Artigo de método

Ookluc: Uma linha de Plasmodium berghei para identificar compostos bloqueadores de transmissão

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DOI:

10.3791/68466

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11 de julho de 2025

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1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

Neste artigo

Resumo

O desenvolvimento sexual do Plasmodium ocorre no intestino médio do mosquito. Direcionar os estágios sexuais do parasita é uma estratégia promissora para bloquear a transmissão. Desenvolvemos o Ookluc, um P. berghei transgênico que expressa nanoluciferase após a formação do zigoto, permitindo a triagem de alto rendimento de compostos bloqueadores de transmissão. Este artigo detalha os métodos de triagem usando o Ookluc.

Resumo

A malária continua sendo um desafio de saúde mundial; Em 2023, 263 milhões de casos e 597.000 mortes foram relatados em todo o mundo. O ciclo de vida do parasita é complexo e intervenções direcionadas em estágios críticos de desenvolvimento são necessárias para controlar efetivamente a doença. As estratégias de bloqueio de transmissão (TB) visam interromper a transmissão do Plasmodium , visando o mosquito vetor ou os estágios sexuais do parasita por meio de vacinas e medicamentos. As intervenções de TB podem se concentrar em gametócitos no hospedeiro humano ou outras formas no intestino médio do mosquito, como gametas, zigotos, oocinetos e oocistos.

O desenvolvimento de novas abordagens de TB enfrenta desafios significativos. Estudar os estágios sexuais do parasita é inerentemente difícil, e a triagem de alto rendimento (HTS) para compostos gametocitocidas depende principalmente de culturas de P. falciparum . No entanto, ferramentas in vitro robustas para avaliar intervenções em estágios sexuais posteriores permanecem limitadas. Para acelerar a descoberta de compostos de TB, nosso grupo desenvolveu um novo ensaio HTS para ativação e fertilização de gametócitos usando P. berghei, um modelo murino de infecção por Plasmodium . O parasita transgênico, Ookluc, expressa nanoluciferase exclusivamente após a formação do zigoto, com pico de luminescência durante o desenvolvimento do oocineto. Este ensaio baseado em luminescência fornece uma leitura quantitativa da diferenciação de gameta para zigoto e zigoto para oocineto, onde o aumento da luminescência se correlaciona diretamente com a formação de oocineto. Este artigo em vídeo apresenta os métodos para triagem de compostos de tuberculose da malária usando Ookluc.

Introdução

A malária é uma doença antiga que moldou profundamente a história humana. Somente em 2023, 263 milhões de casos foram relatados em 85 países endêmicos, resultando em 597.000 mortes1. A doença é causada por parasitas protozoários do gênero Plasmodium, pertencentes ao filo Apicomplexa. Entre as cinco espécies que infectam humanos - P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale e P. malariae - P. falciparum e P. vivax são responsáveis pela maioria dos casos. O P. falciparum está associado à malária grave e é predominante na África, enquanto o P. vivax tem a distribuição geográfica mais ampla, sendo mais prevalente na América do Sul e na Ásia2.

A complexidade do ciclo de vida do Plasmodium , que envolve múltiplos estágios de desenvolvimento em dois hospedeiros, facilita sua transmissão e persistência em regiões endêmicas3. Uma etapa crítica neste ciclo é a transição dos humanos para o mosquito vetor, tornando-o um alvo importante para a intervenção. A transmissão começa dentro do hospedeiro humano, onde os estágios sexuais do Plasmodium se desenvolvem à medida que os merozoítos se diferenciam em gametócitos masculinos e femininos. Após a ingestão por um mosquito, os sinais ambientais desencadeiam a ativação dos gametócitos e a formação de gametas, levando à fertilização no lúmen do intestino médio. O zigoto resultante se diferencia em um oocineto móvel, que invade ativamente o epitélio do intestino médio e se desenvolve em um oocisto dentro da lâmina basal. Dentro do oocisto, milhares de esporozoítos são gerados e posteriormente liberados na hemolinfa, permitindo que migrem para as glândulas salivares. Lá, os esporozoítos invadem as células acinares e se deslocam para o lúmen da glândula, onde permanecem até que o mosquito faça sua próxima refeição de sangue, transmitindo o parasita para a pele humana4.

A busca por novas estratégias de bloqueio da transmissão (TB) é fundamental, dadas as limitações dos medicamentos disponíveis e a crescente resistência aos antimaláricos5. Os métodos tradicionais de triagem - como infecções por mosquitos, análise microscópica manual ou incorporação de hipoxantina radioativa - são trabalhosos, difíceis de padronizar e inadequados para aplicações de alto rendimento 6,7. Abordagens mais recentes usando detecção baseada em fluorescência (por exemplo, coloração de DNA ou repórteres GFP) melhoraram a eficiência, mas desafios significativos permanecem na avaliação de compostos que visam os estágios sexuais do parasita 6,7,8.

Para enfrentar esses desafios, uma linha transgênica de P. berghei expressando nanoluciferase (nLuc), denominada Ookluc, foi desenvolvida8. Nesse sistema, o gene nLuc é colocado sob o controle do promotor da proteína relacionada a circunsporozoítos e TRAP (CTRP) específica para oocinete, que é ativada em zigotos, levando à produção de nLuc começando aproximadamente 6 h após a ativação do gameta e atingindo o pico 24 h após o ensaio de conversão8. Esse design permite a quantificação automatizada e baseada em luminescência da viabilidade do parasita logo após a fertilização - eliminando a necessidade de manipulação direta do vetor - e facilita a triagem de alto rendimento de milhares de compostos8.

Embora a expressão de nLuc ocorra independentemente da viabilidade do oocineto, limitando a detecção de compostos que afetam especificamente estágios posteriores, como a morfogênese do oocineto, o Ookluc permanece altamente eficaz na identificação de compostos de TB que visam a gametogênese, a recombinação sexual ou a sobrevivência do parasita dentro do mosquito, incluindo agentes que induzem a produção de espécies reativas de oxigênio. Estudos anteriores validaram esse sistema identificando com sucesso compostos conhecidos por inibir os estágios sexuais do Plasmodium 9,10,11,12,13,14,15. Assim, o Ookluc representa uma plataforma robusta e inovadora para triagem de alto rendimento dos estágios sexuais do Plasmodium, facilitando a descoberta de novos compostos de TB e avançando nos esforços para a eliminação da malária nos próximos anos8. Este protocolo descreve a aplicação do sistema Ookluc para triagem de drogas e determinação da concentração inibitória de 50% (IC50).

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Protocolo

Todos os experimentos em animais foram conduzidos em estrita conformidade com as diretrizes éticas e foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (CEUA-ICB/USP). Os animais foram alojados e mantidos de acordo com as normas estabelecidas por este comitê. Experimentos envolvendo parasitas Plasmodium geneticamente modificados, bem como seu armazenamento criopreservado a -80 °C, foram conduzidos de acordo com as normas estabelecidas pelo Comitê Institucional de Biossegurança do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (CIBio-ICB/USP). Um total de três camundongos BALB/c fêmeas, com idades entre 3 e 5 semanas, foram usados neste estudo - dois infectados e um não infectado.

1. Materiais e reagentes

  1. Prepare o meio oocineto suplementando RPMI 1640 com HEPES 0,025 M, penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN), 50 mg / L de hipoxantina e 100 μM de ácido xanturênico. Ajuste o pH para 8,3 8,16.
  2. Preparar a solução de trabalho para o ensaio de luminescência misturando 1 volume de substrato com 50 volumes do tampão de lise fornecido no sistema de ensaio de luciferase.
  3. Defina uma incubadora para 21 °C.

2. Infecção e coleta de sangue parasitado

  1. Infecte duas fêmeas de camundongos BALB/c (4-6 semanas de idade) com 150 μL de cepa Ookluc criopreservada por meio de injeção intraperitoneal (IP) (Dia 0).
    NOTA: Neste protocolo, recomendamos o uso de camundongos BALB/c devido à sua pronta disponibilidade e uso generalizado em biotérios. No entanto, qualquer cepa de camundongo do tipo selvagem que seja suscetível à infecção por P. berghei e suporte à gametocitogênese deve ser adequada para uso.
  2. A partir do dia 3, avalie a parasitemia e a gametocitemia por meio do exame microscópico de esfregaços de sangue corados com Giemsa.
  3. Quando a parasitemia e a gametocitemia atingirem aproximadamente 5% e 0,5%, respectivamente (geralmente no dia 4), colete sangue por punção cardíaca usando seringas heparinizadas e agrupe o sangue de ambos os camundongos infectados.
    NOTA: Embora esta seja uma linhagem transgênica de P. berghei, seu perfil de crescimento e gametocitemia são semelhantes aos observados na cepa ANKA. Nesse contexto, a proporção de gametócitos em relação à parasitemia total é aproximadamente 10x menor.
    NOTA: Idealmente, a placa composta (veja abaixo) é preparada antes da coleta do sangue parasitado, de modo que o sangue é pipetado para a placa imediatamente após a coleta. Se o sangue de camundongo precisar ser coletado em uma sala diferente, ou não puder ser imediatamente pipetado para a placa composta por qualquer outro motivo, o sangue coletado deve ser mantido a 37 ° C por não mais de 30 min.

3. Ensaio de conversão - triagem em placas de 96 poços

NOTA: Para garantir resultados consistentes, todo o experimento deve ser repetido três vezes em dias diferentes para confirmar os resultados.

  1. Preparar as amostras compostas utilizando o meio oocineto como diluente (uma concentração final de 10 μM). Diluir o composto a 1 mM e preparar amostras de trabalho diluindo o estoque de 1 mM 1:100 v:v em meio Ookinete. Para um ensaio em duplicado, preparar um volume final de 200 μl de amostra de trabalho.
  2. Se o composto for diluído num solvente que não seja água, incluir uma amostra de controlo que contenha o solvente diluído em meio oocineto na mesma proporção que na amostra de ensaio, a fim de garantir que qualquer inibição observada é atribuível ao composto e não ao solvente.
    NOTA: Como exemplo, examinaremos 90 compostos.
  3. Usando duas placas de 96 poços, coloque 80 μL das amostras em cada poço, conforme a seguir e ilustrado na Figura 1, em duplicata (duas placas): Controle positivo: 80 μL de meio oocineto; Controle negativo: 80 μL de meio oocineto; Controle de solventes: 80 μL de meio oocineto com 1% de DMSO; Amostras: 80 μL de 10 μM de cada composto em meio oocineto.

figure-protocol-1
Figura 1: Representação esquemática de um layout de placa de 96 poços projetado para triagem composta. O layout da placa inclui controle positivo (C+), controle negativo (C-), controle mais solvente de diluição (C+S) e 90 compostos de teste (S1-S90). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Adicione 4 μL de sangue de camundongo parasitado a cada poço da placa de 96 poços na proporção de 1:20 v:v, exceto para o controle negativo (C-). Homogeneizar suavemente por pipetagem.
    NOTA: Considerando as perdas, calculamos a necessidade de ~400 μL de sangue parasitado para cada placa.
  2. Para o controle negativo, adicione sangue de camundongo não infectado na proporção de 1:20 (v: v, sangue: amostra). Homogeneizar suavemente.
  3. Incubar a 21 °C durante 6 h ou 24 h.
    NOTA: A atividade do nLuc é detectável com 6 h de incubação e atinge o pico às 24 h do ensaio8. O ensaio não é capaz de identificar compostos com atividade após a formação do zigoto, como compostos que inibem a morfogênese do oocineto, porque os zigotos formados acumulam nLuc independentemente de completar a morfogênese. Portanto, a incubação de 6 h é suficiente para detectar todos os compostos que bloquearão a atividade do nLuc inibindo a gametogênese, a recombinação sexual ou a citotoxicidade precoce. No entanto, normalmente favorecemos incubações de 24 h para ter sinais mais fortes e melhor relação sinal-ruído.

4. Ensaio de luminescência

  1. Após o período de incubação, homogeneizar as amostras pipetando para cima e para baixo para garantir uma mistura completa do meio sanguíneo.
  2. Prepare a mistura de tampão de lise/substrato de luciferase imediatamente antes de usar na proporção de 1:50 (v:v, substrato:tampão de lise).
  3. Misture a mistura de substrato com amostras na proporção de 1:1 (v:v), garantindo uma mistura suave para evitar bolhas. Incubar a 37 °C durante 3-5 min.
    NOTA: Neste exemplo, adicionamos 84 μL de substrato: tampão de lise a cada poço.
  4. Transfira as amostras para uma placa branca de fundo plano de 96 poços. Meça a luminescência usando um leitor de placas. Use a seguinte configuração de parâmetros: filtro de emissão: lente; tempo do intervalo de medição: 1 s por poço.

5. Análise de dados - rastreio

  1. Após o ensaio de luminescência, anote os dados brutos que aparecem (Figura 2).
    NOTA: As Unidades de Luz Relativa (RLU) obtidas dependem do luminômetro usado. Em nosso caso, os valores de RLU para o controle positivo variaram de 10.000 a 500.000 em um ensaio de incubação de 24 horas. Tempos de incubação mais curtos (6 h) resultarão em valores de RLU mais baixos.

figure-protocol-2
Figura 2: Resultados obtidos a partir de uma leitura simulada de um ensaio de conversão para triagem de compostos. A imagem exibe leituras de luminescência simuladas de um ensaio realizado após a conversão de oocinetos na presença de um painel de 90 compostos. Valores mais baixos da Unidade de Luz Relativa indicam formação reduzida de ookinete. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Usando uma planilha, calcule a média de cada medida usando a fórmula abaixo. Substitua XX pelo endereço da primeira célula de medição e YY pelo endereço da segunda célula de medição. Repita a fórmula para todas as amostras.
    =(MÉDIA(XX:AA)
  2. Converta os dados em % de inibição para uma melhor análise dos resultados. Na planilha, use a fórmula abaixo. Substitua A pelo valor de RLU de amostra e B pelo valor de RLU de controle. Repetir a fórmula para todos os compostos testados:
    = 1 - (A/B) x 100
    NOTA: Os dados aparecerão conforme mostrado na Figura 3.

figure-protocol-3
Figura 3: Resultados obtidos a partir de uma leitura simulada de um ensaio de conversão para triagem de compostos representados como % de inibição para cada composto. Percentagem de inibição da conversão para cada composto ensaiado, calculada como acima descrito. Os quadrados destacados indicam compostos que promovem mais de 95% de inibição da conversão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Identifique os compostos que apresentam mais de 95% de inibição.
    NOTA: Esses compostos exibem alta atividade contra os estágios sexuais na concentração de 10 μM. Em nosso exemplo, encontramos cinco compostos com alta atividade contra os estágios sexuais.
  2. Para os compostos identificados, efectuar uma determinação IC50 conforme descrito a seguir.

6. Ensaio de conversão - determinação do IC 50

  1. Infectar camundongos com Ookluc e coletar sangue parasitado, conforme descrito na seção 2.
  2. Preparar as amostras utilizando o meio ookinete como diluente. Utilizar uma concentração inicial na qual se observe 100% de inibição da conversão pelo composto.
    NOTA: Como os compostos ativos foram identificados em uma tela com concentração de 10 μM, usamos 20 μM como concentração inicial para a primeira curva dose-resposta. Para uma curva dose-resposta precisa, é importante que seu ensaio inclua concentrações iniciais que resultem em 100% de inibição da conversão e concentrações finais que levem a 0% de inibição. Essa abordagem garante um cálculo preciso do IC50 . A primeira curva dose-resposta informará as concentrações mais baixas do composto com ~ 100% de inibição. Neste protocolo, usaremos o PyAz90, recentemente identificado usando o Ookluc13, como exemplo.
  3. Em uma placa de 96 poços, adicione triplicata (ver Figura 4): Controle positivo (C+): 80 μL de meio oocineto; Controle negativo (C-): 80 μL de meio oocineto; Primeira diluição da amostra (Cpd D1): 160 μL de composto em uma concentração inicial em meio oocineto que resulta em 100% de inibição da conversão; Poços D2 a D12: 80 μL de meio oocineto.
  4. Faça diluições seriais duplas pipetando 80 μL do poço D1 em D2, homogeneize e pipete 80 μL do poço D2 em D3 e assim por diante. Certifique-se de que todos os poços tenham 80 μL de volume total, portanto, descarte os últimos 80 μL removidos do poço D12.
    NOTA: Realize o experimento com pelo menos três réplicas para todas as amostras, conforme indicado na Figura 4. Para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade de seus resultados, todo o experimento deve ser repetido em três dias separados usando animais recém-infectados a cada vez.
    NOTA: Se na primeira tela, os resultados não mostrarem impacto do solvente na conversão, não é necessário incluir esses controles em diluições seriadas. Caso contrário, devem também ser incluídas diluições em série do solvente.

figure-protocol-4
Figura 4: Layout de placa de 96 poços projetado para determinação do composto IC50 . O layout da placa inclui diluições de controle positivo (C+), controle negativo (C-) e composto (Cpd) (D1 a D12). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Adicione sangue de camundongo parasitado à placa de 96 poços a 1:20 v:v. Homogeneizar suavemente por pipetagem.
    NOTA: Um total de 4 μL de sangue parasitado será adicionado a cada poço, exceto ao controle negativo (C-). Considerando as perdas, calculamos a necessidade de ~200 μL de sangue parasitado para cada composto a ser testado.
  2. Em poços de controle negativo, adicione sangue de camundongo não infectado na proporção de 1:20 (v: v, sangue: amostra). Homogeneizar suavemente.
  3. Incubar a 21 °C durante 6 h ou 24 h.
  4. Efectuar o ensaio de luminescência, conforme descrito no ponto 4.

7. Análise dos dados - determinação do IC 50

NOTA: IC50 é definido como a concentração de um composto necessária para inibir 50% da atividade/inibição biológica. Neste ensaio, a inibição refere-se à redução na conversão de oocineto. Os dados são representados como uma curva de dose-resposta sigmoidal, onde o eixo X representa a concentração do composto (transformada em log) e o eixo Y representa % de inibição.

  1. Calcule a % de inibição conforme descrito na etapa 5.3 da seção 5.
  2. Abra o software e crie uma tabela XY.
  3. Defina as opções do eixo Y como Insira 3 valores de replicação em subcolunas lado a lado.
  4. Cole os dados, com X representando a concentração do composto e Y representando % de inibição (Figura 5A).
  5. Na barra de menus, clique em Analisar e selecione Regressão não linear (ajuste da curva) e, em seguida, Curvas dose-resposta - Inibição e [inibidor] vs. resposta normalizada -- inclinação variável; clique em OK.
  6. No painel esquerdo, observe a curva dose-resposta dos dados. Aplique a personalização desejada, como alterações de cores e formatos de ponto.
  7. Localize a tabela de ajuste de Nonlin para encontrar o ICcalculado 50 e o intervalo de confiança de 95% (IC de 95%) (Figura 5B).

figure-protocol-5
Figura 5: Curva dose-resposta de PyAz90. A % de inibição foi medida em função da concentração de PyAz90 (μM) em escala logarítmica. A curva sigmoidal representa os dados ajustados utilizados para determinar o IC50, que foi de 0,013 μM (intervalo de confiança de 95%: 0,012-0,014 μM). Os pontos de dados representam a média ± o erro padrão da média das réplicas experimentais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

A geração de parasitas Ookluc permite a avaliação de novos candidatos a medicamentos para TB a partir de uma perspectiva não oferecida pelos ensaios existentes, particularmente na avaliação dos efeitos dos compostos na ativação de gametas, fertilização e formação de zigotos8. A Figura 2 e a Figura 3 ilustram a capacidade do método de rastrear um painel de composto...

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Discussão

A maioria dos métodos HTS usados para desenvolver novos compostos de TB se concentra na inibição da gametocitogênese ou na atividade gametocitocida. Até o momento, apenas dois modelos de P. berghei foram desenvolvidos que permitem avaliar a função dos gametócitos, gametogênese, formação de zigoto e morfogênese oocineta5.

Um desses modelos é semelhante ao Ookluc, pois utiliza um repórter de fluorescência ligado ao promo...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) e do Instituto Serrapilheira (processo G-1709-16618).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GraphPad Prism versão 10.0.0 para WindowsGraphPad Software, Boston, Massachusetts, EUA
Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suínaSigma-AldrichH3393
HEPES (1 M)Thermo Científico15630106
HipoxantinaSigma-AldrichH9636
Mouses------Camundongos BALB/c fêmeas, com idade entre 3 e 5 semanas
Sistema de ensaio de luciferase Nano-GloPromegaN1110
Penicilina & menos; Estreptomicina &menos; Solução de neomicina estabilizadaSigma-AldrichPág. 4083
Leitor de Microplacas POLARStar OmegaBMG Labtech----
RPMI 1640 Médio, Suplemento GlutaMAXThermo Científico61870036
Ácido xanturênicoSigma-AldrichD120804

Referências

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