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Artigo de método

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

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DOI:

10.3791/68482

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15 de julho de 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

Aqui, fornecemos uma metodologia detalhada para isolar a retina do olho do camundongo para experimentação ex vivo estendida. Este protocolo enfatiza tornar essa abordagem tecnicamente exigente acessível para pesquisadores que gostariam de aproveitar os caminhos de pesquisa oferecidos pela manutenção da glia retiniana in situ em tecido vivo.

Resumo

O papel da glia no glaucoma é um tópico de pesquisa cada vez mais proeminente, mas ainda não se sabe muito sobre como as populações dessas células de suporte - ou seja, astrócitos e microglia - influenciam a sobrevivência das células ganglionares da retina. Embora os modelos in vivo e in vitro forneçam um grau de percepção, ambas as abordagens têm limitações significativas, como o impacto da resposta imune periférica no primeiro e as alterações na função fisiológica induzidas pelo isolamento e cultura celular no caso do segundo. Para minimizar esses fatores de confusão, desenvolvemos um sistema de explante retiniano ex vivo no qual astrócitos, microglia e outros tipos de células da retina podem ser mantidos in situ por períodos de pelo menos 3 dias, permitindo uma investigação direcionada a um rendimento mais alto do que normalmente é viável com modelos in vivo . Crucialmente, essa abordagem é altamente receptiva a metodologias que seriam desafiadoras ou inviáveis em um animal vivo, mas permanece compatível com ensaios comuns a jusante de tecido nervoso intacto. Aqui, apresentamos um protocolo adequado para o isolamento e cultura de explantes retinianos intactos, juntamente com resultados representativos de microscopia de imunofluorescência documentando as alterações sofridas pelas células gliais e ganglionares da retina na retina ex vivo .

Introdução

A retina sensível à luz, uma extensão do sistema nervoso central (SNC) localizada na parte posterior do olho, é essencial para a visão, mas vulnerável a lesões agudas e doenças crônicas. Tal como acontece com outras regiões do SNC, os neurônios da retina adulta não são substituídos quando perdidos, e as células ganglionares da retina (RGCs) que agregam e transmitem informações visuais ao cérebro são particularmente vulneráveis à disfunção e morte no glaucoma, resultando em perda irreversível da visão 1,2. O glaucoma é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo3, mas, apesar do impacto devastador sobre os indivíduos afetados e dos custos gerais para a sociedade, ainda não se sabe muito sobre como os estágios iniciais da doença contribuem para a perda de RGC4. O papel da glia é uma importante área de investigação na fisiopatologia do glaucoma, pois essas células de suporte não neuronais são essenciais para a sobrevivência do RGC5, mas sofrem mudanças fenotípicas na doença que podem diminuir o comportamento benéfico6 ou até mesmo impulsionar a adoção de fenótipos deletérios7. Embora o termo glia abranja uma variedade de tipos de células especializadas em todo o SNC8, elas podem ser amplamente divididas em duas categorias - aquelas que compartilham uma linhagem de desenvolvimento com neurônios e fornecem suporte trófico, energético e estrutural9, e aquelas com origem mielóide, que realizam tarefas especializadas de vigilância imunológica e resposta10. Representantes de ambas as categorias - astrócitos e células de Müller no primeiro, micróglia no segundo - povoam a retina5 e sofrem grandes alterações no glaucoma que levantam questões significativas sobre seu papel na progressão da doença e na sobrevida do RGC11.

Os esforços para responder a essas perguntas são dificultados em parte pelas características intrínsecas da glia retiniana que apresentam desafios para a investigação in vivo e in vitro. Ao contrário dos neurônios, eles são relativamente silenciosos eletricamente, tornando abordagens como o ERG, que permitem a avaliação funcional de RGCs e fotorreceptores in vivo, inadequadas para investigar mudanças na função e comportamento glial. E embora os modelos induzíveis12 e espontâneos13 de glaucoma estejam disponíveis, muito permanece desconhecido sobre as mudanças na glia nos primeiros momentos da doença, que podem preceder a perda detectável de RGC, um problema agravado pela penetrância variável do estado da doença em muitos desses modelos. Além disso, evidências de glaucoma clínico e experimental sugerem contribuições de células imunes periféricas que podem ser difíceis de desambiguar daquelas da microglia, apesar dos indicadores de que elas podem agir em diferentes "direções" para influenciar a progressão da doença14,15.

Os desafios também são abundantes no estudo da glia retiniana in vitro. Embora o isolamento e a cultura de astrócitos16,17 e microglia18 do cérebro estejam bem estabelecidos, trabalhos recentes destacam extensa heterogeneidade glial entre as regiões do SNC, especialmente em astrócitos19, e fenótipos presentes em uma região podem não estar presentes na glia de outra, como a retina20,21. No entanto, isolar diretamente astrócitos e micróglias da retina para estudo é particularmente desafiador, pois ambos os tipos de células são relativamente esparsos - cada um representando menos de 1% dos estimados 6,5 milhões de células na retina de camundongos22 , 23 , 24 . Além disso, ao contrário dos neurônios, a glia é altamente plástica e se adapta rapidamente a mudanças dramáticas em seu ambiente 16,18,25; Como resultado, os comportamentos observados nessas células in vitro podem representar adaptações específicas ao seu novo ambiente, em vez de padrões fenotípicos que seriam tipicamente vistos na saúde ou na doença. Dadas as limitações da experimentação in vivo e da cultura primária da glia retiniana, buscamos uma abordagem intermediária - explantes retinianos - na qual glia, RGCs e outros elementos da retina são preservados in situ em um contexto ex vivo. Em relação aos modelos in vivo, essa abordagem oferece um curso de tempo experimental abreviado26, permite a manipulação experimental direta da glia retiniana27 e evita a influência potencialmente confusa da infiltração de células imunes periféricas14. Por outro lado, ao contrário da cultura de células primárias, há uma interrupção mínima do ambiente extracelular e a glia permanece intacta e morfologicamente reconhecível, evitando os desafios associados ao crescimento e identificação essenciais dessas células após a interrupção enzimática e mecânica16,25.

Em relação às metodologias de explante de retina descritas anteriormente, essa abordagem enfatiza o foco na confiabilidade técnica, reprodutibilidade e maximização da 'facilidade de uso' da abordagem para melhorar a acessibilidade26,28. Em comunicações pessoais com outros pesquisadores, descobrimos que os desafios técnicos associados ao manuseio da retina viva apresentam um grande obstáculo para muitos que procuram utilizar explantes, enquanto a manutenção da retina explantada em cultura foi relativamente simples para grupos com instalações de cultura de células apropriadas. Portanto, este protocolo inclui uma série de inovações destinadas a reduzir a curva de aprendizado associada ao isolamento da retina e permitir que os pesquisadores comecem a coletar dados experimentais mais rapidamente. Finalmente, embora tenhamos colocado ênfase especial no potencial deste modelo de explante para investigar o comportamento da glia retiniana e caracterizá-lo principalmente com microscopia de imunofluorescência, outros tipos e estruturas de células da retina também são amplamente conservados, e as retinas explantadas permanecem passíveis de uma ampla gama de técnicas de investigação adicionais.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Schepens Eye Research Institute (Protocolo # 2022N000030, aprovado em 04/03/2025). Os animais foram manuseados de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual.

NOTA: A Figura 1 mostra as principais etapas no isolamento da retina viva do olho do camundongo enucleado.

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Figura 1: Uma representação diagramática das principais etapas no isolamento da retina viva do olho do camundongo enucleado. Os números das etapas correspondentes das etapas principais são fornecidos em círculos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação

  1. Desinfete uma pipeta de 1 mL e um par de pinças angulares e coloque-as no gabinete de biossegurança. Estes serão necessários na seção 3 do protocolo.
  2. Modifique uma pipeta de transferência cortando perpendicularmente ao longo do eixo aproximadamente 2 cm abaixo do reservatório, onde o furo é mais largo, para encurtar a pipeta e alargar a abertura. Garanta um corte limpo no qual a retina não se prenda.
    NOTA: Esta ferramenta pode ser guardada para reutilização se estiver limpa e enxaguada com água estéril entre os usos.
  3. Prepare 50 ml de meio de explante assepticamente em um gabinete de biossegurança, suplementando 47,5 mL de meio neurobasal com 500 μL de suplemento N-2, 1 mL de suplemento B-27, 500 μL de Glutamax e 500 μL de mistura de penicilina-estreptomicina (concentração final de 100 U / mL de penicilina e 100 mg / mL de estreptomicina).
    NOTA: Prepare um meio de explante fresco para cada série de isolamentos; o excesso de mídia pode ser mantido a 4 °C por até 1 semana e usado para trocas de mídia, se necessário. Após a abertura, substitua o meio neurobasal não utilizado após 1 mês. N-2 e B-27 devem ser mantidos congelados como alíquotas de uso único, evitando ciclos de congelamento e descongelamento.
  4. Em um gabinete de biossegurança, prepare assepticamente a(s) placa(s) de cultura adicionando um inserto em cada poço a ser usado, manuseando através dos 'pinos' que emergem da borda do inserto para evitar tocar em superfícies que entrarão em contato com os meios de cultura.
    1. Adicione 1 mL de meio de explante à inserção, seguido por mais 3 mL adicionados ao próprio poço. Adicione 2-3 mL de água estéril a quaisquer poços não utilizados para controlar a evaporação.
    2. Transfira a(s) placa(s) para a incubadora a 37 °C com 5% de CO2 para equilibrar aproximadamente 30 min antes do isolamento do tecido.
  5. Prepare quadrados de filtro para criar um substrato para estabilização e transferência de tecidos. Extraia o filtro de um kit de filtragem de tampa de garrafa cortando a periferia do material com uma navalha ou bisturi. Tome cuidado para evitar ferimentos ou danos ao filtro por dobras ou rasgos.
    NOTA: Remover o reservatório de plástico transparente usando uma navalha resistente para cortar o plástico opaco mais maleável onde o adaptador rosqueado encontra o reservatório simplifica o processo de extração, mas deve-se ter cuidado adicional para evitar ferimentos.
    1. Depois que o filtro for destacado por corte, use uma pinça para extraí-lo. Observe a orientação do filtro durante e após a extração; O lado fosco (voltado para o reservatório) deve estar na vertical para montar a retina na etapa 2.16 para transferência.
    2. Corte o filtro em pequenos quadrados de aproximadamente 7 mm × 7 mm; Cada explante de retina exigirá um quadrado. Mergulhe previamente os quadrados em água estéril em uma placa de Petri de 100 mm por pelo menos 20 min.
      NOTA: Os quadrados do filtro podem permanecer imersos em água estéril por até 1 semana antes do uso. Devido à tendência dos quadrados do filtro de desenvolver altos níveis de carga estática antes da imersão, prepare apenas quantos quadrados forem necessários. O material filtrante seco restante pode ser mantido indefinidamente em uma placa de Petri estéril de 100 mm para uso posterior.

2. Isolamento e montagem

  1. Eutanasiar o camundongo por meio de um método aprovado antes de confirmar com uma abordagem secundária; este estudo utilizou asfixia por CO2 seguida de luxação cervical. Enuclee ambos os olhos com pinças curvas de ponta romba e coloque-os em PBS estéril.
  2. Prepare o espaço de trabalho enchendo uma placa de Petri de 100 mm com PBS estéril e colocando-a no palco do escopo de dissecção binocular.
    1. Corte uma tira de 1 cm de largura de lenço umedecido e mergulhe-a no prato para atuar como substrato estabilizador.
    2. Transfira um olho para a placa de dissecação, deixe o outro em PBS e coloque no gelo ou na geladeira a 4 ° C.
      NOTA: Devido à sensibilidade da retina ao intervalo post-mortem prolongado, recomenda-se a eutanásia de um camundongo de cada vez.
  3. Posicione e imobilize o olho. Use uma pinça para manobrar o olho no lenço submerso, o que ajudará na estabilização.
    1. Identifique um ponto de fixação apropriado, segure-o com uma pinça angular e role suavemente o olho para que seja segurado de lado ou, idealmente, de baixo. Certifique-se de que o eixo ântero-posterior (ou seja, da córnea ao nervo óptico) esteja na horizontal. Essa orientação melhora a visibilidade e minimiza a pressão sobre o olho durante a dissecção.
      NOTA: Se possível, segure o tecido extraorbital para evitar perfurar ou apertar o olho, favorecendo o músculo ou a conjuntiva em detrimento do nervo óptico ou da gordura.
  4. Enquanto mantém uma posição segura com a pinça angular, certifique-se de que o olho esteja totalmente submerso e imobilizado com segurança. Faça uma incisão com a ponta do bisturi #11 paralela e aproximadamente 0,5 mm posterior ao limbo, onde a córnea faz a transição para a esclera.
    NOTA: Esta incisão deve ser grande o suficiente para caber na ponta de uma lâmina da tesoura de mola. Como a nitidez da ponta do bisturi é essencial para perfurar o globo de forma limpa, troque a lâmina a cada duas retinas.
    1. Insira uma lâmina da tesoura de mola dentro do globo e comece a cortar circunlimbalmente ao redor do olho, reposicionando suavemente o olho conforme necessário usando uma pinça.
      NOTA: Este corte deve ser o mais reto e paralelo possível ao limbo; O reposicionamento do olho pode exigir largar a tesoura e usar um par de pinças com cada mão. Uma vez exposta, mantenha a retina submersa durante toda a dissecção.
  5. Depois que o corte circunscrever o olho, remova cuidadosamente o segmento anterior e a lente e, em seguida, gire a ocular para cima para facilitar a inspeção visual e a remoção do vítreo. Se um pedaço estendido de nervo óptico permanecer preso, corte-o em um comprimento menor (1-2 mm) para facilitar isso.
  6. Inspecione a retina em busca de danos visíveis e a câmara vítrea em busca de detritos, como células pigmentadas do EPR ou coróide que podem ter entrado durante a remoção do segmento anterior. Use uma pinça angular para imobilizar a ocular nesta posição.
    NOTA: Para obter os melhores resultados, os detritos na câmara vítrea devem ser removidos e os restos vítreos e aderentes residuais do corpo ciliar na periferia da retina devem ser minimizados. Este pode ser um processo desafiador, e notas adicionais podem ser encontradas nas seções 'Reconhecendo e solucionando problemas de lesões mecânicas' e 'Lesões metabólicas' dos Resultados Representativos.
    1. Use a pipeta de transferência modificada para lavar a câmara vítrea com PBS para remover pequenos detritos particulados, evitando bolhas de ar, mantendo a ponta da pipeta abaixo da superfície do líquido e mantendo uma quantidade adequada de PBS no bulbo do reservatório.
    2. Remova os detritos maiores com um pincel fino de aquarela, minimizando o contato com a superfície da retina. Se necessário, remova os detritos mais persistentes com pinças de ponta fina; no entanto, evite o contato direto das pontas das ferramentas de metal com a retina para evitar danos.
  7. Depois de limpar os detritos visíveis, lave a câmara vítrea com PBS da pipeta de transferência repetidamente (3-5 vezes), conforme descrito acima. Isso removerá o vítreo frouxamente aderente que pode permanecer após a remoção dos detritos. Use a escova fina para sondar suavemente a câmara, principalmente perto da periferia, se os elementos do corpo ciliar permanecerem. Embora o vítreo seja opticamente transparente, ele atuará como um arrasto nas fibras da escova e pode ser detectado dessa maneira.
    NOTA: Uma fina camada residual de vítreo na retina não parece afetar negativamente o isolamento ou manter a retina ex vivo, mas a presença de quantidades significativas na periferia da retina, muitas vezes associada a estruturas residuais do corpo ciliar, pode causar dobramento da retina e perda de amostra se não for removida.
    1. Se permanecerem bolsas significativas de vítreo, use a escova para removê-lo varrendo suavemente para fora em direção à periferia, garantindo que, se as fibras da escova entrarem em contato com a retina, elas o façam de um ângulo raso e rastreiem a escova, puxando em vez de empurrar o vítreo da câmara.
      NOTA: A remoção do vítreo requer um manuseio particularmente cuidadoso para evitar danos à retina que podem não ser visíveis macroscopicamente; conselhos sobre como reconhecer e evitar esses danos são encontrados nas seções 'Reconhecendo e solucionando problemas de lesões mecânicas' e 'Lesões metabólicas' dos Resultados Representativos.
  8. Uma vez que a câmara vítrea tenha sido limpa de detritos e apenas o mínimo de vítreo permaneça, separe suavemente a retina externa da ocular enquanto continua a estabilizar a amostra com uma pinça angular. Evite danificar a cabeça do nervo óptico e deixe essa estrutura intacta para ancorar a retina.
    1. Pegue uma pinça, mantendo-a na posição fechada com as pontas se tocando, e insira-a suavemente entre a retina e a coroide, usando uma lacuna pré-existente do manuseio anterior, se possível. Use os braços planos da pinça, em vez das pontas, para aumentar a bolsa entre a retina e a coróide até que essas estruturas possam ser completamente separadas.
      NOTA: Enfatize os movimentos laterais, em vez de empurrar as pontas, para expandir o espaço entre a retina e a coroide. Torcer suavemente a pinça durante esses movimentos pode melhorar a separação, reduzindo o estresse absoluto do atrito entre a pinça e o tecido.
  9. Depois de separar a retina externa da coroide, continue estabilizando a amostra enquanto usa um segundo par de pinças para puxar a ocular - esclera, coróide, etc. - para baixo. Se a retina foi separada com sucesso, ela deve permanecer no lugar, amarrada na cabeça do nervo óptico, enquanto a ocular pode ser mantida por um único par de pinças. Se a retina pressionar com a ocular, continue sondando e separando suavemente os pontos de conexão que não sejam a cabeça do nervo óptico.
  10. Com a retina ancorada na cabeça do nervo óptico, continue imobilizando o tecido e use o segundo par de pinças para agrupar a ocular abaixo da cabeça do nervo óptico.
    1. Verifique se nenhuma parte da periferia da retina está presa em uma posição dobrada devido ao excesso de vítreo no ângulo entre a retina e qualquer corpo ciliar residual. Se necessário, lave a câmara com PBS usando a pipeta de transferência para remover quaisquer detritos adicionais e use suavemente a escova para desenrolar o tecido e eliminar o excesso de vítreo, tomando cuidado para não puxar o tecido excessivamente.
  11. Com a retina exposta de ambos os lados, use a tesoura de mola para fazer uma série de cortes de alívio, espaçados aproximadamente 90°, estendendo-se em linha reta da periferia em direção à cabeça do nervo óptico, parando a aproximadamente 1 mm do centro. Isso minimiza a transecção dos axônios das células ganglionares da retina na retina, melhorando a qualidade dos explantes cultivados.
  12. Enquanto segura o tecido submerso no lugar, remova suavemente o lenço umedecido usando uma pinça para puxá-lo para longe do tecido lateralmente antes de removê-lo do prato. Evite o contato com a retina para evitar a adesão ao lenço e possível perda de amostra.
  13. Em seguida, continue a segurar o tecido e use a tesoura de mola para cortar o nervo óptico diretamente abaixo da retina e, em seguida, remova o restante da ocular do prato.
  14. Uma vez que a retina esteja isolada do resto do olho, encha uma placa de Petri de 35 mm com PBS e use uma pinça para colocar um quadrado de filtro na parte inferior com o lado fosco mais áspero voltado para cima. Tome cuidado para evitar vincar o filtro, pois isso pode impedir o uso do filtro como substrato para mover a retina.
  15. Aspire suavemente a retina com a pipeta de transferência e transfira-a cuidadosamente para a placa de 35 mm. Manobre a retina com a escova para garantir que a superfície interna da retina esteja na vertical e que o tecido fique diretamente acima do quadrado do filtro.
  16. Aspire lentamente o PBS do prato com a pipeta de transferência para abaixar a retina no filtro. Pausa, se necessário, para reajustar o tecido antes de continuar até que a retina se acomode no filtro.
    NOTA: A aspiração rápida pode levar a um movimento lateral repentino da retina, resultando em danos ou perda de tecido. Toda a retina deve repousar no quadrado para evitar danos; no entanto, se a retina se acomodar em uma posição problemática, o PBS pode ser adicionado de volta ao prato até que a retina seja ressuspensa e a montagem possa ser tentada novamente.
  17. Depois que a retina se acomodar no filtro, use o pincel para desenrolar qualquer retina periférica que possa ter se dobrado. Equilibre cuidadosamente o nível de PBS para que a retina não se mova facilmente do filtro, garantindo que reste o suficiente para que a amostra não seque e a escova possa se mover suavemente sem danificar a retina interna.
  18. Mais uma vez, inspecione a retina em busca de detritos. Para evitar danos, limpe a retina sem manuseio direto usando a pipeta de transferência para pingar PBS na retina a cerca de 1 cm acima do tecido. Isso deve remover quaisquer detritos restantes, mas se muito PBS for adicionado ao prato, a retina pode flutuar de volta. Se isso ocorrer, realize a aspiração novamente para remontar o tecido.
    NOTA: Amostras 'simuladas' podem ser geradas transferindo retinas para uma placa de 24 poços para fixação, bloqueio/permeabilização e coloração de anticorpos, conforme descrito em outro lugar21. Esses controles simulados são úteis para solucionar problemas de lesões mecânicas na retina que podem ocorrer durante o isolamento.

3. Transferência para meios de cultura e manutenção

  1. Feche a tampa do prato de 35 mm para transporte até o gabinete de biossegurança, mantendo o prato nivelado para evitar o deslocamento da retina do filtro. Se isso ocorrer, remonte como acima.
  2. Coloque o prato fechado de 35 mm contendo a retina no gabinete de biossegurança, tomando cuidado para não tocar em nenhum equipamento ou superfície dentro do gabinete antes de desinfetar ou trocar as luvas.
  3. Descontamine as luvas com etanol e/ou substitua-as e, em seguida, mova a placa de 6 poços pré-carregada com meio de explante da incubadora para o gabinete de biossegurança. Execute as etapas 3.4 e 3.5 dentro do gabinete de biossegurança, usando as ferramentas colocadas durante a etapa 1.1.
  4. Remova a tampa do prato de 35 mm que contém a retina e use uma pinça angular para levantar cuidadosamente o quadrado do filtro sem tocar diretamente na retina. Remova a tampa da placa de 6 poços e posicione o filtro sobre o centro da inserção de um poço apropriado e, em seguida, abaixe-o lentamente na mídia. A retina se desprenderá do filtro durante esta etapa e flutuará logo abaixo da interface ar-líquido.
  5. Depois que a retina e o filtro se separarem, afaste lentamente o filtro da retina e remova-o da mídia. Usando a pipeta de 1 mL, remova 500 μL de mídia do inserto para garantir que a retina fique plana, prendendo-a entre o piso do inserto e a interface ar-líquido.
  6. Recoloque a tampa da placa e devolva-a à incubadora a 37 °C com 5% de CO2, tomando cuidado para manter a retina próxima ao centro do poço. Até 6 retinas podem ser mantidas em uma única placa.
    NOTA: Se mantiver explantes por 24 h ou menos, eles podem ser deixados na incubadora até o final do experimento. Se mantido por períodos mais longos, recomenda-se 50% de mudanças de meio após 1 dia in vitro e em dias alternados a partir de então.

4. Fixação para imunomarcação (opcional)

  1. Se estiver realizando imunocoloração, consulte as etapas a seguir para fixação; Embora a imunomarcação possa ser realizada usando parâmetros previamente detalhados para retinas planas21, a fixação da retina explantada requer considerações específicas.
  2. Remova as inserções de cultura de células com explantes e meios da placa de cultura de 6 poços e coloque-as em uma superfície não porosa (como a tampa plástica da placa de cultura) que possa ser descartada adequadamente após a fixação, pois as inserções são ligeiramente porosas e pequenas quantidades de fixador passarão para esta superfície subjacente.
  3. Remova suavemente os meios de cultura das inserções e, em seguida, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) a cada um. Deixe as retinas fixarem por 15 minutos em uma capela e, em seguida, remova o PFA e descarte-o de acordo com a política institucional.
    CUIDADO: O paraformaldeído é perigoso e um precursor do formaldeído, um conhecido agente cancerígeno. Tenha cuidado e efetue a fixação em uma hotte com as devidas precauções.
  4. Lave as retinas 3 vezes (por 5 min cada) com PBS para remover o PFA e, em seguida, use uma pipeta de transferência modificada para transferir as retinas em PBS para poços individuais em uma placa de 24 poços para bloqueio, permeabilização e imunocoloração, conforme descrito em outro lugar21. Descarte os plásticos contaminados com PFA (pontas de pipeta, inserções e a superfície não porosa usada durante a fixação) de acordo com a política institucional.
    NOTA: A pipeta de transferência pode ser mantida para transferir retinas fixas e manchadas para uma lâmina para montagem e imagem. Embora não deva ter tido contato direto com o PFA, recomenda-se o uso de pipetas de transferência diferentes para o manuseio de tecidos vivos e fixos.

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Resultados

Na escala macroscópica, as retinas explantadas permanecem essencialmente inalteradas em pontos de tempo de 1 e 3 dias, embora no último momento elas se tornem relativamente frágeis, necessitando de manuseio cuidadoso antes da fixação ou outros desfechos experimentais. As retinas devem ser relativamente planas, sem dobras (o que pode resultar em interrupção localizada na difusão de oxigênio e nutrientes) e devem ser suspensas no meio entre a interface ar-líquido e o inserto da cultura celular. No dia 3, uma faixa fraca po...

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Discussão

As abordagens de cultura organotípica32 , como explantes de retina, aproveitam a flexibilidade experimental e o rápido tempo de resposta da cultura de células, preservando grande parte do contexto in situ dos estudos in vivo , tornando-os um caminho potente para investigar interações complexas entre tipos de células. Apresentamos este protocolo como um ponto de entrada para pesquisadores que podem ter experiência substancial com o olho e se senti...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O M.A.M. foi apoiado pelo NIH / NEI R01EY035312, o Prêmio Catalisador para uma Cura da Fundação de Pesquisa de Glaucoma, a Fundação Melza M. e Frank Theodore Barr, a Fundação Robert M. Sinskey, MD, a Fundação de Caridade da Família Ruettgers e a Fundação BL Manger. P.F.C. foi apoiado pelo NIH / NEI 2T32EY007145. Este trabalho também foi possibilitado por um NIH Core Grant for Vision Research P30 EY003176.  A Figura 1 foi gerada com o Biorender. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Nasir Uddin pelo feedback sobre o manuscrito e ao Dr. Qiurong Zhu pela assistência e apoio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#11 Lâminas de bisturiBard-Parker3,71,311
pipeta de 1 mL ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
placa de Petri de 100 mmFalcon351029
16% ParaformaldeídoTed Pella Inc18,505Diluído a 4% para fixação
24 Placade Poço Falcon353047Para fixação, bloqueio e incubação de anticorpos
35 mm placa de PetriFalcon351008
kit de placa e inserção de 6 poçosGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-152diluição 1:800
Alexa Fluor 594 IgG anti-rato para burro (H+L)InvitrogenA-21209:800 diluição Alexa
Fluor 594-F(ab')2 IgG anti-rato para burro (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 715-586-150diluição 1:800
Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-148diluição 1:800
Alexa Fluor 647-F(ab')2 IgY Anti-Frango para Burros (IgG) (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 703-606-155Diluição 1:800
Pinça angular ('5/45')FST / Dumont11251-35
Anticorpo anti-Brn3a (camundongo)ChemiconMAB1585diluição 1:200
Anticorpo anti-CD206 (rato)BioradMCA2235diluição 1:200
Anticorpo anti-GFAP (frango)Abcamab4674diluição 1:1000
Anti-Iba1 anticorpo (coelho)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-19741diluição 1:500
Anticorpo anti-Tmem119 (cobaia)Synaptic Systems400 004diluição 1:500
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
Pinça curva romba ('Extra Fine Graefe)FST11152-10
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA9647Use 1% p/v para bloqueio e incubação de anticorpos
Kit de filtro (0.2 µ membrana m aPES, Filtro Superior de Garrafa de 150 mL) Fino FB12566508FisherScientific
, Tamanho 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Toalhetes de laboratório (toalhetes Kim) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A Medium, menos fenol vermelhoGibco (Thermofisher)12349015
Soro de Burro NormalJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121Use a 10% para bloqueio e incubação de anticorpos
Penicilina-EstreptomicinaGibco (Thermofisher)15140122
Pontas de Pipeta, 1000 µ LTipOne1126-7810
Tesoura de mola ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Água estéril ('Dnase, Rnase free')Invitrogen10977-015
PBS filtrado estérilGibco10010-023
Pinça reta ('mini')FST / Dumont11200-14
Pipeta de transferência, 5.8 mLfisherscientific13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046. APUso a 0,5% para bloqueio e incubação de anticorpos
altamente adsorvido 1Pincel

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