Um modelo de camundongo para avaliar os resultados estruturais e funcionais de longo prazo após a reversão da obstrução ureteral unilateral prolongada

Summary

Este artigo fornece instruções detalhadas para permitir que os investigadores realizem obstrução ureteral unilateral reversível em camundongos usando um modelo padronizado que permite a análise dos resultados estruturais e funcionais de longo prazo após a reversão da obstrução ureteral prolongada.

Abstract

O manejo clínico de pacientes com obstrução do trato urinário (UTO) requer intervenção precoce para reverter a causa da obstrução, mas, apesar disso, pacientes com UTO prolongada apresentam risco aumentado de doença renal crônica (DRC) e lesão renal aguda recorrente (LRA). No entanto, além de uma reversão precoce da obstrução e terapia genérica para retardar a progressão da DRC, nenhuma terapia melhorou significativamente os desfechos renais em longo prazo após a reversão da UTO. Para resolver isso, vários laboratórios desenvolveram modelos de UUO REVERSÍVEL (R-UUO), mas estes são tecnicamente desafiadores e não foram amplamente adotados. Além disso, embora os modelos de camundongos de R-UUO sejam atraentes, pois podem ser usados para aproveitar o poder da genética de camundongos para estudar a fisiopatologia da doença, eles têm sido particularmente desafiadores, pois os métodos usados geralmente levam a UUO irreversível se a obstrução durar >3 dias. Além disso, devido à natureza desses modelos, poucos estudos avaliaram os resultados funcionais a longo prazo da reversão da obstrução ureteral. Para resolver isso, desenvolvemos recentemente um modelo de camundongo de R-UUO com nefrectomia contralateral tardia que permite a análise dos efeitos a longo prazo da reversão da UTO prolongada nos resultados estruturais e funcionais renais a longo prazo. Esses estudos mostram que, apesar da recuperação histológica quase completa 3 meses após a reversão, houve uma redução permanente da função renal e um defeito acentuado e persistente na capacidade de concentração urinária, indicativo de um defeito na função medular renal. O modelo requer três grandes cirurgias de sobrevivência, mas resulta em uma redução robusta e reprodutível a longo prazo na função renal que pode ser reproduzida em diferentes cepas de camundongos, ajustando o período de obstrução. Neste artigo, fornecemos instruções detalhadas para realizar essas cirurgias, otimizando as condições para uso em diferentes cepas de camundongos, avaliando os resultados funcionais renais e coletando tecidos renais.

Introduction

A obstrução do trato urinário (UTO) pode ser unilateral, muitas vezes assintomática, apresentando-se tardiamente com uropatia obstrutiva crônica¹, ou pode se apresentar agudamente com cólica renal e/ou hematúria; pielonefrite aguda ou lesão renal aguda (LRA) pós-renal2. A chave para o manejo da ITO é a reversão precoce da obstrução². No entanto, apesar da reversão efetiva e do uso de terapias genéricas para retardar a progressão da doença renal crônica (DRC), os pacientes afetados permanecem em risco aumentado de DRC progressiva e hipertensão ^3,4. Além disso, a capacidade de concentração urinária (CCU) em longo prazo é frequentemente prejudicada⁵, o que pode predispor pacientes suscetíveis à desidratação e LRA recorrente, acelerando o declínio progressivo da função renal após a IUT.

Em parte, essa falha em identificar abordagens terapêuticas para melhorar os resultados a longo prazo em pacientes com ITO resultou de nossa confiança no uso de modelos de obstrução ureteral unilateral irreversível (UUO) para explorar a patobiologia da UTO. No entanto, esses modelos não replicam a situação clínica em que os pacientes são submetidos à reversão logo após o diagnóstico e não podem ser usados para explorar os mecanismos e abordagens terapêuticas que poderiam ser usados para melhorar o reparo a longo prazo após a reversão da obstrução. Modelos reversíveis UUO (R-UUO) foram desenvolvidos para resolver isso, mas são mais desafiadores tecnicamente do que os modelos UUO irreversíveis, mais difíceis de reproduzir por diferentes laboratórios e, como resultado, não foram tão amplamente adotados pela comunidade científica. Os modelos de camundongos são atraentes, pois podem ser usados para aproveitar o poder da genética de camundongos para estudar a fisiopatologia da doença, mas têm sido particularmente difíceis de otimizar, pois os métodos geralmente levam a UUO irreversível se a obstrução durar mais de 3 dias⁶. Uma variedade de abordagens foi implantada para resolver isso, incluindo multicirurgia, colocação sequencial de pinças ao longo do ureter a cada 2 dias ^6,7; UUO seguido de reimplante vesical 8,9,10,11; e use braçadeiras e tubos não prejudiciais para obstruir o ureter 12,13,14. Estudos de resultados de longo prazo em ratos e camundongos mostraram melhora da função renal, redução da fibrose e/ou lesão glomerular após a reversão da obstrução, mas apenas recuperação parcial se a UUO durar mais de 2 dias 6,7,8,9,12,14,15,16,17,18,19 . Além disso, embora a medula renal (MR) seja particularmente suscetível a danos causados pela UTO^20,21 até recentemente, não houve estudos de longo prazo com roedores nos quais os efeitos do R-UUO prolongado na estrutura e função da RM tenham sido estudados. Isso é significativo, uma vez que o CCU e a capacidade de excretar cargas de sal sem aumentar a pressão arterial (a chamada resposta à natriurese por pressão) dependem da manutenção da integridade anatômica do MR ^22,23,24, de modo que o reparo incompleto do MR após a reversão da ITO pode explicar por que os pacientes têm maior suscetibilidade à LRA recorrente e hipertensão após a reversão da UTO. No entanto, muitas das técnicas necessárias para avaliar isso requerem várias rodadas de cirurgia (cinco cirurgias de grande porte para 6 dias de obstrução ^6,7), requerem experiência cirúrgica difícil de ensinar (por exemplo, reimplante cirúrgico do ureter na bexiga ^8,9,10,11) e como a obstrução é unilateral, torna difícil para os investigadores avaliar as alterações na função renal após a reversão da obstrução.

Para resolver isso, desenvolvemos um modelo de camundongo de R-UUO que é relativamente simples de realizar e ensinar, requer um número mais limitado de cirurgias do que outras técnicas (duas cirurgias por 5 a 7 dias de obstrução) e permite a análise da recuperação funcional renal sem a necessidade de estudos invasivos e/ou caros de função renal^{dividida 25}. Para isso, os camundongos passam por três grandes cirurgias: 1) colocação de uma pinça vascular não traumática no ureter proximal esquerdo; 2) retirada da pinça vascular 5 a 7 dias depois, dependendo da cepa do camundongo; e 3) retirada do rim contralateral 10 dias depois para avaliação da função renal. Aproximadamente 20 a 40% dos camundongos morrem dentro de 2-3 dias após a nefrectomia, indicando que o UUO não reverte em todos os camundongos. O acompanhamento a longo prazo dos camundongos sobreviventes mostra que, apesar da recuperação histológica quase completa da medula renal (RM) 3 meses após R-UUO. Há redução da função renal, medida pela taxa de filtração glomerular transdérmica (TFGt)²⁶. Além disso, há uma redução acentuada no CCU, determinada pela medição da osmolalidade urinária após a restrição hídrica, sugerindo que há um defeito permanente na função do MR. Estudos de curso de tempo mostram que, embora haja melhora na TFGt entre os dias 28 e 56 pós-RUUO, isso se estabiliza entre os dias 56 e 84. Em contraste, não há melhora no UCC entre os dias 28 e 84 após o R-UUO²⁵. Usando scRNA-Seq de RMs isolados, validados por linhagem celular e estudos de imuno-histoquímica, identificamos fortes respostas regenerativas que restauraram as dimensões de RM após R-UUO, mas que todos os principais compartimentos celulares no MR mostraram mudanças permanentes no número de células e assinaturas gênicas que provavelmente afetarão a recuperação funcional após R-UUO. Isso incluiu respostas pró-inflamatórias persistentes no ducto coletor de MR e na alça das populações de células de Henle 84 dias após R-UUO, semelhante às assinaturas inflamatórias e de senescência de células epiteliais tubulares proximais de reparo falhado após LRA e UUO 27,28,29,30. Alterações semelhantes também foram observadas em ductos coletores de MR de pacientes com doença renal recorrente³¹, sugerindo que há uma resposta comum de lesão ao dano de RM em humanos e camundongos. Neste artigo, fornecemos instruções detalhadas sobre como realizamos essas cirurgias, como otimizamos as condições para seu uso em diferentes cepas de camundongos, como determinamos se o ureter ainda está obstruído após a reversão, como avaliamos os principais resultados funcionais e como coletamos tecidos renais para avaliar as estruturas medulares renais.

Protocol

Aqui, o protocolo de quatro etapas usado para estudos de longo prazo é descrito (Figura 1). Conforme discutido no final deste manuscrito, os pesquisadores podem optar por realizar apenas três deles (seções 1, 2 e 4) ou todos os quatro se estiverem interessados em estudar os resultados de longo prazo. Todos os experimentos com camundongos neste manuscrito foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Vanderbilt e seguem as diretrizes de uso de animais.

1. Colocação da pinça ureteral (10 - 15 min/mouse)

NOTA: Confie no conhecimento da anatomia do rim de camundongo para localizar o ureter, pois não é possível vê-lo diretamente sem o tecido conjuntivo circundante. O ureter corre ao longo da face posterior inferior do tecido hilar à medida que o rim é exposto (Figura 2). A escolha da pinça vascular é importante. Eles podem ser caros, mas podem ser limpos, autoclavados e reutilizados várias vezes. Esses grampos podem ser reutilizados pelo menos 100 vezes sem problemas.

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia a 121 °C por 30 min. Se estiver realizando cirurgias em vários camundongos, remova sangue e detritos dos instrumentos entre o uso e esterilize por 10 a 15 s usando o esterilizador de esferas quentes. Deixe os instrumentos esfriarem antes de usá-los novamente.
2. Pese o mouse.
3. Anestesiar o camundongo usando 5-10 mg / kg de xilazina com 90-120 mg / kg de cetamina por injeção intraperitoneal (ver Tabela de Materiais). Isso geralmente leva de 3 a 5 minutos para entrar em vigor.
4. Administre analgesia pré-operatória se estiver usando um agente anestésico diferente, como o isoflurano, pois, ao contrário da xilazina, este não tem efeitos analgésicos.
5. Raspe o local da cirurgia dos quadris até a caixa torácica e ao redor do lado, com borda suficiente para evitar que o cabelo contamine o local da incisão. Realize em uma área preparatória, não onde a cirurgia é realizada.
6. Cubra o campo cirúrgico aquecido com um campo cirúrgico estéril. Isso ajudará a evitar que cabelos soltos entrem no campo cirúrgico e fornecerá uma área para colocar instrumentos estéreis.
7. Aplique pomada lubrificante oftálmica nos olhos.
8. Aplique a preparação asséptica usando gaze embebida em betadine: esfregue do centro do local em direção à periferia 3 a 4 vezes, cada vez seguida de uma limpeza uma vez com um cotonete embebido em álcool. Remova toda a betadina do campo cirúrgico antes da incisão.
9. Faça uma incisão dorsal longitudinal de 1,5 cm na linha média através da pele e das camadas subcutâneas usando tesoura e fórceps.
10. Faça uma pequena incisão no músculo do flanco esquerdo e na fáscia acima do rim e exteriorize o rim esquerdo.
11. Disseque cuidadosamente a gordura do polo inferior e parte do tecido conjuntivo ao redor de onde o ureter deveria estar. Não é possível ver o ureter diretamente sem o tecido conjuntivo circundante. Em seguida, separe o ureter com seu tecido conjuntivo circundante do pedículo renal, que contém a veia e a artéria renais, de modo que o pedículo renal não seja incluído com a pinça ureteral (Figura 2).
12. Use os aplicadores de grampo para abri-lo e coloque-o no ureter diretamente abaixo da pelve. Use as marcações no grampo vascular para garantir que sejam colocadas com a mesma pressão no ureter para cada camundongo (Figura 3). Não aplique e, em seguida, remova o grampo para reposicionar, pois isso pode danificar o ureter.
13. Uma vez que a pinça tenha sido colocada, empurre suavemente o rim com a pinça de volta para o espaço retroperitoneal usando um cotonete estéril embebido em solução salina.
14. Feche a camada muscular usando uma sutura absorvível.
15. Feche a camada de pele usando clipes de pele.
16. Administre buprenorfina 3,25 mg / kg de analgesia, conforme descrito na seção de medicamentos, e administre 0,5 mL de solução salina normal estéril por via subcutânea para hidratar os camundongos.
17. Deixe o mouse no campo cirúrgico da almofada dura aquecida ou transfira-o para a gaiola doméstica com uma almofada isotérmica aquecida sob a metade da gaiola até que o mouse acorde.
18. Retorne o mouse para a sala de animais.
19. Monitore de perto o camundongo e administre doses adicionais de buprenorfina para dor ou desconforto por 48 a 72 h. Os sinais clínicos de dor e angústia que indicam que os camundongos precisam de analgesia adicional incluem depressão ou outras alterações comportamentais, aparência anormal ou posturas como piloereção, postura curvada, falta de higiene e alimentação ou imobilidade.

2. Remoção da pinça ureteral (10 - 15 min/mouse)

1. Siga as etapas 1.1 a 1.10 do procedimento de colocação do grampo usando as incisões originais da pele e dos músculos para iniciar a remoção do grampo. Remova os clipes da ferida antes de limpar a área cirúrgica. Fazer a barba novamente geralmente não é necessário, pois o cabelo não voltou a crescer.
2. Devido às aderências teciduais desenvolvidas, use uma pinça para localizar cuidadosamente a pinça no espaço retroperitoneal sem primeiro exteriorizar o rim. Use os aplicadores de grampo para abrir suavemente o grampo enquanto usa a pinça para puxar o tecido para baixo ao redor da cabeça do grampo para remover o grampo.
3. Agora, exteriorize o rim para que a pelve renal possa ser visualizada para determinar a obstrução. A pelve renal deve estar inchada, indicando hidronefrose.
4. Depois que o rim for inspecionado, empurre-o suavemente de volta para o espaço retroperitoneal usando um cotonete estéril embebido em solução salina.
5. Siga as etapas 1.13 a 1.18, conforme descrito acima.

3. Nefrectomia contralateral (10 - 15 min/camundongo)

1. Raspe a área, se houver, há crescimento de pelos.
2. Use uma mistura de isoflurano/ar a 1-5% para anestesia para permitir uma recuperação mais fácil devido a eventos anestésicos anteriores. Remova os clipes da ferida antes de limpar a área cirúrgica.
3. Administre analgesia com buprenorfina no pré-operatório (ver Tabela de Materiais).
4. Siga as etapas do procedimento 1.1-1.9 usando a incisão original da pele para começar.
5. Faça uma pequena incisão no músculo do flanco direito e na fáscia acima do rim e exteriorize o rim direito.
6. Segure o rim suavemente com uma pinça curva e lisa e disseque cuidadosamente os pólos superior e inferior do rim livres do tecido circundante.
   NOTA: O tecido ao redor do pólo superior contém a glândula adrenal, carregando seu próprio suprimento de sangue, que pode ser retirado do rim, mas obviamente não deve ser removido do camundongo (ver Figura 2).
7. Depois de liberar o rim do tecido circundante, amarre a sutura de seda 4-0 completamente ao redor dos vasos renais e do ureter usando um nó cirúrgico duplo. Se deixado por ~ 30 s, o rim fica escuro. Segure o rim com uma pinça lisa e curva e remova o rim cortando distalmente ao nó com uma tesoura curva.
8. Empurre suavemente o pedículo renal restante de volta para o espaço retroperitoneal usando um cotonete estéril embebido em solução salina.
9. Siga as etapas 1.13 a 1.18, conforme descrito acima.

4. Coleta de tecidos

1. Anestesiar com mistura de isoflurano/ar a 5% para obter um plano estável de anestesia cirúrgica antes do procedimento terminal.
2. Abra a cavidade abdominal para expor o rim esquerdo
3. Inspecione o rim para ver qualquer inchaço da pelve renal (consulte a etapa 2.3).
4. Se parecer que a pelve renal ainda está inchada, insira uma agulha borboleta de pequeno calibre conectada a uma seringa contendo 0,5 mL de uma diluição de 1 em 5000 de azul de metileno em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Se o ureter estiver pérvio, a solução azul será visível à medida que viaja da pelve renal para a bexiga. Caso contrário, a pelve renal inchará com solução azul e não aparecerá na bexiga.
5. Para a perfusão, fixe os rins, abra a cavidade torácica e exponha o coração.
   1. Enquanto o coração ainda está batendo, insira uma agulha borboleta 23-25 G no ventrículo esquerdo, inicie uma infusão de solução salina normal e corte o átrio ou ventrículo direito para substituir o volume sanguíneo por solução salina.
   2. Após cerca de um minuto, certifique-se de que os rins estejam brancos. Continue a infusão de solução salina por mais um minuto ou troque-a por uma infusão de solução de formalina a 10% por mais 1-2 min para fixar os tecidos.
   3. Neste ponto, o mouse estará morto; colher os tecidos. Se os tecidos forem coletados para estudos de RNA ou proteína, não os fixe por perfusão.
6. Após a remoção dos rins do animal (tenham eles sido fixados por perfusão ou não), use uma lâmina de barbear para cortar até três fatias sagitais de 2-3 mm de espessura no centro do rim (Figura 4). Isso fornece seções representativas que incluem a medula e o córtex renais e fornece tecido suficiente para ensaios de histologia, proteína ou RNA.
7. Prossiga para fixar/congelar amostras de acordo com os requisitos do estudo.

Results

Para estudos de longo prazo, geralmente avaliamos a função renal medindo o nitrogênio ureico no sangue sequencial (BUN) e as taxas de filtração glomerular transdérmica (tGFR) em camundongos conscientes (consulte um artigo publicado anteriormente descrevendo isso²⁶), além de medir a capacidade de concentração urinária (UCC) avaliando a osmolaridade urinária a partir de amostras pontuais de urina coletadas após 18 h de privação hídrica. Embora sempre realizemos estudos de ureia, eles são mais úteis ...

Discussion

Em comparação com algumas das abordagens que foram usadas para estudar a reversão do UUO prolongado em camundongos^{6,7,8,9,10,11,12,13,14}, o protocolo descrito aqui é relativamente simples ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,9% de cloreto de sódio	Farmácia VUMC	múltiplo
Sutura absorvível Vicryl 6-0	Med Vet International- ETHICON	J492G
Cotonetes com álcool	Cotonetes de álcool isopropílico da marca BD	BD 326895
Solução Betadine	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc	67618015017
Pinça de aplicação de braçadeira: S & T CAF-4	Ferramentas de Belas Ciências	00071-14
Almofada isotérmica Deltaphase	Braintree Científico	DPIP
Aparador elétrico	Oster	múltiplo
Luvas cirúrgicas texturizadas de látex ENCORE	Ansell	5785003
Ethiqa XR Buprofenor (CIII) VI 1,3 mg/mL	Patterson Veterinário - Ethiqa	86084010030
EZ Clip 9 mm	Braintree Científico	EZC-CS	ou 7 mm
Aplicador EZ Clip 9 mm	Braintree Científico	EZC-APL	ou 7 mm
Removedor de clipes EZ 9 mm	Braintree Científico	EZC-RMV	ou 7 mm
Esponjas de gaze 2 e agudas; 2	Fisher Científico	22-362178
Ponta serrilhada angular ou curva Graefe	Ferramentas de Belas Ciências	11049-10
Ponta serrilhada reta Graefe	Ferramentas de Belas Ciências	11050-10
Almofada dura aquecida 15 &agudo; 24	Braintree Científico	HHP 2
Conectores de bomba de almofada rígida aquecida	Braintree Científico	Conector HHP Gaymar
Esterilizador de esferas quentes	Ferramentas de Belas Ciências	18000-45
Seringa de insulina 0,5 mL 29 g	Exel Internacional	26028
Isoflurano	Patterson Veterinário-Pivetal	78949580
Cetamina 100 mg/mL	Farmácia VUMC
Sutura não absorvível Seda 4-0	Med Vet International- ETHICON	683 ouros
Porta-agulhas Olsen Hegar: com cortador de sutura	Ferramentas de Belas Ciências	12002-12
Optixcare Lubrificante de Olhos 20 g	Med Vet Internacional	PHOPTIXCARE
Tesoura-Blunt Lexer-Baby	Ferramentas de Belas Ciências	14078-10
Tesoura-Afiada curvada	Ferramentas de Belas Ciências	14005-12
Aplicadores estéreis com ponta de algodão	Puritano	25806 2WC
Esponjas de gaze estéreis 4 &agudas; 4	Fisher Científico	22-415-469
Campo cirúrgico descartável estéril 18 &agudo; 26	Med Vet Internacional	20001
Bolsa para Instrumentos de Esterilização 5 ´ 10	Fisher Científico	01-812-54
Bomba de resfriamento de aquecimento T / pump	Braintree Científico	TP-700
Pinça Taylor curva, lisa	Ferramentas de Belas Ciências	11017-17
Braçadeira vascular: S & Prensa T 5 a 15 g	Ferramentas de Belas Ciências	00396-01
Xilazina 100 mg/mL	Patterson Veterinário- Cronos	CR04305