Artigo de método

Desenvolvimento de um Dispositivo Inovador de Iluminação Baseado em LED para Aplicação In Vitro de Terapia Fotodinâmica com Rosa Bengala

DOI:

10.3791/68462

⸱

12 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito apresenta um novo e inovador dispositivo de iluminação impresso em 3D para estudar a terapia fotodinâmica mediada por Rosa Bengala in vitro.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve um novo dispositivo de terapia fotodinâmica (PDT) para avaliar a eficácia da PDT mediada por Rose Bengal (RB) in vitro. O dispositivo, chamado CELL-LED-550/3, consiste em duas peças impressas em 3D, uma gerando uma luz verde de 550 nm a partir de um único LED (a parte da fonte de luz) e a outra distribuindo essa luz para uma placa de cultura de células de 96 poços (a parte distribuidora de luz). A parte da fonte de luz é controlada por um driver com três modos diferentes, permitindo que a parte distribuidora de luz forneça três níveis diferentes de irradiância para a superfície externa inferior dos poços: 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 ou 0,62 mW/cm2. A parte distribuidora de luz foi projetada para iluminar os poços individualmente e simultaneamente. Para demonstrar a relevância do dispositivo CELL-LED-550/3, foi avaliada sua capacidade de induzir a morte celular por PDT mediada por RB em células de carcinoma hepatocelular HepG2. Primeiro, as células HepG2 foram tratadas por 2 h com concentrações crescentes de Rosa Bengala, um fotossensibilizador com um pico de absorção (o mais alto) em torno de 550 nm. As células tratadas foram então iluminadas usando o dispositivo CELL-LED-550/3 ajustado para seu nível máximo de irradiância em doses de luz de 0,3 J/cm2, 0,6 J/cm2 e 1,2 J/cm2 (respectivamente, com tempos de iluminação de 8 min e 4 s, 16 min e 8 s e 32 min e 16 s). Finalmente, a viabilidade foi medida usando Cell-Titer Glo 24 h pós-PDT. Os resultados experimentais mostram que a TFD mediada por RB usando o dispositivo CELL-LED-550/3 é capaz de induzir uma diminuição na viabilidade das células HepG2, de maneira dependente tanto da concentração de Rosa Bengala quanto da dose de luz administrada. Com base na prova de conceito apresentada neste artigo, o dispositivo CELL-LED-550/3 adiciona mais uma ferramenta ao estudo da PDT mediada por RB.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com mais de 905.000 novos casos e 830.000 mortes em 2020, o câncer primário de fígado é o sétimo câncer mais comum e a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo1. Dentre os cânceres primários de fígado, o carcinoma hepatocelular (CHC) é a forma mais comum, correspondendo a aproximadamente 90% doscasos2. Devido à doença hepática crônica não detectada e à baixa adesão à vigilância, apenas 25% dos pacientes com CHC são diagnosticados no estágio inicial da doença3. Esses pacientes diagnosticados precocemente são tipicamente tratados por ressecção hepática, transplante hepático ou terapias ablativas locais com intenção curativa e demonstram bom prognóstico com taxa de sobrevida em cinco anos acima de 70%4,5. Para os outros 75% dos pacientes (aqueles com CHC diagnosticado intermediário ou tardio), embora modalidades de tratamento inovadoras, incluindo terapias direcionadas, imunoterapias e esquemas combinados, tragam benefício de sobrevida6, o prognóstico permanece muito ruim: a taxa de sobrevida em cinco anos de fato não excede 30% para esse grupo de pacientes e cai para 2% para o subgrupo de pacientes metastáticos6. Explorar opções alternativas de tratamento, portanto, é crucial para melhorar os resultados do tratamento e prolongar a sobrevida em pacientes com CHC em estágio intermediário ou avançado. A Terapia Fotodinâmica (TFD), que é uma terapia antineoplásica amplamente praticada em dermatologia7, pode ser uma alternativa adequada

A TFD é um tratamento fotoquímico que combina o uso de um agente fotossensibilizante (PS), um comprimento de onda apropriado da luz visível e oxigênio molecular para gerar espécies reativas de oxigênio citotóxicas (ROS)8. Os efeitos anticancerígenos da TFD são derivados de três mecanismos induzidos por ROS9: primeiro, efeitos citotóxicos diretos nas células malignas10, depois danos à vasculatura tumoral que induzem hipóxia do tecido tumoral, privação e regressão de nutrientes11 e, finalmente, indução de reação inflamatória através da liberação de sinais de perigo e antígenos tumorais de células tumorais danificadas ou moribundas12. Por mais de três décadas, a TFD tem sido objeto de intensa investigação com o objetivo de avaliar seu potencial para tratar vários tipos e formas de câncer 13,14,15,16,17,18. Com base em sua eficácia comprovada a partir dessas investigações 19,20,21, a TFD é atualmente utilizada em dermatologia para o tratamento de cânceres de pele não melanoma 7. Para as demais indicações, o número de estudos clínicos tem aumentado nos últimos anos, demonstrando os esforços significativos para trazer a TFD, usada isoladamente ou em combinação com tratamentos padrão, para a prática clínica 22,23,24.

Existe uma variedade de agentes fotossensibilizantes usados para PDT25. Entre eles, a Rosa Bengala (RB) demonstrou atuar como um agente fotodinâmico eficiente contra células tumorais de laringe26, células de melanoma27, células de câncer de mama28 e tecidos de câncer de próstata29. O trabalho apresentado neste artigo baseia-se na necessidade de avaliar se a PDT mediada por RB também é eficiente para células HCC.

Tal avaliação de fato exigiu o desenvolvimento prévio de um dispositivo baseado em LED verde dedicado à iluminação de 550 nm de placas de cultura de células de 96 poços. Um projeto em duas partes foi implementado para este dispositivo30: uma parte da fonte de luz gera uma luz verde de 550 nm a partir de um único LED, enquanto uma parte distribuidora de luz distribui essa luz, através do uso de um feixe de fibra óptica, para os 96 poços individualmente e longe do LED. Este design de duas partes primeiro evita que as células sofram efeitos térmicos prejudiciais que possam surgir devido ao calor descontrolado gerado dentro do LED e, em segundo lugar, permite iluminar as células dentro de uma incubadora de cultura de células, mantendo a parte da fonte de luz com seus componentes eletrônicos (incluindo o LED) do lado de fora. Esses recursos inovadores dão ao chamado dispositivo CELL-LED-550/3 grandes vantagens sobre os sistemas baseados em LED já publicados que foram projetados especificamente para iluminação de placas de vários poços 31,32,33,34,35.

Neste artigo, o dispositivo CELL-LED-550/3 é descrito pela primeira vez em detalhes. Então, como prova de conceito, um estudo de viabilidade celular demonstra a eficácia da PDT mediada por RB usando CELL-LED-550/3 em um modelo de cultura de células 2D HCC (HepG2)30. Além de ser barato e portátil, o dispositivo CELL-LED-550/3 também é uma ferramenta particularmente relevante para experimentos de PDT mediados por RB.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Construção do dispositivo

NOTA: As duas partes do dispositivo CELL-LED-550/3 são fabricadas separadamente e, apenas como última etapa, são conectadas juntas.

  1. Construção da parte da fonte de luz
    1. Conecte um conjunto de dissipador de calor com ventilador de tamanho adequado na parte traseira da placa de circuito impresso (PCB) na qual o LED de 550 nm 3 W está montado.
    2. Cubra o LED com uma lente colimadora de PMMA (polimetilmetacrilato) transparente para primeiro homogeneizar o feixe de luz e, em segundo lugar, reduzir o ângulo do feixe de 120° para 10°. Essa redução permite aumentar a quantidade de luz fornecida à parte distribuidora de luz.
    3. Conecte o LED ao driver atual com escurecimento de modo triplo, o que permite que diferentes níveis de irradiância sejam fornecidos.
    4. Construa separadamente a caixa, a frente da caixa e o fechamento da caixa em impressão 3D (caixas vermelhas na Figura 1).
    5. Instale o driver e o LED equipados com a lente e o conjunto do dissipador de calor com ventilador em seus locais dedicados no gabinete (caixas azuis na Figura 1).
    6. Instale o conector de alimentação e a chave basculante em seus locais dedicados no fechamento da caixa (caixas azuis na Figura 1).
    7. Conecte o driver e o conjunto do dissipador de calor do ventilador à tomada de alimentação através do interruptor basculante.
    8. Monte a caixa, o fechamento da caixa e a frente da caixa.
    9. Verifique se o LED está alinhado com o eixo da abertura cilíndrica da frente da caixa.
      NOTA: A abertura cilíndrica da frente da caixa destina-se à conexão óptica da parte da fonte de luz (conector fêmea) com a parte distribuidora de luz (conector macho).

figure-protocol-1
Figura 1: Vistas tridimensionais frontal (A), traseira (B) e explodida (C) da parte da fonte de luz. Adaptado de Lefebvre, A. et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

  1. Construção da parte distribuidora de luz
    1. Construa separadamente o fechamento inferior da caixa, a caixa e a tampa superior na impressão 3D (juntas elas formam uma caixa oca) (caixas vermelhas na Figura 2).
    2. Construa o espaçador de 96 poços em impressão 3D branca (caixa vermelha na Figura 2) para que ele se encaixe exatamente na caixa oca mencionada em 1.2.1. A cor branca visa maximizar a reflexão da luz e, assim, otimizar a distribuição da luz.
      NOTA: O diâmetro e o espaçamento central das aberturas circulares presentes no espaçador de 96 poços devem ser iguais ao diâmetro e ao espaçamento central dos poços da placa de 96 poços usada para ensaios biológicos.
    3. Faça 96 pequenos furos no fechamento superior da caixa oca de modo que fiquem alinhados com o centro das 96 aberturas circulares no espaçador de 96 poços, quando este último for colocado no fechamento superior.
    4. Insira uma fibra óptica plástica de 0,5 mm de diâmetro, de baixo para cima, em cada um dos 96 pequenos orifícios do fechamento superior.
    5. Aplique resina de poliéster na parte inferior do fechamento superior para unir as 96 fibras ópticas ao fechamento superior.
    6. Depois que a resina secar, polir as extremidades distais das fibras ópticas até que elas se ajustem ao topo do fechamento superior.
    7. Reúna as fibras ópticas dentro da caixa oca mencionada na etapa 1.2.1 em um único feixe protegido por uma bainha, que se estende por cerca de dois metros para fora da caixa.
      NOTA: A altura da caixa deve ser suficiente para evitar a dobra das fibras ópticas e a atenuação óptica que possa ser causada.
    8. Monte a caixa oca de forma que o feixe de fibras passe pela abertura dedicada da caixa.
    9. Junte as extremidades proximais das fibras ópticas em um conector macho impresso em 3D, permitindo a conexão com a parte da fonte de luz (conector fêmea).
      NOTA: Este conector não deve exigir a necessidade de cola para evitar a atenuação da luz que esta cola pode causar.
    10. Coloque o espaçador de 96 poços na caixa oca.
    11. Crie uma tela inserindo um papel vegetal entre uma placa de PMMA transparente (face inferior) e uma folha de mylar à prova de arranhões (face superior) para difundir o feixe estreito fornecido em cada extremidade distal da fibra óptica em um feixe tão grande quanto o diâmetro do poço da placa de 96 poços usada para ensaios biológicos.
    12. Construa a moldura da tela em impressão 3D (caixa vermelha na Figura 2) para que sua abertura central se encaixe exatamente no tamanho da placa de 96 poços usada para ensaios biológicos e, assim, os poços se alinhem perfeitamente com as aberturas circulares do espaçador de 96 poços.
    13. Fixe a tela na parte superior do espaçador de 96 poços com a moldura da tela.

figure-protocol-2
Figura 2: Vistas tridimensionais da parte do distribuidor de luz. Adaptado de Lefebvre, A. et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

  1. Montagem da parte da fonte de luz com a parte do distribuidor de luz
    1. Conecte o conector macho da peça distribuidora de luz no conector fêmea da parte da fonte de luz.
      NOTA: Uma vez que o conector macho é conectado ao conector fêmea, o feixe de luz fornecido pela parte da fonte de luz deve cobrir um pouco mais do que a área de superfície do elemento receptor de luz da parte distribuidora de luz, garantindo assim o fornecimento de luz para as 96 fibras ópticas.

2. Ensaios biológicos

  1. Processo de cultura celular
    1. Cultivar a linhagem celular de hepatocarcinoma HepG2 em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino inativado pelo calor e 1% de estreptomicina e penicilina.
    2. Manter os frascos de cultura contendo células HepG2 numa incubadora de cultura de células de CO2 a 5% a 37 °C.
    3. Mudar o meio de cultura de 3 em 3 dias, aspirando o meio de cultura dos frascos e substituindo-o por meio de cultura RPMI 1640 previamente aquecido a 37 °C.
    4. Use um microscópio para verificar a confluência das células nos frascos de cultura até que atinjam 80%-90% de confluência.
  2. Processo de semeadura
    1. Remova as células da incubadora e coloque-as sob a estação de segurança microbiológica pré-limpa.
    2. Retirar o meio de cultura dos balões de cultura.
    3. Lavar os frascos de cultura com uma solução tampão fosfato.
    4. Aplicar 3 ml de tripsina (0,25%, 0,53 mM) nas células e colocar os frascos de cultura na incubadora a 37 °C durante 5 min para separar as células.
    5. Após 5 min, recuperar a tripsina dos frascos de cultura com 7 mL de meio de cultura e recuperar toda a solução de meio + tripsina + células em um tubo de 15 mL.
    6. Conte as células usando um contador de células. Para fazer isso, pegue 20 μL da solução contendo as células e coloque-a em um tubo. Adicione 20 μL de solução de azul de tripano e coloque a solução de célula + azul de tripano na lâmina de contagem e insira no contador de células.
    7. Uma vez que as células tenham sido contadas, dilua-as em meio de cultura para obter uma solução de 150.000 células/mL e semeie as células em uma placa branca de 96 poços com fundo plano transparente a uma taxa de 1,5x104 células/poço. A cor branca visa maximizar a reflexão e distribuição da luz dentro dos poços.
      NOTA: O número de células por alvéolo deve ser ajustado de acordo com a linhagem celular utilizada. Um teste de densidade prévio pode ser necessário para encontrar o número certo de células para semear.
    8. Prepare duas placas para cada tempo de leitura de viabilidade. Uma placa será iluminada e a outra permanecerá escura.
    9. Incube as placas por 24 h antes do tratamento para permitir a fixação das células.
  3. Tratamento Rosa Bengala
    1. Prepare uma solução estoque de Rosa Bengala reconstituindo o pó de Rosa Bengala em solução salina a 10%. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes do tratamento celular para evitar qualquer degradação da Rosa Bengala devido à sua estabilidade.
    2. Preparar soluções de Rosa Bengala em concentrações crescentes (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) diluindo a solução-mãe de Rosa Bengala previamente preparada no meio de cultura celular.
    3. Uma vez preparadas as soluções, retirar o meio de cultura das placas que contêm as células e adicionar 100 μl de soluções de tratamento Rosa Bengala.
    4. Incube as células com tratamento com Rosa Bengala por 2 h para permitir a internalização da Rosa Bengala.
      NOTA: O tempo de incubação da solução de Rosa Bengala pode diferir dependendo da linhagem celular usada. A cinética de incorporação de Rosa Bengala pode precisar ser ajustada por medição de fluorescência para encontrar o tempo de incubação certo para cada linha celular estudada.
    5. Após 2 h, remova as soluções de Rosa Bengala, lave as células duas vezes com PBS e adicione 100 μL / poço de meio de cultura livre de Rosa Bengala.
      NOTA: Lavagens adicionais com PBS podem ser necessárias para concentrações mais altas de Rosa Bengala. Uma verificação visual pode ser feita para garantir que as células foram lavadas corretamente. Uma vez suficientemente enxaguado, o PBS não deve assumir uma cor rosa devido à Rosa Bengala presente fora das células.
    6. Cubra as microplacas com papel alumínio para protegê-las da exposição à luz. Ilumine metade das placas para o ensaio PDT (consulte a etapa 2.4). As placas não iluminadas fornecerão dados de controle para os resultados da PDT (condição escura). Eles também fornecerão dados sobre o impacto da Rosa Bengala não fotoativada na viabilidade celular. As demais microplacas serão utilizadas para exposição à luz no dispositivo (condição PDT).
  4. Procedimento operacional para o dispositivo CELL-LED-550/3
    1. Conecte o conector macho do distribuidor de luz ao conector fêmea da fonte de luz. Em seguida, conecte a fonte de luz a uma tomada elétrica.
    2. Remova duas microplacas (PDT + condição escura) da incubadora, remova o alumínio para a condição PDT e coloque esta placa no distribuidor de luz.
    3. Defina o dimmer do driver para seu nível máximo para maximizar a potência fornecida pelo LED e obter uma irradiância média de 0,62 mW/cm2 nos 96 poços.
      NOTA: O dimmer do driver deve ser ajustado para o valor mais apropriado para os ensaios biológicos (entre os três disponíveis). Qualquer que seja o dimmer do driver definido, a baixa irradiância fornecida não requer o uso de óculos de segurança.
    4. Ilumine a placa até atingir a dose desejada de luz nas células. Para obter a dose de luz desejada, dois parâmetros podem ser ajustados, Tempo e Irradiância, referentes à seguinte equação:
      Dose de luz (J / cm2 ) = Irradiância (W / cm2) × Tempo (s) (equação 1).
      A irradiância pode ser modulada ajustando o dimmer do driver para obter 0.02 mW/cm2, 0.23 mW/cm2 ou 0.62 mW/cm2, respectivamente. A partir da irradiância escolhida, a equação 1 pode ser usada para calcular o tempo de iluminação necessário para atingir a dose de luz alvo.
    5. Uma vez atingida a dose de luz desejada, desligue o dispositivo. Recoloque a microplaca PDT em alumínio e devolva-a à incubadora com a placa de controle até que o teste de viabilidade seja realizado.
    6. OPCIONAL: Ilumine as outras placas, se necessário, usando o mesmo procedimento descrito acima.
  5. Ensaio de viabilidade celular
    1. Após o ensaio PDT, deixe a placa iluminada na incubadora por 24 h antes de medir o impacto da PDT nas células iluminadas, medindo sua viabilidade. O tempo de incubação pode ser variado para estudar os efeitos a longo prazo da PDT nas células. Para cada tempo de incubação pós-PDT, uma placa não iluminada (condição escura) deve ser incubada pelo mesmo período.
    2. Após o período de incubação, pegue uma placa iluminada e uma não iluminada e adicione 100 μL de reagente do kit de ensaio de viabilidade celular em cada poço para medir a viabilidade celular com base no metabolismo mitocondrial e na produção de ATP pelas células.
    3. Incube a multiplaca no escuro por 10 minutos antes da medição da viabilidade celular.
    4. Após 10 min de incubação, leia a luminescência emitida em cada poço usando um leitor multimodal. A luminescência emitida é proporcional à produção de ATP pelas células vivas no momento da adição da solução de ensaio de viabilidade celular.
    5. Considere o valor de luminescência da condição não tratada (NT) como 100% de viabilidade e normalize os valores de luminescência das condições tratadas para a condição NT para obter a porcentagem de viabilidade induzida por cada tratamento.
    6. Repita o mesmo protocolo de leitura de viabilidade celular para cada tempo de leitura pós-tratamento com PDT (por exemplo, 24 h, 48 h e 72 h pós-tratamento).

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conforme mostrado na Figura 3, o dispositivo CELL-LED-550/3 permite a iluminação homogênea, por baixo, de uma placa de 96 poços com luz verde de 550 nm.

figure-results-1
Figura 3: Fotos do dispositivo CELL-LED-550/3 durante uma iluminação ilustrativa de uma placa de 96 poços quando a luz ambiente é ligada (A) ou desligada (B). Adaptado de Lefebvre, A. et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Cada poço é iluminado individualmente e longe do LED único (até dois metros) por meio do uso de um feixe de fibras ópticas (Figura 4).

figure-results-2
Figura 4: O feixe de fibra óptica que permite a iluminação individual dos poços de uma placa de 96 poços longe do LED único. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Para estabelecer a eficácia do dispositivo CELL-LED-550/3, foi avaliada sua capacidade de induzir PDT mediada por RB na linhagem celular de hepatocarcinoma HepG2. As células foram tratadas com concentrações crescentes de Rosa Bengala, variando de 0-100 μM por 2 h antes da iluminação. O uso de tal faixa de concentrações visava determinar a dose efetiva (EC50) de Rosa Bengala que mataria as células HepG2 quando expostas à luz verde. O impacto da dose de luz fornecida pelo dispositivo CELL-LED-550/3 na indução de morte celular em células HepG2 também foi estudado. Para isso, as células foram expostas à luz por 8 min 9 s, 16 min 18 s ou 32 min 36 s na intensidade de 0,62 mW/cm2 para obter doses de luz de 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 e 1,22 J/cm2, respectivamente.

Primeiro, observou-se que a iluminação sozinha, na ausência de Rosa Bengala (condição de luz, Figura 5), não teve efeito sobre a viabilidade das células HepG2, independentemente da dose de luz recebida. Observou-se também que a Rosa-de-bengala isoladamente, na ausência de luz (condição RB, Figura 5), não induziu nenhuma alteração na viabilidade celular para nenhuma das condições testadas. Em contraste, os resultados mostram que a PDT mediada por RB usando CELL-LED-550/3 é capaz de matar células HepG2. Além disso, foi observado aumento da eficácia em correlação com o aumento da dose de luz, com uma concentração efetiva máxima (EC50) de 34,3 μM para uma dose de luz de 0,30 J/cm2, 26,6 μM para uma dose de 0,60 J/cm2 e 6,8 μM para uma dose de 1,2 J/cm2.

Esses resultados confirmaram a eficácia desse novo dispositivo de TFD para TFD mediada por RB (Figura 5).

figure-results-3
Figura 5: Eficácia do dispositivo em relação à viabilidade da linhagem HepG2. Porcentagem de viabilidade 24 h após o tratamento de HepG2. NT, não tratada; RB, apenas fotossensibilizador (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM e 100 μM); luz, iluminação para 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 e 1,22 J/cm2; PDT, iluminação com tratamento RB. Os resultados são apresentados como médias ± EPM de três experimentos independentes, expressos como uma porcentagem do NT. Foi realizado um teste ANOVA de duas vias, com p ≤ 0,01 (**); p ≤ 0,0001 (****) sendo considerado estatisticamente significativo, e p ≥ 0,05 considerado não significativo (NS). Adaptado de Lefebvre, A. et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve tanto o protocolo para desenvolver um dispositivo de iluminação inovador dedicado à TFD mediada por RB in vitro quanto o protocolo para implementar uma prova de conceito para o dispositivo CELL-LED-550/3, assim desenvolvido30.

O CELL-LED-550/3 consiste em duas partes, cada uma com uma função específica. O objetivo da primeira parte, denominada parte da fonte de luz, é gerar, a partir de um único LED, um feixe de luz verde homogêneo com diâmetro superior ao do feixe de fibra óptica da segunda parte. Esta última, chamada de parte distribuidora de luz, tem como objetivo distribuir, através do feixe de fibra óptica, a luz fornecida pela parte da fonte de luz para os poços de uma placa de 96 poços individualmente e longe do LED. A uma distância do LED de até 2,5 m, as células podem ser iluminadas pelo tempo que for necessário, sem qualquer risco de efeitos térmicos prejudiciais que possam surgir devido ao calor descontrolado gerado dentro do LED.

Esse recurso oferece uma primeira vantagem significativa do CELL-LED-550/3 sobre os outros sistemas baseados em LED projetados especificamente para iluminação de placas de 96 poços 31,32,33,34,35,36. De fato, todos os outros sistemas envolvem um posicionamento do(s) LED(s) apenas alguns centímetros abaixo das células (geralmente abaixo de 5 cm), o que é insuficiente para eliminar o risco de efeitos térmicos prejudiciais relacionados ao LED para as células. Para limitar esse risco, a maioria desses outros sistemas (infelizmente, alguns não) inclui um sistema de resfriamento LED 32,34,35 às vezes posicionado muito (muito) perto das células, que podem ser afetados de forma contraproducente pelas flutuações térmicas resultantes. O design do dispositivo CELL-LED-550/3 em duas partes oferece outra vantagem significativa sobre a maioria dos outros sistemas baseados em LED existentes 31,32,33,35,36: isso permite iluminar as células dentro de uma incubadora de cultura de células sem qualquer risco para o dispositivo. A parte do distribuidor de luz, que não inclui componentes eletrônicos, pode ser colocada dentro da incubadora, enquanto a parte da fonte de luz, que inclui componentes eletrônicos sensíveis a ambientes úmidos, é mantida do lado de fora para evitar o risco de corrosão ou falha. Alguns sistemas baseados em LED existentes, incluindo componentes eletrônicos, permitem uma iluminação dentro de uma incubadora, mas tal uso, em primeiro lugar, não é recomendado pelos projetistas/fabricantes e, em segundo lugar, requer uma secagem "adequada" após o uso33,34. A capacidade de iluminar as células dentro de uma incubadora e, assim, manter as células sob as mesmas condições fisiológicas (temperatura, umidade e concentração de CO2) durante o protocolo é crucial para evitar possíveis vieses na avaliação da viabilidade celular após a TFD, especialmente para protocolos que requerem longos tempos de iluminação. Também deve ser enfatizado que o dispositivo CELL-LED-550/3 inclui um único LED para iluminar todos os 96 poços individualmente e simultaneamente. Este recurso original e inovador não está disponível em nenhum dos outros sistemas baseados em LED mencionados acima 31,32,33,34,35,36. A maioria desses sistemas inclui 96 LEDs, com um LED colocado abaixo de cada poço e, portanto, fornece 96 feixes individuais 31,33,34,36 enquanto os sistemas restantes fornecem, de 6 a 25 LEDs posicionados a poucos centímetros da placa do poço, um feixe global cobrindo todo ou parte dos poços 31,32,35 . Com base na literatura, a geração de 96 feixes individuais a partir de um único LED, como o CELL-LED-550/3 faz através do uso de um feixe de fibra óptica, nunca foi proposta antes.

A parte da fonte de luz inclui um LED de 550 nm 3 W selecionado de acordo com dois critérios principais. Primeiro, o espectro de emissão do LED (e, portanto, seu comprimento de onda central) deve se sobrepor ao espectro de absorção do fotossensibilizador RB. Tal sobreposição, que é perfeitamente alcançada com o LED selecionado (comprimento de onda central: 554,4 nm; FWHM: 106,4 nm; ambos estimados seguindo a metodologia descrita em Lefebvre et al.30) (Figura 6), é essencial para a fotoativação do RB e, portanto, para a indução de uma PDT mediada por RB. Em segundo lugar, a potência óptica do LED deve ser inferior a 5 W. Esta limitação de potência é imposta pela potência admissível da lente colimadora incluída na parte da fonte de luz e pela do feixe de fibra óptica incluído na parte distribuidora de luz.

figure-discussion-1
Figura 6: Espectro de absorção de Rosa Bengala na água. O espectro de absorção maximamente normalizado de Rosa Bengala na água é plotado de acordo com o eixo esquerdo, e a irradiância espectral média de CELL-LED-550/3 é dimensionada de acordo com o eixo direito. O perfil da irradiância espectral média é consistente com o do LED disponível no site do fabricante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

O acoplamento óptico entre as duas partes do dispositivo é um fator crítico. Este acoplamento visa, por um lado, coletar o máximo da luz emitida pelo LED de 3 W em um feixe estreito e, por outro lado, injetar esse feixe no feixe de fibra óptica. Em relação ao primeiro objetivo, uma lente colimadora asférica com distância focal curta, projetada especificamente para LED montado em PCB (Placa de Circuito Impresso), permite a concentração do feixe de LED de 120 graus em um feixe estreito de 10 graus com distribuição espacialmente uniforme. Além disso, o feixe resultante projeta imagens do chip de LED quadrado, que exibem maior clareza e aberrações ópticas reduzidas em comparação com as obtidas com o feixe inicial. No que diz respeito à injeção desse feixe estreito no feixe de fibra óptica, quatro pontos importantes precisam ser abordados. Primeiro, as extremidades proximais das 96 fibras ópticas de PMMA (polimetilmetacrilato) de 0,5 mm de diâmetro (abertura numérica: 0,2) são reunidas em um conector caseiro para formar uma superfície quadrada receptiva à luz de lados de 5 mm (Figura 7). Uma forma quadrada, alinhada com as projeções quadradas do chip de LED pelo feixe, foi preferida à redonda usual para o conector, de modo a limitar a perda de luz. Em segundo lugar, o conector caseiro foi projetado para não exigir cola e impresso em 3D usando uma resina cristalina para limitar a absorção de luz e, assim, evitar o superaquecimento/carbonização do material. Em terceiro lugar, a superfície receptiva à luz, bem como a superfície final do conector, foram polidas com uma roda de polimento para que o máximo de luz passasse por elas. Em quarto e último lugar, a distância entre a lente e a superfície quadrada receptiva à luz foi teoricamente determinada e depois ajustada em uma bancada óptica para que a parte central mais homogênea da projeção quadrada do LED se sobreponha um pouco mais do que a superfície receptiva à luz.

Com esse acoplamento, obtém-se uma potência de 1,25 W para o feixe estreito de 10 graus, enquanto a potência total transmitida pelo feixe de 96 fibras ópticas é de 0,12 W (foi utilizado um sensor de fotodiodo adequado para luz LED (OPHIR)).

figure-discussion-2
Figura 7: Superfície quadrada receptiva à luz obtida reunindo as 96 fibras ópticas em um conector caseiro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

O CELL-LED-550/3 fornece uma irradiância média de 0,62 mW/cm2 (desvio padrão: 0,09 mW/cm2) (Figura 8) na superfície externa inferior dos poços. Esse valor médio, que leva em conta a eficiência de acoplamento acima mencionada, foi estimado e mostrou-se estável ao longo do tempo (coeficiente de variação inferior a 0,6%) de acordo com as metodologias descritas em detalhes em Lefebvre e al.30. Com uma irradiância tão baixa (menor do que as fornecidas pelos outros sistemas baseados em LED discutidos acima, projetados especificamente para iluminação de placas de 96 poços), a iluminação por si só provou não ter efeito na viabilidade da célula HepG2, enquanto uma eficiência muito alta foi alcançada para PDT mediada por RB. Para protocolos PDT que requerem irradiâncias mais altas para garantir a eficiência, vários LEDs podem ser usados e, portanto, várias partes da fonte de luz podem ser implementadas, desde que a potência da luz injetada em cada fibra óptica não exceda a potência admissível de algumas dezenas de miliwatts.

figure-discussion-3
Figura 8: Histograma representando a distribuição das irradiâncias entregues aos 96 poços de uma placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Substituir apenas o LED na parte da fonte de luz por outro adequado permite obter outro dispositivo CELL-LED. Um LED é considerado adequado se emitir uma potência óptica inferior a 5 W (pelos motivos mencionados acima) na faixa visível (de acordo com as especificações do feixe de fibra óptica). Como existe um número significativo desses LEDs, uma grande variedade de dispositivos CELL-LED pode ser desenvolvida e, assim, muitos protocolos PDT podem ser avaliados in vitro. Dado um protocolo PDT, o LED que fornece a melhor sobreposição com o espectro de absorção do fotossensibilizador considerado deve obviamente ser preferido entre todos os LEDs adequados. No caso de uma mudança de LED, atenção especial deve ser dada ao conjunto do dissipador de calor com ventilador. Na verdade, esse conjunto deve ser dimensionado adequadamente para evitar superaquecimento e subsequente degradação do LED e do driver. Além disso, uma nova caracterização óptica e térmica será necessária para qualquer mudança de LED.

Tanto a possibilidade de fotoativar a maioria dos fotossensibilizadores pela simples substituição de um único LED, quanto a possibilidade de iluminar as células dentro de uma incubadora fornecem um valor agregado real a este dispositivo em comparação com os existentes.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer ao Hospital Central de Lille, França, e ao INSERM por seu apoio ao nosso estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
550  nm 3  W LED montado em uma placa de circuito impressoOSRAMOSTAR KP CSLPM1. F1
75 cm2 Balão de culturaSarstedt3911002
Pacote de 100 fibras ópticas plásticas (0,5 mm de diâmetro)ARCENCIEL LEDem fibra05EGMExtremidade de Brilho PMMA 0,5 dia - Lng  200 m        http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
Contador de célulasThermoFisherAMQAF2000Opcional, você pode contar sob microscópio
Incubadora de cultura celularPHCI (Dutscher)MCO-170AICUVD-PE
Título de Célula GloPromegaG7571
Lente colimadora PMMA transparenteLoja GleccLente 14mm 10°Aliexpress - Lente colimadora DEL com suporte de 14 mm
Colorfab Ngen PretoColorfab  020014 de referênciaConformidade com o contato com alimentos da FDA
Colorfab Ngen BrancoColorfab  020013 de referênciaConformidade com o contato com alimentos da FDA
Driver de corrente com escurecimento de modo triplo (driver CDM)CDM DriverBD392200 mA
Resina epóxi Clé opatreDiamante de cristalCristal Diamante 150 mL
Conjunto do dissipador de calor com ventiladorBOYD
Células HepG2ATCCHB-8065
Leitor multimodal (CLARIOstar Plus)BMG Labtech430-2927
Solução tampão fosfatoThermoFisher20012-068
Fibras ópticas de PMMA (polimetilmetacrilato) (abertura numérica: 0,2)Iluminação de Guangzhou Mayki limitada
Tomada de alimentaçãoRSpro907-5680
RMPI 1640ThermoFisher21875-091
Interruptor basculante RSpro419-744
Rosa BengalaThermoFisher / MerckA17053.14 / 330000-1G
Folha de mylar à prova de arranhõesRSproRS: 785-0802
BainhaAUPROTECTØ 8,5 mm / Ø ext 11 mmPP Polipropílico e grave; ne bainha ondulada preta à prova de UV não dividida
SVFEurobioCVF SVF00-01
Papel vegetalCanson79368730
Placa de PMMA transparenteRSproRS: 284-6269
Azul de tripanoThermoFisher15250061
TripsinaThermoFisher25200-072
Ultimaker 2+Ultimaker
Placa de fundo transparente branco de 96 poçosDutscher655098

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primer. 7 (1), 1-28 (2021).
  3. Erstad, D. J., Tanabe, K. K. Hepatocellular carcinoma: Early-stage management challenges. J Hepatocell Carcinoma. 4, 81-92 (2017).
  4. Tabori, N. E., Sivananthan, G. Treatment options for early-stage hepatocellular carcinoma. Semin Intervent Radiol. 37 (5), 448-455 (2020).
  5. Tsuchiya, N., et al. Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 21 (37), 10573-10583 (2015).
  6. Puisieux, M. F., et al. Therapeutic management of advanced hepatocellular carcinoma: An updated review. Cancers. 14 (10), 2357(2022).
  7. Morton, C. A., et al. European dermatology forum guidelines on topical photodynamic therapy 2019 Part 1: treatment delivery and established indications - actinic keratoses, Bowen's disease and basal cell carcinomas. Eur Acad Dermatol Venereol. 33 (12), 2225-2238 (2019).
  8. Plaetzer, K., Krammer, B., Berlanda, J., Berr, F., Kiesslich, T. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: Fundamental aspects. Lasers Med Sci. 24 (2), 259-268 (2009).
  9. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: An update. CA Cancer J Clin. 61 (4), 250-281 (2011).
  10. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: Part two-cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2 (1), 1-23 (2005).
  11. Krammer, B. Vascular effects of photodynamic therapy. Anticancer Res. 21 (6B), 4271-4277 (2001).
  12. Falk-Mahapatra, R., Gollnick, S. O. Photodynamic therapy and immunity: An Update. Photochem Photobiol. 96 (3), 550-559 (2020).
  13. Mosaddad, S. A., et al. Photodynamic therapy in oral cancer: A narrative review. Photobiomodul Photomed Laser Surg. 41 (6), 248-264 (2023).
  14. Guidolin, K., et al. Photodynamic therapy for colorectal cancer: A systematic review of clinical research. Surg Innov. 29 (6), 788-803 (2022).
  15. Osuchowski, M., Bartusik-Aebisher, D., Osuchowski, F., Aebisher, D. Photodynamic therapy for prostate cancer - A narrative review. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102158(2021).
  16. Gustalik, J., Aebisher, D., Bartusik-Aebisher, D. Photodynamic therapy in breast cancer treatment. J Appl Biomed. 20 (3), 98-105 (2022).
  17. Domka, W., et al. Photodynamic therapy in brain cancer: mechanisms, clinical and preclinical studies and therapeutic challenges. Front Chem. 11, 1250621(2023).
  18. Crous, A., Abrahamse, H. Photodynamic therapy of lung cancer, where are we. Front Pharmacol. 13, 932098(2022).
  19. Calzavara-Pinton, P. G., et al. Methylaminolaevulinate-based photodynamic therapy of Bowen's disease and squamous cell carcinoma. Br J Dermato. 159 (1), 137-144 (2008).
  20. Basset-Seguin, N., et al. Topical methyl aminolaevulinate photodynamic therapy versus cryotherapy for superficial basal cell carcinoma: A 5 year randomized trial. Eur J Dermatol. 18 (5), 547-553 (2008).
  21. Szeimies, R. M., et al. A clinical study comparing methyl aminolevulinate photodynamic therapy and surgery in small superficial basal cell carcinoma (8-20 mm), with a 12-month follow-up. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22 (11), 1302-1311 (2008).
  22. The IMmunotherapy Pleural 5-ALA PDT. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04400539 (2025).
  23. Blue-Light Photodynamic Therapy and Sonidegib for Multiple Basal Cell Carcinomas. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT06623201 (2025).
  24. Neoadjuvant PDT in the Treatment of Cholangiocarcinoma. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04824742 (2025).
  25. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  26. Bartusik-Aebisher, D., Ożóg, Ł, Domka, W., Aebisher, D. Rose Bengal and future directions in larynx tumor photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 97 (6), 1445-1452 (2021).
  27. Srivastav, A. K., et al. Photosensitized rose Bengal-induced phototoxicity on human melanoma cell line under natural sunlight exposure. J Photochem Photobiol. B, Biology. 156, 87-99 (2016).
  28. Uddin, M. M. N., et al. Encapsulated Rose Bengal enhances the photodynamic treatment of triple-negative breast cancer cells. Molecules (Basel, Switzerland). 29 (2), 546(2024).
  29. Osuchowski, M., et al. Photodynamic therapy-adjunctive therapy in the treatment of prostate cancer. Diagnostics (Basel, Switzerland. 12 (5), 1113(2022).
  30. Lefebvre, A., et al. Photodynamic therapy using a Rose-Bengal photosensitizer for hepatocellular carcinoma treatment: Proposition for a novel green LED-based device for in vitro investigation. Biomedicines. 12 (9), 2120(2024).
  31. Bounds, A. D., Bailey, R. D., Adams, C. T., Callaghan, D. C., Girkin, J. M. LightBox: A multi-well plate illumination system for photoactive molecule characterization. J Biophotonics. 14 (5), e202000481(2021).
  32. Zhang, K., Timilsina, S., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An open-source LED array illumination system for automated multi-well plate cell culture photodynamic therapy experiments. Sci Rep. 12 (1), 1-10 (2022).
  33. optoWELL. , opto biolabs. at https://optobiolabs.com/products/optowell/ (2025).
  34. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 31 (10), 107737(2020).
  35. Hopkins, S. L., et al. An in vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochem Photobiol Sci. 15 (5), 644-653 (2016).
  36. Hadis, M. A., et al. Development and application of LED arrays for use in phototherapy research. J Biophotonics. 10 (11), 1514-1525 (2017).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Photodynamic TherapyRose BengalLED Illumination DeviceIn Vitro PDTHepG2 CellsCell Viability Assay96 Well PlatePhotosensitizer ApplicationGreen Light IrradiationCancer Cell Treatment

Artigos relacionados