Dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único

Resumo

Este artigo fornece um protocolo simplificado para a dissecção e dissociação do epitélio olfatório murino para fins de sequenciamento de RNA de núcleo único.

Resumo

O epitélio olfatório murino é o ponto de entrada inicial do sistema olfatório, abrigando vários tipos de células que incluem neurônios sensoriais olfativos, seus progenitores regeneradores e células de suporte. Os neurônios sensoriais olfativos transduzem odores químicos em sinais neurais, mas os mecanismos subjacentes a como essas células se desenvolvem e giram, criam sinapses com o bulbo olfatório e regulam seus receptores de odor permanecem áreas de intenso estudo. Localizado na face dorsal da cavidade nasal, o epitélio olfatório adere a intrincadas estruturas ósseas conhecidas como cornetos. Essa anatomia apresenta desafios únicos para sua extração e dissociação, especialmente no contexto da preparação de suspensões unicelulares viáveis. Como os protocolos de suspensão de célula única geralmente envolvem etapas preparatórias (por exemplo, dissociação de papaína, FACS) que podem estressar a viabilidade celular e/ou atrasar a preparação da biblioteca, minimizar o tempo de extração do tecido é crucial. Este artigo apresenta um método simplificado para a dissecção rápida do epitélio olfatório e um protocolo para gerar suspensões uninucleares de alta qualidade.

Introdução

O epitélio olfatório murino (OE) é um componente essencial do sistema olfatório e é responsável por detectar e transduzir sinais de odor para o sistema nervoso central. Sua camada mais superficial contém os cílios detectores de odor dos neurônios sensoriais olfatórios, que são recobertos por uma camada de mucosa e circundados pelas células sustentaculares e microvilares^{de suporte 1,2}. Os OSNs são bipolares, estendendo seus cílios apicalmente para formar uma rede dentro da camada de muco e seus axônios basalmente através da placa cribriforme óssea para coalescer em glomérulos dentro do bulbo olfatório. Esses glomérulos são o local das sinapses entre os OSNs e os neurônios a jusante. Subjacentes aos OSNs, as células progenitoras neuronais chamadas células basais globosas reabastecem constantemente os OSNs à medida que morrem³ após exposição direta a insultos ambientais, como toxinas transportadas pelo ar, patógenos e traumas físicos. As células basais globosas são derivadas de um pool de reserva de células basais horizontais multipotentes ^4,5, localizadas mais basalmente e aderentes à lâmina basal de protuberâncias ósseas chamadas cornetos nasais. Os cornetos nasais são tortuosos, tornando o OE difícil de separar e homogeneizar. Além disso, o OE é cercado por ossos do crânio, dificultando o acesso à área e tradicionalmente exigindo um procedimento demorado.

Estudos anteriores contaram com uma incubação prolongada de papaína para liberar o epitélio olfatório do osso 6,7,8,9,10, o que pode atrasar ainda mais o processamento a jusante da suspensão unicelular. Como o cisalhamento dos axônios OSN desencadeia a apoptose¹¹, é imperativo minimizar a quantidade de tempo desde a extração do tecido até a preparação da biblioteca de cDNA. Além disso, a arquitetura do OE e suas projeções para o bulbo olfatório complicam a extração de células intactas para o sequenciamento bem-sucedido de RNA de célula única. Felizmente, o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) emergiu como uma ferramenta poderosa para traçar o perfil das células, preservando a distribuição do tipo de célula, particularmente em tecidos onde a dissociação de uma única célula é difícil ou impraticável^12,13.

Embora vários estudos 6,7,8,10,14,15 tenham realizado o sequenciamento de célula única do OE de camundongo, nenhum oferece um procedimento de dissecção detalhado otimizado para coleta de tecido consistente e conveniente, o que é necessário dada a fragilidade do OE e o invólucro por vários ossos do crânio. Além disso, os guias de dissecção existentes¹⁶ estão focados em preservar a estrutura anatômica em vez da velocidade, levando a tempos de dissecção potencialmente longos. Como a preparação rápida do tecido é essencial para minimizar a degradação do RNA e maximizar a qualidade dos núcleos preparados^17,18, é necessário um protocolo otimizado para a rápida dissecção e homogeneização do OE murino em uma suspensão de núcleo único para uso em várias aplicações a jusante.

Este protocolo (Figura 1) apresenta um método simplificado projetado para superar esses desafios, permitindo a rápida dissecção do OE murino e a dissociação eficiente do tecido com o objetivo de isolar os núcleos. Essa abordagem facilita o sequenciamento de núcleo único de alta qualidade¹⁹, fornecendo uma técnica confiável para investigar os fundamentos moleculares da biologia olfativa.

Figura 1: Anatomia das suturas e ossos relevantes do crânio de camundongo C57BL / 6 e seção transversal representativa do epitélio olfatório. (A) As suturas do crânio são codificadas por cores. As suturas são codificadas por cores em um lado do crânio, enquanto o outro lado é deixado sem marcação para referência (esquerda). Os nomes das suturas são codificados por cores de acordo (à direita). (B) Ossos do crânio codificados por cores. Os ossos são codificados por cores em um lado do crânio, enquanto o outro lado é deixado sem marcação para referência (esquerda). Nomes dos ossos codificados por cores de acordo (à direita). (C) Seção transversal da porção central do OE (dissecada usando o método descrito neste artigo) com cornetos codificados por cores em um lado e a esquerda não marcada para referência (esquerda). Nomes dos cornetos visualizados (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados e conduzidos em conformidade com o Baylor College of Medicine IACUC. Foram utilizados camundongos fêmeas C57BL/6J (JAX:000664). Os detalhes dos reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Dissecção do epitélio olfatório

1. Comece anestesiando profundamente o mouse usando qualquer método preferido (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Confirme o plano cirúrgico da anestesia com pinça firme do dedo do pé e prossiga com a perfusão transcardíaca de pelo menos 10 mL de PBS 1x gelado. Remova a pele para expor o crânio (Figura 2A).
   NOTA: A remoção da cabeça do corpo é opcional. Se alguém decidir remover a cabeça, recomenda-se remover a pele e outros tecidos moles ao redor do crânio antes da decapitação.
2. Usando uma tesoura fina e de ponta afiada, faça duas incisões para quebrar os arcos zigomáticos do osso esquamosal bilateralmente, colocando uma ponta de tesoura na órbita posterior e a outra adjacente ao canal auditivo (linhas verdes na Figura 2B).
3. Faça uma incisão rasa de órbita a órbita ao longo do aspecto mais anterior do osso frontal. Incise apenas a superfície dorsal do osso frontal (~ 1-2 mm de profundidade), tomando cuidado para não cortar nenhuma estrutura ou osso subjacente que componha a órbita (linha azul na Figura 2B).
   NOTA: Para obter uma incisão rasa entre as órbitas, segure a tesoura perpendicularmente ao crânio e use apenas as pontas afiadas para cortar.
4. Corte ao longo da linha média do crânio a partir do forame magno, através das suturas sagital e interfrontal, até atingir a incisão interorbital feita no osso frontal no passo 1.3 (linha vermelha na Figura 2B).
5. Insira um par de pinças na incisão feita ao longo da linha média do crânio e puxe firmemente um hemisfério da abóbada craniana lateralmente. Essa ação também removerá os ossos da órbita (frontal, maxilar e lacrimal), expondo os aspectos laterais dos cornetos olfatórios (Figura 2D).
   NOTA: Tome cuidado para não danificar inadvertidamente o OE a partir deste ponto.
6. Segurando o osso nasal e os dentes incisivos, quebre a abóbada craniana contralateral usando uma pinça. Permita que o cérebro (incluindo os bulbos olfatórios) seja removido com o hemisfério ósseo à medida que é arrancado (Figura 1E). As únicas estruturas ósseas visíveis que devem permanecer após esta etapa são a base do crânio e os ossos ao redor do OE (Figura 2F).
7. Usando um par de pinças ósseas ou rongeurs, remova qualquer osso frontal remanescente e osso pré-maxilar (incisivo) até a base dos dentes incisivos (Figura 2G).
8. Use pinças ósseas para cortar ao longo da sutura frontonasal para liberar o osso nasal da placa cribriforme, tomando muito cuidado para não danificar o OE exposto subjacente ou fraturar a placa cribriforme.
9. Levante o osso nasal da placa cribriforme usando uma pinça para expor o OE (Figura 2H). Se o osso pré-maxilar residual obscurecer o OE dorsal, remova-o antes de prosseguir (círculos pretos na Figura 1I).
10. Usando uma pinça de ponta fina, prenda suavemente a face dorsal do septo nasal em sua junção com a placa cribriforme e puxe posteriormente (Figura 2J,K). Com resistência mínima, o epitélio olfatório principal se soltará como uma estrutura totalmente intacta (Figura 2L).
11. Prossiga imediatamente com a dissociação OE ou congele o tecido para processamento posterior.

Figura 2: Técnica para dissecção rápida do epitélio olfatório. (A) A cabeça do rato após a remoção do tecido mole circundante. (B) Guias codificadas por cores para incisões na abóbada craniana. (C) Aparência após incisões na abóbada craniana. (D) Remoção do primeiro hemisfério da abóbada craniana junto com a porção da órbita adjacente ao epitélio olfatório. (E) Remoção da porção contralateral da abóbada craniana junto com o cérebro. (F) A cabeça após a remoção do cérebro e da abóbada craniana. (G) Remoção do osso frontal mais anterior e da pré-maxila posterior, após a incisão na sutura frontomaxilar. (H) Remoção dos ossos nasais. (I) Os círculos pretos destacam áreas de osso pré-maxilar residual que podem ser removidas opcionalmente. (J) Colocação de fórceps para remoção do epitélio olfatório intacto. (K) Puxe posteriormente para liberar o epitélio olfatório. (L) Liberação total do epitélio olfatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Dissociação do epitélio olfatório e isolamento de núcleo único

1. Coloque um tubo C e dois tubos cônicos de 15 mL por amostra no gelo.
2. Prepare o tampão de lise adicionando inibidor de RNAse (a uma concentração final de 0,2 U / μL) ao tampão de extração de núcleos pré-fabricados.
3. Adicione 4 mL de BSA a 1% a cada tubo cônico de 15 mL, vórtice brevemente e descarte o excesso. Isso reveste cada um dos tubos cônicos de 15 mL com BSA para minimizar a adesão dos núcleos ao tubo.
4. Para um OE inteiro, adicione 2 mL de tampão de lise gelada a cada tubo C.
5. Adicione amostras OE aos tubos C. Usando uma pinça # 2, segure cada amostra sobre seu respectivo tubo C e corte-a em pedaços pequenos usando uma tesoura de ponta fina.
6. Coloque os tubos C contendo cada amostra de cabeça para baixo nos blocos dissociadores de tecidos automatizados. Na tela do dissociador, o quadrado correspondente a cada bloco mudará de Livre para Selecionado.
7. Pressione o ícone da pasta para alternar para a pasta Miltenyi . Usando as setas, role até o programa 4C_nuclei_1 (um programa pré-carregado dentro do dissociador). Pressione OK para aplicar o programa a cada bloco e, em seguida, pressione Iniciar para iniciar o ciclo. Remova os tubos C do dissociador imediatamente após a conclusão do ciclo.
   NOTA: Se possível, mantenha os tubos C gelados durante o ciclo de dissociação. É importante remover as amostras do dissociador imediatamente após a conclusão do ciclo e prosseguir com as próximas etapas do protocolo para evitar a super-lise dos núcleos.
8. Com uma pipeta, aspirar a suspensão homogeneizada do tubo C e filtrá-la através de um filtro de 70 μm para o primeiro tubo cónico revestido com BSA. Evite aspirar os fragmentos ósseos que se acumularam na parte inferior do tubo C.
9. Enxágue o filtro com 1 mL de 1x PBS gelado para garantir a filtragem completa.
10. Centrifugar a suspensão filtrada a 500 × g durante 5 min a 4 °C numa centrifugadora de balde oscilante.
11. Aspire e descarte suavemente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Ressuspenda completamente o pellet de núcleos em 1 mL de 1x PBS gelado por pipetagem suave.
12. Passe os núcleos ressuspensos através de um filtro de 30 μm para o segundo tubo cônico revestido com BSA. A concentração de núcleos pode ser quantificada usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
13. Prossiga imediatamente com o protocolo downstream escolhido (com ou sem FACS) para preservar a integridade da amostra e evitar a degradação (Figura 3).
    NOTA: É altamente recomendável que os usuários realizem execuções práticas de todo esse protocolo para garantir uma conclusão perfeita e oportuna.

Figura 3: Dissociação do epitélio olfatório e fluxo de trabalho de isolamento de núcleo único. Após a dissecção, o epitélio olfatório é mecanicamente e quimicamente dissociado. O lisado é então filtrado através de um filtro de 70 μm, enxaguado com 1x PBS e centrifugado a 500 × g por 5 min. O pellet é ressuspenso em 1x PBS antes de ser filtrado através de um filtro de 30 μm. A suspensão de núcleos resultante está disponível para várias aplicações de sequenciamento a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Para fornecer contexto anatômico para dissecção e análise, as suturas e ossos do crânio de camundongo C57BL/6, bem como a porção central do epitélio olfatório (OE), foram visualizados e codificados por cores (Figura 1). Um lado de cada imagem foi anotado para destacar suturas, ossos e cornetos relevantes, enquanto o outro lado foi deixado sem marcação para referência. A seção transversal do OE foi preparada seguindo protocolos estabelecidos²⁰, e a identificação dos co...

Discussão

O procedimento descrito aqui permite a remoção consistente de um OE intacto após perfusão intracardíaca 1x PBS. Isso representa uma melhora notável na velocidade em comparação com os métodos anteriores¹⁶ e é de particular importância, uma vez que os OSNs começam a degenerar após a axotomia², o que acontece durante a remoção do cérebro.

A remoção cuidadosa dos ossos frontal, pré-maxilar e nasal é crucial para a ex...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de centrífuga de 15 mL	Tratamento de células	229411
Alicate de Osso	Ferramentas de Belas Ciências	16102-11
Tesoura de Íris Miniatura Bonn	Miltex	18-1392
Solução de albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	Resposta A1595
Fórceps Dumont #3	Ferramentas de Belas Ciências	11231-30
Camundongos C57BL/6J fêmeas	O Laboratório Jackson	JAX:000664
Tubos C gentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Biotec	130-096-427
MACS SmartStrainers 30 um	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers 70 um	Miltenyi Biotec	130-098-462
Micro Friedman-Pearson Rongeurs	Ferramentas de Belas Ciências	16220-14
Tampão de Extração de Núcleos	Miltenyi Biotec	130-128-024
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x sem cálcio e magnésio, PH 7,4 ± 0.1	Corning	21-040-CV
Inibidor de RNAse Protetora	Millipore Sigma	3335402001
Centrífuga Refrigerada Sorvall Legend XTR	Thermo Científico	50119927-5