Modelagem de infecção persistente por Pseudomonas aeruginosa em larvas de peixe-zebra feridas

Resumo

Atualmente, faltam modelos in vivo passíveis de triagem de medicamentos contra infecções bacterianas crônicas. Aqui, descrevemos um protocolo para infecção de ferida por um isolado clínico de Pseudomonas aeruginosa para gerar uma infecção persistente em larvas de peixe-zebra.

Resumo

Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno humano, particularmente em infecções crônicas de feridas e infecções pulmonares crônicas (especialmente em pacientes com fibrose cística (FC)). As infecções bacterianas crônicas são refratárias aos tratamentos com antibióticos e há uma necessidade urgente de modelos de infecção crônica in vivo passíveis de triagem de drogas para desenvolver terapias eficientes. Aqui, descrevemos um protocolo de infecção por um isolado clínico de P. aeruginosa de um paciente com FC, expressando constitutivamente a Proteína Fluorescente Verde (GFP), para gerar uma infecção persistente da ferida em larvas de peixe-zebra. Os embriões lesionados na barbatana caudal são imersos em uma suspensão bacteriana por 1,5 h, lavados e monitorados quanto à carga bacteriana por 3 dias. A carga bacteriana foi quantificada diariamente pela contagem de unidades formadoras de colônias fluorescentes (UFC) de larvas infectadas lisadas, o que permitiu uma infecção persistente. Além disso, a bactéria P. aeruginosa persistente foi refratária ao tratamento com antibióticos. Este novo modelo in vivo de infecção persistente por P. aeruginosa oferece oportunidades para avaliar a eficácia de tratamentos inovadores contra infecções crônicas.

Introdução

A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria patogênica Gram-negativa responsável pela colonização crônica em pacientes com fibrose cística (FC) e feridas ^1,2. P. aeruginosa pertence ao grupo de patógenos ESKAPEE e é reconhecida pela Organização Mundial da Saúde como uma prioridade crítica para novas terapêuticas³. As infecções bacterianas crônicas são difíceis de tratar com antibióticos devido à resistência adaptativa aos medicamentos, que está relacionada a múltiplos fatores, incluindo estilo de vida do biofilme, crescimento reduzido, baixa atividade metabólica⁴, bem como ciclo de vida intracelular⁵. Modelos in vivo são essenciais para melhor compreensão e tratamento da infecção crônica por P. aeruginosa.

Embora vários modelos in vivo tenham sido usados para avaliar a virulência de P. aeruginosa , muito poucos modelos permitiram mimetizar a colonização persistente e testar a eficácia dos tratamentos na infecção crônica⁶. Os modelos animais para estudar a patogênese crônica da P. aeruginosa dependem principalmente da administração da bactéria embutida em esferas de ágar nos pulmões⁷. Um modelo de infecção cutânea crônica murina também foi desenvolvido⁸. O peixe-zebra (Danio rerio), que tem inúmeras vantagens (questões éticas moderadas, baixo custo, alta produção de ovos), é um modelo de vertebrado in vivo atraente para testes de drogas, que também permite a visualização em tempo real de alta resolução de P. aeruginosa e células hospedeiras graças à transparência do embrião⁹.

Conforme relatado em uma revisão, em estudos anteriores, as cepas de laboratório de P. aeruginosa (PAO1, PA14 e PAK) foram usadas principalmente no modelo de infecção do peixe-zebra, onde causaram uma infecção aguda⁹. Recentemente, desenvolvemos um protocolo de infecção de ferida baseado na imersão de embriões amputados da nadadeira caudal com a cepa P . aeruginosa PAO1, que causou uma infecção aguda¹⁰. A infecção por imersão de embriões lesados, que reflete um modo natural de infecção de P. aeruginosa, é um modo de infecção reprodutível e mais fácil que a microinjeção.

Nosso objetivo foi estabelecer um protocolo de infecção persistente por P. aeruginosa em peixe-zebra. Para isso, nossa estratégia foi utilizar cepas clínicas de P. aeruginosa, que raramente foram consideradas no modelo zebrafish^11,12, combinadas com a via de infecção da ferida. Aqui, descrevemos o protocolo que desenvolvemos para modelar a colonização persistente de embriões de peixe-zebra com base em uma infecção de ferida por isolados clínicos de P. aeruginosa CF. Este novo modelo in vivo atende às nossas expectativas e oferece novas oportunidades para avaliar a eficácia da terapêutica no contexto da colonização persistente, conforme descrito aqui e em um artigo complementar¹³.

Protocolo

Todas as experiências com o peixe-zebra descritas no presente estudo foram conduzidas na Universidade de Montpellier, seguindo os princípios 3Rs -Substituição, Redução e Refinamento- de acordo com as diretrizes da União Europeia para o manuseamento de animais de laboratório e foram aprovadas pela Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault e pelo Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques sob a referência CEEA-LR-B4-172-37. Todos os experimentos de infecção foram realizados em embriões até 5 dias após a fertilização. A criação de peixe-zebra adulto (Danio rerio) a partir do peixe AB ou Golden Lines aderiu às diretrizes internacionais especificadas pela Diretiva de Proteção Animal da UE 2010/63/UE. Instalação de peixe-zebra da Universidade de Montpellier com condições padrão definidas como um ciclo claro: escuro de 12 h:12 h, tanque de policarbonato de 3,5 L (máximo de 22 peixes por tanque) conectado a um sistema de recirculação com 4% de salinidade/400 μS de condutividade e temperatura da água de 28 °C. Os peixes foram alimentados 2x por dia com ração para peixes.

1. Preparação das soluções

1. Prepare uma solução de trabalho 1x para água de peixe com ou sem azul de metileno para o crescimento de embriões de peixe-zebra (ver Tabela 1).
2. Prepare 20x estoque (0,4%) e 1x solução anestésica de tricaína de trabalho, conforme descrito na Tabela 1. Para evitar o congelamento e descongelamento repetidos da solução-mãe, prepare alíquotas de 10 mL de 20x Tricaína e armazene a -20 °C.
3. Prepare a solução de Triton a 2% diluída em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS; Tabela 1).

2. Preparação de inóculo de  P. aeruginosa fluorescente expressando GFP constitutivamente

NOTA: Todo o trabalho com P. aeruginosa é feito com as precauções BSL-2 em um gabinete de biossegurança. As cepas de P. aeruginosa devem ser geneticamente modificadas para expressar constitutivamente um repórter fluorescente, como GFP (como usado aqui e descrito em¹³). O uso de cepas com um repórter fluorescente codificado cromossomicamente é fortemente recomendado para evitar a perda de plasmídeo no caso de um repórter fluorescente codificado por plasmídeo.

1. Aos 2 dias antes da infecção, riscar a partir de -80 ° C um estoque de P. aeruginosa geneticamente modificada expressando GFP em placas de ágar LB (Tabela 1) e incubar durante a noite a 37 ° C.
2. Verifique a fluorescência das colônias usando um microscópio fluorescente (Ampliação 6x) para inocular uma colônia GFP⁺P. aeruginosa em 1 mL de caldo LB (Tabela 1) e cresça durante a noite a 37 °C com agitação (180 rpm).
3. No dia da infecção, dilua a cultura noturna de P. aeruginosa a 1:20 em 5 mL de caldo fresco LB. Cultivar as bactérias a 37 °C com agitação (180 rpm) até que a cultura atinja uma DO₆₀₀ = 0,8. Isso deve levar aproximadamente 2-3 h.
4. Centrifugar a cultura bacteriana durante 10 min à temperatura ambiente (RT) a 3584 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 4 mL de água de peixe sem azul de metileno.
5. Adaptar o volume de cultura com água de peixe para ter 7 x 10⁷ para 1 x 10⁸ UFC/ml. Isso corresponde a um OD₆₀₀ de aproximadamente 0,15 (a ser adaptado para cada cepa).
6. Para quantificar o inóculo, fazer uma diluição seriada da suspensão bacteriana, colocar 20 μL da diluição ^10-4 em uma placa de ágar LB e incubar durante a noite a 37 ° C.
7. Conte as colônias de GFP⁺ sob um microscópio fluorescente para determinar as UFCs do inóculo.

3. Colheita e preparação de embriões de peixe-zebra

1. Aos 3 dias antes do experimento de imersão bacteriana, estabeleça casais reprodutores de peixe-zebra. Coloque um macho e uma fêmea reprodutores em um tanque de cruzamento.
2. Na manhã seguinte, colete os óvulos após a fertilização usando uma peneira de malha fina. Coloque os ovos coletados em uma placa de Petri contendo água de peixe com azul de metileno.
3. Para evitar contaminação, adicione 1 gota de água sanitária à placa de Petri. Após 5 min, troque a água do peixe por azul de metileno para remover o alvejante.
4. Descarte os ovos com desenvolvimento embrionário anormal (os óvulos não fertilizados são semelhantes ao estágio de ovo de 1 célula) ou os mortos (aparência branca).
5. Na manhã da infecção (a 2 dpf), descorione os embriões com duas pinças muito finas sob o microscópio estéreo (aumento de 11x). Rasgue o córion usando uma pinça sem beliscar o embrião para liberá-lo.
6. Coloque os embriões descorionados em uma placa de Petri contendo peixes com azul de metileno. Incubar as placas a 28 °C até à infecção.

4. Lesão embrionária

1. Anestesiar embriões de peixe-zebra em água de peixe sem azul de metileno, contendo 0,02% de Tricaína, aproximadamente 5 min antes da lesão em uma placa de cultura de células (35 mm x 10 mm). Os embriões não se movem mais e não respondem a estímulos.
2. Coloque agulhas 25G no topo de dois pauzinhos para facilitar o manuseio das agulhas.
3. Sob um microscópio estereoscópico, elimine embriões com desenvolvimento anormal ou mortos. Usando um movimento circular do prato, reúna todos os embriões no centro.
4. Isole os embriões um a um usando duas agulhas na posição vertical (cabeça para baixo - cauda para cima) e coloque a agulha esquerda na cauda para mantê-la reta. Corte a barbatana na borda da notocorda com a agulha certa. Faça o corte de uma só vez. Não exceda 10 min entre o corte e a imersão na solução bacteriana.

5. Infecção de embriões feridos

1. Sob a cabine de segurança biológica tipo II, vórtice e adicione a solução de P. aeruginosa a aproximadamente 1 x 10⁷ UFC/mL a uma placa de 6 poços.
2. Colete os embriões feridos com uma pipeta de vidro Pasteur descartável e adicione-os à solução bacteriana sob o poste de segurança microbiológica. Incubar a placa a 28 °C durante 1,5 h.
   NOTA: Se for necessário um grande número de larvas infectadas, faça grupos de cerca de 50 larvas, faça a ferida, mergulhe-as e repita para o grupo seguinte.
3. Após a infecção, lave os embriões sob o posto de segurança microbiológica conforme descrito abaixo.
   1. Transfira os embriões com uma pipeta de vidro para lavagem em 10 mL de água de peixe sem azul de metileno, adicionando o mínimo de líquido possível, por 30 min em temperatura ambiente.
   2. Transfira os embriões infectados novamente usando uma pipeta de vidro para uma segunda lavagem em 4 mL de água de peixe sem azul de metileno por alguns minutos.
   3. Transferir 24 embriões infectados individualmente para uma placa de vários poços com 1 mL de água de peixe sem azul de metileno.
4. Coloque as placas em uma caixa de plástico na incubadora a 28 °C. Umidifique a caixa (com papel toalha úmido, por exemplo) para limitar a evaporação.

6. Sobrevivência de embriões infectados

1. Para estudos de sobrevivência embrionária, verifique a viabilidade sob um microscópio estéreo em 18 h, 24 h e 48 h pós-infecção (hpi). Um embrião é considerado morto quando o coração e a circulação sanguínea param.
2. Represente as taxas de mortalidade/sobrevivência usando representações gráficas de escadas de Kaplan-Meier (GraphPad Prism 8.3.0) e analise os dados com um log-rank ou outros testes estatísticos apropriados.

7. Contagem da carga bacteriana em embriões infectados (Figura 1)

1. Realize a determinação de UFC de embriões infectados em quatro pontos de tempo diferentes: 1,5 hpi, ou seja, diretamente após a infecção, e após cada lavagem em 24, 48 e 72 hpi com 5 embriões / ponto de tempo. Execute todas as etapas sob o poste de segurança microbiológica.
2. Prepare para cada larva infectada tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 95 μL de 1x PBS. O volume das larvas é de cerca de 5 μL.
3. Transfira as larvas para uma placa de 6 poços com 4 mL de água de peixe sem azul de metileno para realizar uma lavagem e eliminar as bactérias planctônicas.
4. Coloque cada embrião em um tubo de microcentrífuga contendo PBS, adicionando o mínimo de líquido possível. Basta tocar a pipeta de vidro contendo as larvas na superfície do PBS para permitir que as larvas afundem no tubo da microcentrífuga sem adicionar líquido.
5. Esmague os embriões individualmente usando um pilão na lateral do tubo da microcentrífuga. Mantenha o pilão dentro do tubo. Determine o ponto final quando não houver mais embrião intacto.
6. Levante o pilão e adicione 100 μL de PBS-Triton 2% para enxaguar qualquer bactéria residual do pilão (a concentração final é de 1%). Vórtice e aguarde 10 min. Não processe mais de cinco embriões ao mesmo tempo.
7. Colocar 3x, 10 μL de lisados não diluídos em placas de ágar LB para cada embrião. Faça uma diluição em série dos lisados em uma placa de 96 poços até que uma diluição ^{de 10-3} seja alcançada usando uma pipeta multicanal. Coloque 3x, 10 μL de diluição ^10-1, ^10-2 e ^10-3 ao lado dos não diluídos em placas de ágar LB e incube as placas durante a noite a 37 ° C.
8. Contar ao microscópio as colónias fluorescentes de cada diluição e calcular o UFC por embrião infectado.

Figura 1: Linha do tempo experimental para avaliar a virulência e persistência bacteriana em embrião de peixe-zebra. Abreviaturas: UFC = Unidades formadoras de colônias, hpi = horas pós-infecção. O desenho foi criado com BioRender.com. O número foi modificado de¹³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Testando o tratamento contra infecção persistente (Figura 2)

1. Prepare soluções antibióticas a 40x a concentração inibitória mínima (CIM) para a cepa de P. aeruginosa . Antes do experimento, verifique se a concentração escolhida de antibiótico não é tóxica para o embrião.
2. Siga as etapas 7.1 e 7.2. Coloque 1 mL de água de peixe com antibióticos em uma placa de 24 poços e faça um controle sem antibióticos.
3. Transfira cinco embriões da etapa de lavagem por tratamento para a placa de 24 poços, adicionando o mínimo de líquido possível.
4. Incubar com os antibióticos por 30 min em temperatura ambiente. Retorne à etapa 7.3. quantificar a carga bacteriana após o tratamento.

Figura 2: Procedimento experimental usado para avaliar a eficácia de tratamentos com antibióticos em embriões infectados. Abreviaturas: ATB 30' = tratamento com antibióticos por 30 min, UFC = unidades formadoras de colônias, hpi = horas após a infecção. O desenho foi criado com BioRender.com. O número foi modificado de¹³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Embrião de peixe-zebra é um modelo apropriado para monitorar uma infecção persistente por isolados de P. aeruginosa CF
Usamos o modo de imersão de embriões lesados para avaliar in vivo a virulência de três isolados de CF (A6520, B6513 e C6490)⁹. Também avaliamos o comportamento de um isolado de FC tardia bem caracterizado, RP73, conhecido por colonização de longo prazo em vias aéreas de camundongos^14,15

Discussão

A modelagem da infecção crônica bacteriana in vivo é essencial para entender a patogênese e avaliar a eficácia do tratamento. Aqui, estabelecemos um modelo de infecção persistente de feridas em peixe-zebra adequado para testar drogas contra P. aeruginosa. Isso preenche a lacuna da metodologia atual com a falta de modelos in vivo passíveis de triagem de medicamentos contra infecções bacterianas crônicas. Notavelmente, este modelo imita uma característica importa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meanossulfonato de etil-3-aminobenzoato	Sigma	E50521
Pellet de pistão	Eppendorf, Dutscher	33522
sais marinhos	Sistemas de aquário instantâneo para oceano	218035
Tritão	Euromedex	2000-B