ é 505,239 Da, que correspondeu ao valor teórico com uma diferença de +0,013 Da.

Para garantir a remoção completa de todos os três grupos benzilideno, o espectro MALDI-ToF MS foi analisado entre 505-769 Da. Essa faixa de massa permite a detecção de quaisquer grupos periféricos que não foram detectados. Haveria a presença de um pico, [Tris [G1] Bnz₂ (OH) ₂ + Na] ⁺, que indicaria que um benzilideno removido em 681,289 Da ([Tris [G1] Bnz₃ + Na] ⁺ 769,3194 Da - 88,0313 Da) e em 593,257 Da pico ([Tris [G1] Bnz₃ + Na] ⁺ 769,3194 Da -176,0626 Da) para [Tris [G1] Bnz₁ (OH) ₄ + Na] ⁺ que indicaria que dois grupos benzilideno foram removidos de Tris [G1] Bnz₃ (Figura 3). Esses picos e Tris [G1] Bnz₃ não estão presentes; portanto, a reação foi concluída e Tris [G1] (OH) ₆ foi sintetizado.

Figura 3: Estruturas e massas teóricas de Tris [G1] Bnz₃, os intermediários de Tris [G1] Bnz₂ (OH) ₂, Tris [G1] Bnz₁ (OH) ₄ e amostra 1 Tris [G1] (OH) _6. O ponto preto indica o produto. Estruturas e massas teóricas de um e dois grupos benzilideno removidos e o Tris [G1] (_{OH) totalmente} hidroxilado Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na região de baixo peso molecular abaixo de 900, vários picos que não se alinham com a massa monodispersa de Tris [G1] (OH) ₆ estão presentes. A maioria das matrizes tem pequenos problemas de ruído abaixo de 1000, portanto, um espectro MALDI-ToF MS em branco é incluído para confirmar que Tris [G1] (OH) ₆ é puro. A amostra em branco da matriz incluiu as soluções estoque de matriz (CHCA) e cátion (Na⁺). Os mesmos valores de cátion: razão de concentração de matriz do Tris[G1]OH₆ (1:100 mg/mL) foram usados para a mistura de amostras de análise. Em seguida, 1 μL da mistura foi adicionado à placa de amostra e seco para análise.

A aquisição de dados preliminares, a aquisição de calibração e a aquisição de dados foram concluídas para adquirir um espectro de matriz MALDI-ToF MS em branco. Na Figura 2B (preto), a matriz em branco MALDI-ToF MS (preto) e o espectro Tris[G1](OH)₆ da amostra (vermelho) foram sobrepostos na análise flexível para comparar e confirmar quais picos não estão associados ao produto. Quaisquer picos identificados no espectro da matriz MALDI-ToF MS em branco e no Tris [G1] (OH) ₆ podem ser ignorados e, portanto, o único pico é 505,226 Da, que corresponde à amostra 2. Por exemplo, os picos de 445,016 Da e 656,141 Da no espectro Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF MS (Figura 2B vermelha) também estão localizados no espectro da matriz MALDI-ToF MS em branco (Figura 2B preto) em 445,017 Da e 656,144 Da e têm uma diferença de +0,001 Da e +0,003 Da, respectivamente. Esses picos não serão incluídos na análise, pois correspondem e têm diferenças semelhantes da matriz em branco e do espectro Tris [G1] (OH) ₆ MALDI-ToF MS. Portanto, a massa de Tris [G1] (OH) ₆ é confirmada por meio de MALDI-ToF MS, mas outras análises, como SEC e NMR, serão necessárias para confirmar a pureza da amostra.

Amostra 2: Poli(2,2-dimetilpropanoato) com um grupo terminal de cloreto e de protões
O ácido 3-cloro-2,2-dimetilpropanóico foi polimerizado usando carbonato de potássio como base (Figura 4A). Uma amostra de poli(2,2-dimetilpropanoato) (PDMP) com cloreto em uma extremidade e um próton na outra extremidade (M_n = 980 Da) foi ionizada com MALDI-ToF MS para determinar as arquiteturas poliméricas formadas durante a reação e analisar os diferentes grupos finais. A preparação da amostra MALDI-ToF MS foi iniciada com a confecção de soluções estoque de NaTFA (2 mg/mL em THF), analito (5-7 mg/mL em THF) e DCTB (20 mg/mL em THF). Uma vez feitas essas soluções, 5 μL da solução catiônica de Na⁺ , 5 μL da solução analita e 10 μL da solução da matriz foram combinados em um tubo de microcentrífuga e vórtices (proporção de 10:25:200 cátion:analito:matriz para um total de 20 mL). Em seguida, 1 μL dessa mistura foi removido do tubo de microcentrífuga e seco na placa-alvo MALDI-ToF MS. Para a matriz, o DCTB foi selecionado por funcionar com muitos outros poliésteres, no entanto, outras matrizes como CHCA, HABA, GFR e DHB foram testadas. CHCA, HABA e TFG ionizaram bem a amostra, no entanto, o DHB não teve sucesso. O íon NaTFA funcionou melhor em comparação com o trifluoroacetato de potássio (KTFA), trifluoroacetato de césio (CsTFA), trifluoroacetato de lítio (LiTFA) e trifluoroacetato de prata (AgTFA) porque interage melhor com os oxigênios dos grupos éster.

O espectro MALDI-ToF MS (Figura 4B) confirmou que a distribuição do peso molecular do PDMP com um grupo final de cloreto para a amostra 3 está na faixa de 600 Da a 1600 Da. Isso significa que a amostra apresentou baixa dispersão, o que levou aos valores de M_n, M_w e Đ sendo 980 Da, 1070 Da e 1,09, respectivamente, usando o software de análise MALDI-Tof MS. O pico monoisotópico foi suficientemente resolvido no modo refletrão, o que permitiu o uso da identificação exata da massa.

Figura 4: Esquema de reação e espectro de massa MALDI-ToF MS da amostra 2. (A). Esquema de reação para a síntese de PDMP usando ácido 3-cloro-2,2-dimetilpropanóico. (B) Espectro de massa MALDI-ToF MS da amostra 2. Este espectro completo de MALDI-ToF MS mostra a distribuição geral da amostra de PDMP com um grupo final de cloreto (M_n = 980 Da) ionizado com Na⁺. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para confirmar a massa da unidade de repetição do polímero, foi calculada a diferença de massa entre dois picos adjacentes. A unidade de repetição do polímero tem um peso molecular médio observado de 100,056 Da e isso foi confirmado tomando a massa média de oito picos (distribuição principal) na faixa de 600 Da a 1300 Da, que é apenas +0,004 Da abaixo da unidade de repetição teórica de PDMP (100,052 Da) e, além disso, tem uma massa do grupo final que corresponde a um hidrogênio (na extremidade frontal) e um cloreto (na parte traseira fim).

O espectro MALDI-ToF MS revelou três distribuições distintas, cada uma correspondendo ao polímero resultante com diferentes grupos finais. Esses grupos finais foram identificados e confirmados calculando suas massas teóricas e comparando-as com as massas observadas no espectro MALDI-ToF MS. Para identificar melhor os grupos finais, um n-mer individual foi selecionado para a análise (Figura 5).

A distribuição principal do PDMP mostrou que o polímero tem um hidrogênio (na extremidade frontal) e um cloreto (na extremidade traseira; azul). O valor de massa teórico do grupo 8 de PDMP (Figura 5) é composto pela massa das unidades de repetição (100,0524 Da x 8) mais a massa do grupo final Cl (+ 34,9689 Da) e a massa do grupo final de hidrogênio (+ 1,0078 Da) mais a massa do cátion sódio (+ 22,9892 Da), que produz uma massa total de 8 mer de 859,385 Da. O valor de massa observado para 8-mer [H-PDMP_8-Cl + Na]⁺ é 859,426 Da, que é apenas +0,041 Da diferente do valor teórico.

A próxima distribuição (laranja) mostrou o polímero substituindo o próton na extremidade frontal por um sódio e um cloreto na extremidade traseira. O valor de massa teórico do 8-mer do PDMP desprotonado é composto pela massa das unidades de repetição (100,0524 Da x 8) mais a massa do grupo final Cl (+ 34,9689 Da) e a massa de dois grupos sódio (+ (22,9892 Da x 2)) que produz uma massa total de 8 mer de 881,367 Da. O valor de massa observado para 8-mer [Na-PDMP_8-Cl + Na]⁺ é 881,413 Da, que é apenas +0,046 Da diferente do valor teórico.

Por fim, a terceira distribuição (verde) do PDMP confirmou a presença de espécies oligoméricas cíclicas. O valor de massa teórico do 8-mer de PDMP cíclico é composto pela massa das unidades de repetição (100,0524 Da × 8) mais a massa de um grupo sódio (+ 22,9892 Da), resultando em uma massa total de 8 mer de 823,409 Da. O valor de massa observado para o cíclico 8-mer [PDMP8 + Na]+ é 823,448 Da, que é apenas +0,039 Da diferente do valor teórico.

A presença de halogênios no polímero pode ser identificada por MALDI-ToF MS. O grupo final no polímero linear tem um Cl, que é indicado pela proporção de aproximadamente 3:1 dos picos [M⁺] e [M+2]⁺ . A diferença entre os picos observados e teóricos [M⁺] e [M+2]⁺ foi mostrada na Tabela 1. A abundância percentual teórica e observada para o segundo pico em 761,3 Da [M+2]⁺ é de 42,3% e 42,2%, respectivamente (com o primeiro pico sendo de 100%), o que confirma a presença de um grupo Cl no grupo polimérico final. A espécie cíclica foi encontrada 36 Da abaixo do composto sodiado linear e 58 Da abaixo do composto deodiado. Além disso, este composto cíclico não tinha a proporção de 3:1 que uma espécie monoclorada tem. Este cloreto poderia ter sido removido por meio de um_{ataque SN 2}com o carboxilato na extremidade oposta, levando ao fechamento do anel.

Figura 5: Espectro de massa MALDI-ToF MS de uma repetição individual da amostra 2. Este espectro MALDI-ToF MS mostra o pico principal como PDMP com grupos terminais de hidrogênio e cloreto (M_n = 980 Da) ionizados com Na⁺. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação entre a abundância percentual de pico observada e teórica e a intensidade isotópica de pico dos picos [M⁺] e [M+2]⁺ (com [M⁺] = 100%) do PDMP linear com grupo final de hidrogênio e cloreto (M_n = 980 Da) do MALDI-ToF MS. O grupo final no polímero linear tem um Cl que é indicativo pela proporção de aproximadamente 3:1 dos picos [M⁺] e [M+2]⁺ . Clique aqui para baixar esta tabela.

Amostra 3: Poli(2,2-dimetilpropanoato) com um quaternário de amónio e grupos terminais de protões.
O ácido 3-bromo-2,2-dimetilpropanóico foi polimerizado usando trietilamina (TEA) como base, no entanto, foi determinado que o TEA estava substituindo o Br no grupo final (Figura 6A). Uma amostra de PDMP com um amônio quaternário de um lado e um próton na outra extremidade (M_n = 1410 Da) foi usada para comparar a distribuição isotópica com aquelas com um grupo final de Cl. A preparação da amostra MALDI-ToF MS foi iniciada com a confecção de soluções estoque de KTFA (2 mg/mL em THF), analito (5-7 mg/mL em THF) e DCTB (20 mg/mL em THF). Uma vez feitas essas soluções, 5 μL da solução catiônica de K⁺ , 5 μL da solução analita e 10 μL da solução de matriz foram combinados em um tubo de microcentrífuga e vórtices (proporção de 10:25:200 cátion:analito:matriz para um total de 20 mL). Em seguida, 1 μL dessa mistura foi removido do tubo de microcentrífuga e seco na placa-alvo MALDI-ToF MS. Para a matriz, o DCTB foi selecionado porque funciona com muitos outros poliésteres. O cátion potássio foi adicionado para confirmar se a amostra era auto-ionizante.

O polímero contém nitrogênio quaternário (carregado positivamente) no grupo final, que pode se auto-ionizar. Isso foi confirmado pelos espectros MALDI-ToF MS, uma vez que a relação massa-carga (m / z) não mudou, independentemente de K ⁺ ou Na ⁺ ter sido usado na preparação da amostra. Além disso, os espectros MALDI-ToF MS confirmaram a presença de amônio quaternário carregado positivamente no grupo final, já que Br é um bom grupo de saída.

Os espectros MALDI-ToF MS confirmaram que a distribuição do peso molecular do PDMP com um grupo final de amônio quaternário está dentro da faixa de 600 Da a 2200 Da (Figura 6B). Isso significa que a amostra apresentou baixa dispersão, o que levou aos valores de M_n, M_w e Đ sendo 1410 Da, 1540 Da e 1,08, respectivamente, usando o software de análise MALDI-Tof MS.

Figura 6: Esquema de reação e espectro de massa MALDI-ToF MS da amostra 3. A) Esquema de reacção para a amostra 3. Esquema de reação para a síntese de PDMP usando ácido 3-bromo 2,2-dimetilpropanóico com trietilamina como base. (B) Este espectro completo de MALDI-ToF MS mostra a distribuição geral do PDMP linear com um grupo final de amônio quaternário (M_n = 1410 Da). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para confirmar se o polímero tinha a mesma unidade de repetição (monômero), foi calculada a diferença entre dois picos adjacentes. A unidade de repetição do polímero tem um peso molecular médio observado de 100,0535 Da. Isso foi confirmado observando a média de doze picos (distribuição principal), variando de 900 Da a 2300 Da, que é apenas +0,0011 Da acima da unidade de repetição teórica (100,0524 Da).

O espectro MALDI-ToF MS exibiu duas distribuições diferentes. Uma das distribuições mostrou que o polímero tem um ácido carboxílico e um amônio quaternário carregado positivamente como grupos finais (preto), enquanto a outra distribuição (roxo) mostrou a perda de prótons do ácido carboxílico e uma adição de íon potássio. Para identificar melhor os grupos finais, um n-mer individual foi selecionado para a análise (Figura 7).

O valor de massa teórico do grupo final de 12 mer de PDMP com amônio quaternário é composto pela massa das unidades de repetição (100,0524 x 12) mais a massa do grupo final de amônio quaternário (+ 101,1199) e a massa do grupo final de hidrogênio (+ 1,0078), que produz uma massa total de 12 mer de 1302,757 Da. O valor de massa observado para 12-mer [H-PDMP_12-TEA]⁺ é 1302,730 Da, que é apenas -0,027 Da abaixo do valor teórico.

O valor de massa teórico do grupo final de 12 mer de PDMP com amônio quaternário de um lado e a substituição do próton por outro íon potássio é composto pela massa das unidades de repetição (100,0524 × 12) mais a massa do grupo final de amônio quaternário (+ 101,1199) e a massa do grupo final de potássio (+ 38,9637), que produz uma massa total de 12 mer de 1340,713 Da. O valor de massa observado para 12-mer [K-PDMP_12-TEA]⁺ é 1340.700 Da, que é apenas -0.013 Da abaixo do valor teórico.

Figura 7: Espectro de massa MALDI-ToF MS de uma repetição individual da amostra 3. Este espectro MALDI-ToF MS mostra a distribuição primária do PDMP linear com um grupo final de amônio quaternário (M_n = 1410 Da). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra 4: Poli linear (brassilato de etileno)
A próxima amostra de polímero caracterizada por MALDI-ToF MS é o poli (brassilato de etileno) linear (l-PEB). Isso foi sintetizado a partir do monômero macrocíclico brassilato de etileno, que possui um anel de dezessete membros contendo dois grupos éster (Figura 8A). Para entender o grupo funcional e a mudança arquitetônica dentro da estrutura polimérica, quatro técnicas de caracterização diferentes foram exploradas: MALDI-ToF MS, ¹H-NMR, SEC e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). ¹H-NMR, SEC e FTIR confirmam a remoção do diéster cíclico e a formação de α-propargyl-ω-hidroxi-PEB. No entanto, essas técnicas não detectaram nenhum tipo de formação de subproduto. Por outro lado, o espectro MALDI-ToF MS (Figura 8B) de l-PEB exibe três distribuições de massa diferentes que indicam a formação de três PEBs diferentes: α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1), α-propargil-ω-propargil-PEB (2) e α-propargil-ω-hidroxi-PEB (3), respectivamente (Figura 8B).

Figura 8: Espectro MALDI-TOF de l-PEBs com Na⁺. (A) Estruturas lineares de poli (brassilato de etileno). (1) α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (2) α-propargil-ω-propargil-PEB (3) α-propargil-ω-hidroxi-PEB. (B) Três distribuições, incluindo α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1), α-propargil-ω-propargil-PEB (2) e α-propargil-ω-hidroxi-PEB (3), foram identificadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A amostra de l-PEB foi analisada no MALDI-ToF MS usando DCTB como matriz para polímeros apolares. A preparação da amostra MALDI-ToF MS foi iniciada com a confecção de soluções estoque de NaTFA (1 mg/mL em THF), analito (5 mg/mL em THF) e DCTB (20 mg/mL em THF). Uma vez feitas essas soluções, 1 μL da solução catiônica de Na⁺ , 5 μL da solução analita e 20 μL de (4) a solução da matriz foram combinados em um tubo de microcentrífuga e vórtices (proporção de 1:25:400 cátion:analito:matriz para um total de 26 mL). Em seguida, 1 μL dessa mistura foi removido do tubo de microcentrífuga e seco na placa-alvo MALDI-ToF MS. Os MWs observados para cada distribuição estavam dentro de um desvio de 0,03 Da dos pesos moleculares exatos dos íons [M + Na]⁺ .

O valor de massa teórico para o 6-mer de α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1) é composto pela massa das unidades de repetição (270,1831 Da x 6), mais a massa do grupo final 2-hidroxietoxi (+ 61,0290 Da), mais a massa do grupo final de hidrogênio (+ 1,008 Da), mais o cátion sódio (+ 22,9892 Da) que resulta em um total de 1706,124 Da. O valor de massa observado para o 6 mer de α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1) é 1706,133 Da, que foi apenas +0,009 Da acima do valor teórico.

O valor de massa teórico para o 5-mer de α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) é composto pela massa das unidades de repetição (270,1831 Da x 5), mais a massa do brassilato de etileno menos OCH₂CH₂O (+ 210,1620 Da), mais a massa de dois grupos terminais de éter propargílico (+ 55,0184 Da x 2), mais o cátion sódio (+ 22,9892 Da) que produz um total de 1694,103 Da. O valor de massa observado para o 5-mer de α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) é 1694,127 Da, que foi apenas +0,024 Da acima do valor teórico.

O valor de massa teórico para o 6-mer de α-propargil-ω-hidroxi-PEB (3) é composto pela massa das unidades de repetição (270,1831 Da x 6), mais a massa do grupo final do éter propargílico (+ 55,0184 Da), mais a massa do grupo final de hidrogênio (+ 1,008 Da), mais o cátion sódio (+ 22,9892 Da) que produz um total de 1700,113 Da. O valor de massa observado para 6 meros de α-propargil-ω-hidroxi-PEB (3) é 1700,139 Da, que foi apenas +0,026 acima do valor teórico.

Amostra 5: Poli linear azidado (brassilato de etileno)
Além disso, o I-PEB (amostra 6) foi funcionalizado com ácido 6-azidohexanóico por meio da esterificação de seus grupos finais de álcool (Figura 9), produzindo l-PEB azidificado (amostra 7). O produto obtido também foi analisado no MALDI-ToF MS (Figura 10) utilizando as técnicas de preparo de amostras como polímero original (amostra 6). Os MWs observados para cada distribuição estavam dentro de um desvio de 0,04 Da dos pesos moleculares exatos dos íons [M + Na]⁺. Após a esterificação, os íons [M + Na]⁺ de l-PEBs com dois grupos terminais hidroxi (1) mostram uma mudança na massa devido à sua conversão de (1) para α-azido-ω-azido-PEB (4). Além disso, l-PEBs com um grupo terminal hidroxi e um grupo terminal propargyl (3) foram convertidos em um α-propargyl-ω-azido-PEB (5). No entanto, (2) permanece sem reação devido a ambos os grupos finais de alcinos.

Figura 9: Esterificação de poli linear (brassilato de etileno) com grupo final de álcool via esquema de reação do ácido 6-azidohexanóico. α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1) converte-se em α-azido-ω-azido-PEB (4) e α-propargyl-ω-hidroxi-PEB converte-se (3) em α-propargyl-ω-azido-PEB (5). α-propargil-ω-propargil-PEB (2) permanece sem reação devido aos grupos terminais de alcino que não sofrem uma reação de esterificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O valor de massa teórico para o 6-mer de α-propargyl-ω-azido-PEB (5) é composto pela massa das unidades de repetição (270,1831 Da × 6), mais a massa do grupo final do éter propargílico (+ 55,0184 Da), mais a massa do grupo final do azidohexanoato (+ 140,0824 Da), mais o cátion sódio (+ 22,9892 Da) que resulta em um total de 1839,188 Da. O valor de massa observado para 6 meros de α-propargil-ω-azido-PEB (5) é 1839,184 Da, que é apenas -0,004 Da abaixo do valor teórico. Além disso, a presença de picos de íons metaestáveis (5-N₂) para (5) é outra indicação de funcionalização da azida, pois os íons metaestáveis só se formarão se houver uma azida presente na molécula.

O valor de massa teórico para o 6-mer do pico metaestável (5-N₂ + Na⁺) é 1815,126 Da, que foi determinado usando a equação do gráfico de diferença de massa dos picos de pico metaestável e α-azido-ω-hidroxi-PEG (Figura 11). O valor de massa observado para 6-mer do pico metaestável é 1815,089 Da, que é apenas -0,031 Da abaixo do valor teórico. O gráfico indica que, dentro da faixa de massa de 1000 a 2000 Da, o valor teórico da massa do pico metaestável é 24 a 24,1 Da menor que o de (5).

O valor de massa teórico para o 6-mer de α-azido-ω-azido-PEB (4) é composto pela massa das unidades de repetição (270,1831 Da × 6), mais a massa do grupo final do 6-azidohexanoato (+ 140,0824 Da), mais a massa do grupo final do 2-oxietil-6-azidohexanoato (+ 200,1035 Da), mais o cátion sódio (+ 22,9892 Da) que produz um total de 1994,273 Da. O valor de massa observado para o 6-mer de α-azido-ω-azido-PEB (4) é 1994,296 Da, que é +0,023 Da acima do valor teórico.

Figura 10: Espectro MALDI-ToF de l-PEBs azidificados com Na⁺. Estes incluem três distribuições de α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2), α-azido-ω-azido-PEB (4) e α-propargyl-ω-azido-PEB (5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Ilustração gráfica da diferença de massa entre α-azido-ω-hidroxi-PEG e seu composto metaestável em relação à massa de α-azido-ω-hidroxi-PEG (massa média 1700 Da). Este gráfico é derivado do espectro MALDI-ToF de α-azido-ω-hidroxi-PEG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra 6: Um polímero de pente amplamente disperso
O esquema de reação final é um polímero de pente que possui unidades repetitivas de tioéter com cadeias laterais de poli (etilenoglicol)⁹. A amostra de polímero em favo feita de 400 M_n metil éter-PEG-propargyl e 1,6-hexaneditiol (CP MeO-PEG-400 HDT; Figura 12A) foi analisado usando NaTFA. O sódio foi escolhido como o contra-íon porque éteres e tioéteres ionizam mais facilmente com sódio, lítio e potássio, em vez de metais alcalino-terrosos superiores, como o césio. Essas amostras foram executadas com uma matriz não polar, DCTB, embora matrizes adicionais (CHCA e DT) também tenham sido testadas com resultados ruins. A preparação da amostra MALDI-ToF MS foi iniciada com a confecção de soluções estoque de NaTFA (1 mg/mL em THF), analito (5 mg/mL em THF) e DCTB (20 mg/mL em THF). Uma vez que essas soluções foram feitas, 1 mL da solução catiônica, 5 mL da solução analita e 20 mL da solução da matriz foram combinados em um tubo de microcentrífuga e vórtices (proporção de 1:25:400 cátion:analito:matriz para um total de 26 mL). Em seguida, 1 mL dessa mistura foi removido do tubo de microcentrífuga e seco na placa-alvo MALDI-ToF MS. Como o NaTFA foi adicionado à amostra como um contra-íon, o espectro de massa MALDI-ToF MS exibiu os adutos de Na⁺ esperados da amostra conhecida. Além disso, aumentos de aproximadamente 16 Da, 32 Da e 48 Da acima desses picos também foram observados e serão discutidos mais adiante neste artigo.

Figura 12: Esquema de reação para a amostra 6 e espectro de massa MALDI-ToF da amostra 6 (A) Estrutura química e condições de reação de um polímero de pente à base de ditiol-ino com vários espaçadores HDT e cadeias laterais de 400 M_n PEG. (B) Espectro de massa MALDI-ToF da amostra 6, CP MeO-PEG-400 HDT. Unidade de repetição maior = 550,30 Da, Unidade de repetição menor = 44,02 Da Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O MALDI-ToF MS confirmou a ampla distribuição (dispersão por SEC = 2,88; Figura 12B) de CP MeO-PEG-400 HDT. O pico monoisotópico (compreendendo exclusivamente os isótopos elementares mais abundantes, ou seja, ¹²C, ¹H, ¹⁶O e ³²S) foi suficientemente resolvido, o que permitiu o uso da identificação exata da massa. Todos os cálculos teóricos de massa foram determinados usando massas monoisotópicas para cada elemento. Devido à ampla dispersão da amostra (2,88 por SEC), o espectro de massa MALDI-ToF não pôde ser usado para calcular o M_n, M_w ou Đ. MALDI-ToF MS se destaca na caracterização de polímeros estreitamente dispersos (Đ < 1.3), mas pode ter dificuldades com a caracterização completa de polímeros amplamente dispersos. Ao descrever polímeros com amplas dispersidades, apenas a extremidade de menor peso molecular do espectro de massa será bem resolvida e visível com MALDI-ToF MS, excluindo quaisquer espécies de maior peso molecular. Esse fenômeno é chamado de viés de massa baixa. Devido a essa ocorrência, a caracterização completa dos polímeros em favo apenas por meio do MALDI-ToF MS é inatingível. Por esse motivo, o SEC foi usado em conjunto com o MALDI-ToF MS para obter valores precisos de M_n, M_w e Đ.

Para confirmar a presença do polímero de pente, foi adotada uma abordagem semelhante para um polímero linear ou cíclico padrão. Cada unidade de repetição do polímero de pente contém uma distribuição estreita de M_n = 400 cadeias laterais de PEG, de modo que as unidades de repetição do polímero de pente foram exploradas para determinar a presença do produto pretendido em cada uma. Além disso, houve uma pequena quantidade de material de partida da polimerização deixada na solução de reação (300-700 Da) que também foi caracterizada.

No espectro completo do MALDI-ToF MS, o MW mais baixo e mais alto para 6 a 15 meros do MeO-PEG-OH pode ser visto. Originalmente, no espectro MALDI-ToF MS do material de partida MeO-PEG-propargyl, esses MeO-PEG-OH não eram visíveis (Figura 13; espectro superior). O aparecimento desses picos se deve à concentração relativa do MeO-PEG-propargyl ao MeO-PEG-OH. À medida que a reação do polímero do pente prossegue, o MeO-PEG-propargyl é incorporado ao produto. Por causa disso, a proporção do material de partida do alcino em comparação com o MeO-PEG-OH começa a diminuir, o que mostra MeO-PEG-OH não funcionalizado no espectro MALDI-ToF MS (Figura 13; espectro inferior).

Quanto à distribuição de massa do produto, valores de massa exatos foram usados para todos os cálculos subsequentes. O valor de massa teórico de uma unidade de repetição do material de partida [MeO-(PEG₁₀)-CH₂CCH + Na]⁺ é 44,0262 Da. Esta massa da unidade de repetição vezes o número de unidades de repetição, que será 10 para cada cadeia lateral, (44,0262 Da x 10) mais a massa do grupo final do α-metoxi (+ 31,0183 Da) e a massa do grupo final ω-propargyl (+ 39,0235 Da) mais a massa do cátion sódio (+ 22,9892 Da) produz uma massa total de 10 meros de 533,2932 Da. O valor de massa observado para o PEG de 10 meros + Na⁺ é 533,239 Da, que é -0,054 Da abaixo do valor teórico (Figura 13). Nos espectros completos do MALDI-ToF MS, há 6 a 9 mer abaixo e 11 a 15 mer acima para esta série. A sequência de picos menores e deslocados no espectro de baixo peso molecular corresponde ao material de partida MeO-PEG-OH não funcionalizado, onde o valor teórico da massa do 11-mer é composto pela massa das unidades de repetição (44,0262 Da x 11) mais a massa do grupo final α-metoxi (+ 31,0184 Da) e a massa do grupo final ω-hidrogênio (+ 1,008 Da) e a massa do cátion sódio (+ 22,9892 Da) que produz um total de 11 mer massa de 539.304. O valor de massa observado para o 11-mer + Na⁺ é 539,252 Da, que é apenas -0,052 Da abaixo do valor teórico.

Figura 13: Espectros de massa MALDI-ToF (ampliados de 530-615 Da) do material de partida (superior) e espécies de baixo peso molecular da amostra 8 (inferior), CP MeO-PEG-400 HDT. A proporção do material de partida do alcino em comparação com o MeO-PEG-OH (espectro superior e vermelho) começa a diminuir, o que mostra MeO-PEG-OH não funcionalizado (espectro inferior e azul) no espectro de massa CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF (espectro inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quanto aos polímeros de favo cíclico, suas massas com vários graus de polimerização podem ser multiplicadas pelas partes individuais do n-mer desejado. O valor de massa teórico do 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ é composto pela massa das unidades de repetição de cada cadeia PEG, das quais existem aproximadamente 8 por cadeia, (44,0262 Da x 16) mais a massa dos grupos terminais de metil de cada cadeia PEG (+ 15,0235 Da x 2) mais a massa dos carbonos que já foram o grupo propargyl e agora reagiram com os tióis (+ 41,0391 Da x 2) mais a massa do HDT que reagiu com os alcinos (+ 148,0380 Da x 2) e a massa do cátion sódio (+ 22,9892 Da) que produz uma massa total de 2 meros de 1167,599 Da. O valor de massa observado para o 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ é 1167,626 Da, que é +0,027 Da acima do valor teórico (Figura 14). Embora as estruturas cíclicas de menor peso molecular tenham sido observadas, os compostos lineares com tióis em ambas as extremidades ou ligações duplas em ambas as extremidades não puderam ser observados.

Esses polímeros contendo tioéter também podem sofrer oxidação, convertendo os tioéteres em sulfóxidos⁹. Isso explica a adição de múltiplos oxigênios (+ 15,9949 Da x n) dependendo do grau de oxidação; isso difere do aduto K+, que é uma diferença de +15,9739 Da do aduto Na⁺ . Para a oxidação simples do 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]^+, o valor de massa teórico é 1183,594 Da, enquanto o valor de massa observado foi de 1183,620 Da com apenas um aumento de +0,026 Da em relação ao valor teórico. Para a dupla oxidação do 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺, o valor de massa teórico é 1199,590 Da, enquanto o valor de massa observado foi de 1199,613 Da com um aumento de apenas +0,023 Da em relação ao valor teórico. Finalmente, para a tripla oxidação do 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]⁺, o valor de massa teórico é 1215,585 Da, enquanto o valor de massa observado foi de 1215,617 Da com um aumento de apenas +0,032 Da em relação ao valor teórico.

Figura 14: Espectro de massa MALDI-ToF da amostra 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Aumentar o zoom de 1165-1254 Da mostra produtos de polímero de pente cíclico de 2 meros com diferentes quantidades de unidades de repetição PEG anexadas e vários graus de oxidação de tioéter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A oxidação pode ser confirmada ainda mais realizando um estudo de contra-íons. Isso envolve o uso de um cátion ionizante diferente, como K ⁺, e a comparação do deslocamento dos picos nos espectros MALDI-ToF MS. Uma amostra de CP MeO-PEG-400 HDT foi executada no MALDI-ToF MS usando KTFA em vez de NaTFA (Figura 15). Isso desloca todas as massas dos picos para cima em +15,9739 Da devido à diferença de massa entre Na⁺ e K⁺. Para a análise com o aduto de K⁺ , nenhum polímero não oxidado (1183.574 Da_Theo) estava presente nos espectros MALDI-ToF MS. Para a oxidação simples do 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ o valor de massa teórico é 1199,569 Da enquanto o valor de massa observado foi 1199,567 Da (apenas -0,002 Da), para a dupla oxidação do 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ o valor de massa teórico é 1215,564 Da enquanto o valor de massa observado foi 1215,572 Da abrangendo uma diferença (apenas +0,008 Da), para a oxidação tripla do 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ o valor de massa teórico é 1231,558 Da, enquanto o valor de massa observado foi de 1231,563 Da (apenas +0,005 Da), e para a oxidação quádrupla recém-formada do 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ o valor de massa teórico é 1247,553 Da, enquanto o valor de massa observado foi de 1247,551 Da (apenas -0,002 Da). Deve-se notar que os polímeros oxidaram ainda mais entre os adutos de Na⁺ e K⁺ , resultando na perda do produto não oxidado e na formação da oxidação quádrupla do CP MeO-PEG-400 HDT. Também pode ser notado que, embora o polímero realmente voe com os adutos Na⁺ e K⁺ , a relação sinal-ruído é significativamente maior para os adutos Na⁺ , acentuando a opção de usar Na⁺ para a caracterização primária.

Figura 15: Espectro de massa MALDI-ToF da amostra 8, CP MeO-PEG-400 HDT. O zoom de 1195-1254 Da mostra produtos de polímero de pente cíclico de 2 meros com diferentes quantidades de unidades de repetição PEG anexadas e vários graus de oxidação de tioéter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

MALDI-ToF MS é uma técnica altamente eficaz para a caracterização de polímeros sintéticos, oferecendo medições precisas com fragmentação mínima devido ao seu mecanismo de ionização suave. Nesse método, a matriz absorve energia de um laser e a transfere para o analito²⁶. Essa energia faz com que o polímero vaporize, ionize por meio da interação com um agente catiônico e dessorva no vácuo. Os analitos ionizados viajam através do tubo de voo, onde são detectados com base em sua relação massa-carga (m / z) ^{26 , 27} . Este método é adequado para determinar a massa de moléculas monodispersas e é igualmente eficaz para polímeros moderadamente dispersos (Đ = 1,1-1,3) e altamente dispersos, onde a massa unitária repetida e os grupos finais podem ser determinados. Para polímeros moderadamente dispersos, o MALDI-ToF MS também fornece dispersão (Ð), peso molecular médio (M_n) e peso molecular médio ponderal (M_w).

No entanto, várias limitações da técnica devem ser observadas. MALDI-ToF MS exibe um viés de baixa massa ao analisar polímeros com alta dispersidade (Đ > 1,3), o que significa que polímeros de menor massa na distribuição dominam o espectro, enquanto espécies de maior massa são picos de baixa intensidade ou ausentes ^28,29. Além disso, a resolução diminui significativamente para polímeros acima de 10.000 Da, e polímeros acima de 15.000 Da podem ser melhor analisados no modo linear. No entanto, o modo linear sacrifica a resolução de pico isotópica em comparação com o modo refletor. Além disso, o MALDI-ToF MS depende da capacidade do polímero de ionizar de forma eficaz. Polímeros com sistemas conjugados ou heteroátomos ionizam mais prontamente do que hidrocarbonetos saturados como polietileno ou polipropileno, que muitas vezes requerem modificações químicas para ionizar ^30,31.

A preparação da amostra é uma etapa crucial para alcançar resultados bem-sucedidos. Um dos aspectos mais importantes é a seleção da matriz apropriada para o analito polimérico^11,32. Por exemplo, matrizes como DCTB e GFR funcionam bem para polímeros não polares, enquanto DHB e CHCA podem ser comparadas para polímeros polares para identificar qual matriz fornece os picos mais resolvidos. Além disso, a escolha de um solvente apropriado para dissolver a matriz e o analito garante a cocristalização adequada, o que melhora a ablação a laser e melhora a resolução nos espectros MALDI-ToF MS resultantes 33,34,35. Da mesma forma, a escolha do agente catiônico apropriado é essencial para maximizar a eficiência da ionização e produzir picos claros e distinguíveis.

Uma vez que a matriz e o agente catiônico tenham sido selecionados, a relação matriz:analito:cátion pode ser otimizada. Comece preparando soluções estoque do cátion selecionado (1 mg / mL em THF), analito (5 mg / mL em THF) e matriz (20 mg / mL em THF). Recomenda-se uma relação de volume inicial de 1:5:20 μL (cátion:analito:matriz), correspondendo a taxas de concentração de aproximadamente 1:25:400 mg/mL em um volume total de 26 μL. Se essa mistura inicial não produzir espectros bem resolvidos, uma otimização sistemática pode ser realizada usando uma abordagem baseada em grade (Tabela 2) ^{10 , 16} . Nesta configuração, o volume do analito é fixo, enquanto o volume da matriz é multiplicado incrementalmente por 4 nas colunas e o volume do cátion é multiplicado por 4 nas linhas. Essa grade permite que os usuários identifiquem a proporção ideal para ionização e resolução. Se uma das condições da grade externa fornecer desempenho aprimorado, uma nova grade pode ser gerada centralizada nessa proporção, continuando o múltiplo de 4 ajustes para refinamento adicional. Um bom ponto de partida é avaliar se o espectro contém picos de alta intensidade, baixo ruído de linha de base e resolução isotópica bem resolvida. Esse processo pode ser demorado, principalmente para polímeros novos ou complexos que podem exigir o teste de várias matrizes e cátions em uma grade de preparação 3 x 3.

Tabela 2: Grade sistemática de proporções experimentais pode ser criada e testada. Uma proporção de 1:5:20 μL de cátion, analito e matriz, respectivamente, será usada para iniciar (1:25:400 mg/mL) cátion:analito:matriz para um total de 26 mL. O volume da substância a analisar é fixado em 5 μL (25 mg/ml). A matriz e a proporção de cátions são multiplicadas incrementalmente por 4 nas colunas e nas linhas, respectivamente. Clique aqui para baixar esta tabela.

Após a aplicação da amostra na placa-alvo MALDI-ToF MS, usando o método de gotículas secas, a placa MALDI-ToF MS é então carregada no instrumento MALDI-ToF MS. Os parâmetros de aquisição de dados MALDI-ToF MS, como potência do laser, diâmetro do feixe de laser, ganho do detector e extração de íons de pulso, podem ser ajustados para obter maior resolução e separação de pico mais clara. Estes podem ser alterados sistematicamente para determinar a intensidade do pico, diminuir o ruído da linha de base e melhorar a resolução do pico (Figura 1).

A otimização dos parâmetros instrumentais e das taxas de preparação da amostra não segue um fluxo de trabalho estritamente linear. Os operadores podem começar com um método de preparação de amostra preferido e selecionar no modo linear para avaliar se o polímero ioniza, ou podem primeiro ajustar o método do instrumento (por exemplo, potência do laser, extração de pulso) antes de modificar as proporções da mistura de amostra usando a grade de preparação 3 x 3. A flexibilidade no fluxo de trabalho é muitas vezes necessária, especialmente ao analisar materiais novos, desconhecidos ou mal caracterizados.

Uma vez concluída a otimização, um protocolo de preparação de amostras pode ser reutilizado, embora ainda possa ocorrer uma ligeira variabilidade entre operadores ou entre dias. A realização de uma calibração para cada execução de aquisição minimiza a variação, e as diferenças na massa de pico normalmente permanecem abaixo de 0,1 Da quando protocolos consistentes são seguidos. Portanto, a reprodutibilidade entre usuários e dias é alcançável se o método do instrumento e a preparação da amostra permanecerem os mesmos. Se os problemas continuarem a persistir, uma tabela com problemas comuns que um usuário pode enfrentar e soluções é fornecida na Tabela 3.

Tabela 3: Problemas comuns e estratégias de solução de problemas com base na experiência prática. A tabela auxilia com problemas encontrados durante a preparação da amostra, aquisição e análise de dados. Para solução de problemas específicos do instrumento, consulte o manual do fabricante do MALDI-ToF MS ou um técnico qualificado. Clique aqui para baixar esta tabela.

A calibração é uma etapa crítica para garantir a precisão das medições de massa. Calibrações externas e internas podem ser empregadas, mas é vital que os calibrantes usados estejam dentro da faixa de massa do analito de polímero. A calibração adequada garante que a massa do analito seja determinada corretamente.

A análise de dados é realizada onde o espectro de massa MALDI-ToF MS é aberto e a seleção de pico pode ser selecionada para análise posterior. A massa de macromoléculas monodispersas, bem como polímeros baixos, moderados e altamente dispersos de um n-mer especificado, pode ser confirmada comparando a massa observada com valores teóricos calculados usando software de desenho químico. Essas comparações ajudam a verificar a massa total de uma macromolécula monodispersa ou, no caso de polímeros baixos, moderados e altamente dispersos de um n-mer especificado, os grupos finais são identificados e a massa unitária repetida é confirmada.

Em resumo, otimizar a matriz, as condições de catiação e as proporções experimentais é fundamental para obter dados de alta resolução do MALDI-ToF MS. A calibração garante medições de massa precisas. A análise de dados usando coleta de pico e comparação teórica de massa permite a caracterização completa do polímero, incluindo a identificação de grupos finais e a massa da unidade de repetição. Essa técnica pode ser usada para macromoléculas monodispersas, além de polímeros sintéticos de baixa dispersão, dispersão moderada e alta dispersão. As direções futuras incluem a expansão da caracterização de arquiteturas complexas de polímeros, como misturas de filmes finos de polímeros, polímeros cíclicos e polímeros hiperramificados por meio de métodos de preparação de amostras sem solventes e espectrometria de massa em tandem (MS / MS) ^{36 , 37 , 38} . Combinações de instrumentos, como o uso de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para fracionar uma amostra, seguida de MALDI-ToF MS para análise estrutural, podem ser usadas para identificar estruturas de baixa massa, determinar a dispersão fracionada e caracterizar grupos finais em amostras de polímeros altamente dispersas 39,40,41. Além disso, novas abordagens de análise de dados, incluindo entrada manual ou geração assistida por software de gráficos de defeitos de massa de Kendrick, permitem a conversão de espectros de massa em mapas bidimensionais, facilitando a identificação de vários grupos finais dentro de uma amostra ^2,42.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida	Produtos químicos TCI	D1601	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/D1601
1,1,1-Tris(hidroximetil)propano	Millipore Sigma	148083	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/148083?srsltid=AfmBOoqaMzcy1xravp1h2QE 0myfY5gjuEBfOIv2o882Wb _xcB4Ol4CMW
1,5,7-Triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno	Millipore Sigma	345571	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE xu-Y5MJoJID6RJiby0NXyu DHOxXYjle_kMT
1,6-hexaneditiol 98% (HDT)	TCI	H0334	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
Ácido 2-(4-hidroxifenilazo)benzóico) (HABA)	Millipore Sigma	H5126	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
Ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiónico	Millipore Sigma	106615	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK 56NKhDKdlAN8feUrMxVYhul Muz2en6NYEGIh4b
2,2-Dimetoxi-2-fenilacetofenona 99% (DMPA)	Sigma-Aldrich	196118	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A -bIgnXbkrvWKIUNH6qOsc RseQLNVKi0DMWPb-
Ácido 2,5-di-hidroxibenzóico (DHB)	Millipore Sigma	149357	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-(Dimetilamino)piridina	Millipore Sigma	522821	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage= 30& classificar = relevância& term=522821 & type=produto
Ácido 6-bromohexanóico	Millipore Sigma	150452	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1 & por página=30& classificar = relevância& termo= 6-Bromohexanoico%20ácido& type=produto
Benzaldeído dimetilacetal	Millipore Sigma	226076	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid= AfmBOorbjP7zD9MO3g5Xk LL3rNZ02PhfkXoRfe3EjRK7 TrqJ-kEOrTCN
Ácido benzóico	Millipore Sigma	242381	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e _j-KetQyyHJ6Qq86jSK8 ZVxC3BorQgkO8Xg5I
Bruker UltraFlextreme	Bruker Daltonics		https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
Clorofórmio	Fisher Científico	AA32614K7	https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7 ?searchHijack=true& searchTerm= clorofórmio-acs-99-8-thermo-scientific & searchType=Rapid& matchedCatNo =AA32614M6
Ditranol, BP, 98,5-101% (DT)	Fisher Científico	18-602-270	https://www.fishersci.com/shop/products/dithranol-bp-98-5-101-spectrum-chemical/18602270
Brasilato de etileno	Millipore Sigma	W354309	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium= cpc& utm_campaign=8692675663& utm _content=86098110623& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiApY-7BhBjEiwAQMr rEdJTcKN5TEFkP1uHvRlVign3lwg2cj5 _spBUCrfi6exZ3Ur5sJkARxoCfWsQ AvD_BwE
Galvinoxil, radical livre	Millipore Sigma	G307	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid= AfmBOopoWGDMXtLk5Erf0rVyl 7j442uyg8rIWkfBjhHZ2z0dDktH3y8-
Metanol	Fisher Científico	Resposta 456	https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
Paládio, 10% em carbono, Tipo 487, seco	Fisher Científico	AAA1201206	https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
Poli(etileno  glicol) éter monometílico 350  Mn  (MeO-PEG-OH 360)	Fisher Científico	AA4156022	https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
Trifluoroacetato de potássio (KTFA)	Millipore Sigma	281883	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
Álcool propargílico	Fisher Científico	A10295.0F	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
Brometo de propargil 97% (80% p/p em tolueno estabilizado com MgO)	Fisher Científico	AAL1059514	https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20 (80%%20w/w%20in%20tolueno%20stabilized%20with%20MgO)
Azida de sódio	Millipore Sigma	S2002	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002
Hidreto de sódio 60% de dispersão em óleo mineral	Millipore Sigma	452912	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid= AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
Trifluoroacetato de sódio (NaTFA)	Oakwood	MFCD00013217	https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt Pesquisa=1549& ExtHyperLink=1
Kit de Baixo Alcance SpheriCal Neat (250 - 7.500 Da)	Fábrica de Polímeros	PFS-104	https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
Tetrahidrofurano (THF)	Fisher Científico	T427	https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
trans-2-[3-(4-terc-butilfenil)-2-metil-2-propenilideno]malononitrila (DCTB)	TCI	B3635	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA)	TCI	Rolamento C1768	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/C1768