Artigo de método

Gravações de matriz de multieletrodos de alta densidade de ondas retinianas usando uma plataforma de eletrofisiologia

DOI:

10.3791/68493

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24 de junho de 2025

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1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Matrizes de multieletrodos de alta densidade (HD-MEAs) são usadas para estudar ondas retinianas espontâneas, que desempenham um papel crucial no desenvolvimento do circuito neural. Este protocolo descreve as etapas para preparar o tecido da retina de camundongos e realizar registros eletrofisiológicos usando HD-MEAs em uma plataforma de eletrofisiologia.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As ondas retinianas espontâneas são uma marca registrada da atividade da rede retiniana durante o desenvolvimento, desempenhando um papel crucial na formação do sistema visual, influenciando o refinamento dos axônios, a permeabilidade da vasculatura e a maturação geral dos circuitos neurais. Essas ondas são comumente estudadas em preparações retinianas ex vivo usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs), que permitem registros eletrofisiológicos de grandes populações de atividade de células ganglionares da retina (RGC). A eletrofisiologia baseada em MEA tornou-se uma ferramenta poderosa devido à sua facilidade de uso para coletar rapidamente dados de alto rendimento, tornando-a ideal para estudar a atividade da retina em uma variedade de condições experimentais.

Neste protocolo, descrevemos as etapas críticas para a preparação do tecido retiniano para a aquisição de dados eletrofisiológicos usando um MEA de alta densidade (HD-MEA) em uma plataforma de eletrofisiologia. O processo começa com o isolamento cuidadoso de retinas intactas de animais neonatais em condições fisiológicas. Uma vez preparada, a retina é cuidadosamente montada em um chip HD-MEA, que consiste em uma grade de 26.400 eletrodos capazes de realizar gravações extracelulares simultâneas de pelo menos 1.000 RGCs. As gravações podem durar até várias horas. Em última análise, essa abordagem metodológica oferece aplicações valiosas na investigação do desenvolvimento da retina, doenças e estudos comparativos potencialmente entre espécies, contribuindo para avanços mais amplos na pesquisa em neurociência e visão.

Introdução

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As ondas espontâneas da retina são explosões periódicas de atividade correlacionada observadas na retina em desenvolvimento antes do início da visão. Em camundongos, os circuitos que iniciam e propagam as ondas da retina mudam rapidamente durante o desenvolvimento, começando embrionicamente e terminando na abertura dos olhos (14º dia pós-natal)1. À medida que os circuitos retinianos se desenvolvem, as propriedades espaço-temporais das ondas retinianas mudam drasticamente 2,3. Vários estudos sustentam que essas propriedades espaço-temporais específicas instruem o desenvolvimento do sistema visual: a atividade assíncrona entre os olhos instrui a segregação específica do olho4, o tamanho da área de onda instrui o refinamento dos axônios retinotópicos nas regiões cerebrais binoculares 5,6 e a direção de propagação das ondas tem sido implicada para instruir os circuitos de seletividade de direção no colículo superior3. Além dos circuitos neurais, as ondas retinianas são responsáveis pelo desenvolvimento da permeabilidade da vasculatura sanguínea7. Além disso, descobriu-se que as ondas retinianas estágio II controlam o crescimento das áreas do campo receptivo e o estabilizam nas células ganglionares da retina (RGCs)8. Criticamente, as ondas retinianas aberrantes durante o desenvolvimento podem ser a base de vários distúrbios do neurodesenvolvimento e, de fato, as ondas retinianas são anormais em um modelo de nistagmo congênito em camundongos3. Dado seu papel crítico no desenvolvimento inicial do sistema visual e implicações para doenças, é necessário registrar a dinâmica espaço-temporal das ondas retinianas em qualquer idade e em qualquer modelo animal.

Vários métodos surgiram para estudar as ondas da retina. Tanto a eletrofisiologia de célula única 9,10 quanto a imagem de cálcio 11,12,13,14,15 levaram a descobertas seminais sobre circuitos e a função das ondas retinianas. Aqui, nos concentramos em gravações de arranjo de múltiplos eletrodos (MEA), um método que tem sido usado desde a investigação inicial das ondas retinianas16 e continuou a melhorar como técnica2. Os MEAs permitem o registro extracelular simultâneo de potenciais de ação de centenas a milhares de RGCs, permitindo que os pesquisadores rastreiem a iniciação, propagação e término da onda de forma semelhante ao que é possível com imagens de cálcio. Como os MEAs registram diretamente o potencial de ação dos RGCs, os MEAs podem ser usados para estudar vários modelos genéticos de camundongos ou organismos não modelo sem a complicação adicional de introduzir um indicador de cálcio. O tecido também pode ser cultivado diretamente no MEA, permitindo tempos de gravação muito longos. Os MEAs também são altamente escaláveis, com os produtos atuais permitindo até seis MEAs ativos de uma só vez, o que pode permitir uma avaliação rápida das retinas e catalisar a descoberta de medicamentos. Talvez a maior força dos MEAs seja sua capacidade de amostrar muitas células a uma alta taxa de amostragem, o que permite que laboratórios em todo o mundo obtenham rapidamente conjuntos de dados ricos, mas requer experiência em pós-processamento.

O objetivo principal deste protocolo é fornecer um protocolo detalhado e reprodutível para preparar o tecido retiniano e realizar registros eletrofisiológicos usando um sistema MEA de alta densidade de poço único (HD-MEA) para estudar ondas retinianas espontâneas ex vivo. Este método garante a aquisição de dados de alto rendimento e longa duração, tornando-o adequado para uma ampla gama de estudos relacionados ao desenvolvimento e à doença. O novo sistema HD-MEA avançado baseado em CMOS, que permite > 1.000 locais de eletrodos de uma só vez, oferece várias vantagens em relação às abordagens eletrofisiológicas tradicionais. Seu feixe de eletrodos de alta densidade (26.400 eletrodos) permite registros extracelulares precisos e simultâneos de até 1.012 RGCs, capturando padrões de atividade espacial em escala fina. O design de poço único fornece condições de gravação uniformes17. Além disso, esse sistema permite registros de longo prazo com duração de várias horas, possibilitando o estudo da dinâmica das ondas sob várias condições fisiológicas e farmacológicas sem degradação significativa do sinal18. Ao fornecer um protocolo, este estudo visa tornar a tecnologia HD-MEA acessível a um público mais amplo de pesquisadores em neurociência, oftalmologia e ciência da visão. Este método representa um passo significativo no estudo das ondas da retina, oferecendo novos caminhos para estudar o desenvolvimento inicial do sistema visual, mecanismos de doenças e possíveis intervenções terapêuticas.

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Protocolo

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Este protocolo descreve as etapas para isolar e preparar o tecido retiniano de camundongos neonatais para gravações MEA de ondas retinianas usando a plataforma HD-MEA da Maxwell Biosystems. O procedimento é projetado para preservar as condições fisiológicas, garantindo que o tecido da retina permaneça estruturalmente intacto, livre de danos e devidamente preparado para o contato ideal com o eletrodo. Esses experimentos foram aprovados pelo Programa de Cuidados e Uso de Animais Vanderbilt, sob o número de protocolo M2200056-00. Os camundongos (1-2 semanas de idade, ambos os sexos) foram alojados em um viveiro de ciclo dia/noite de 12 h e alimentados com uma dieta regular de ração.

1. Preparação do tecido retiniano

  1. Isolamento da retina
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo (consulte também a Figura 1).
    1. Preparar o espaço de trabalho
      1. Prepare o líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF): 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de glicose, borbulhado com carbogênio: 95% O2/5% CO2 (pH 7,4, osmolaridade 290 ± 10 mOsm) e armazene-o a 5 ° C. Mantenha o aCSF no gelo enquanto estiver sendo oxigenado por 10 minutos antes da dissecção.
        NOTA: O CaCl2 deve ser adicionado por último, após a solução ter borbulhado com carbogênio por 10 min.
      2. Comece a oxigenação do aCSF fresco e gelado (por pelo menos 10 min).
      3. Configure ferramentas de dissecação e microscópio.
    2. Eutanásia do animal de acordo com as diretrizes institucionais.
    3. Enuclee os olhos usando uma tesoura de mola curva-
      1. Como os filhotes pós-parto têm os olhos fechados até P11-13 (em camundongos) e as pálpebras precisam ser abertas com cuidado, use microfórceps para segurar as pálpebras e uma tesoura de mola para removê-las. Retire cuidadosamente os olhos com uma tesoura de mola, evitando danos oculares.
      2. Corte o nervo óptico e coloque os olhos em aCSF oxigenado. Use uma pipeta de transferência para mover suavemente o olho entre as placas de Petri.
        NOTA: Para o restante do protocolo de dissecção, atualize com aCSF oxigenado a cada 10 min.
    4. Sob um microscópio de dissecação,
      1. Faça uma pequena incisão na córnea usando uma agulha enquanto estabiliza o olho com uma pinça.
      2. Disseque a córnea sem rodeios, rasgando suavemente ao longo do perímetro escleral.
      3. Remova a íris e a lente. Se a retina estiver presa ao cristalino em animais jovens, separe-a suavemente usando uma pinça.
        NOTA: Em animais jovens, a retina às vezes é anexada ao cristalino. Use a pinça para puxar suavemente a lente da retina usando uma pinça para puxar a lente e a outra apoiada nas bordas externas da retina para manter a retina no lugar enquanto a lente está sendo removida.
    5. Oriente a retina.
      1. Identifique o lado ventral usando o tecido coróide (ver Sondereker et al.19 para um protocolo detalhado sobre orientação) e posicione-o de frente para o pesquisador com a camada RGC voltada para cima.
      2. Use um bisturi curvo para fazer um corte de referência 45° no sentido anti-horário a partir do eixo ventral.
      3. Usando uma pinça fina, separe suavemente a retina do epitélio pigmentado da retina (EPR) e da esclera.
        NOTA: Em camundongos mais jovens, o RPE se desprende facilmente da retina. Em camundongos mais velhos, o RPE está mais ligado à retina. Se, após remover o EPR da maior parte da retina, o EPR ainda estiver ancorado à retina através do nervo óptico, use uma tesoura de mola para cortar essa conexão. Isso evita danos ao tecido retiniano próximo ao nervo óptico.
    6. As retinas neonatais quase não têm corpo vítreo, mas as retinas mais antigas têm (aparece como um filamento marrom ao longo da borda da retina, mas as fibras também se conectam umas às outras dentro do humor vítreo). Usando a pinça fina, remova o tecido vítreo que fica acima da camada RGC.
      NOTA: Essa camada fibrosa às vezes se solta quando a lente é removida. Caso contrário, é importante remover o máximo possível, ou isso impedirá o contato adequado dos RGCs com os eletrodos.
    7. Usando um bisturi, faça quatro cortes em relevo para ajudar a retina a ficar plana no prato. Para saber e manter a orientação mais tarde, apare os dois cantos do quadrante ventral com um bisturi.

2. Montagem da retina no chip MEA

  1. Montando a retina-
    1. Transfira suavemente a retina da placa de Petri para o chip MEA usando a pipeta de transferência com a ponta cortada. Certifique-se de que haja aCSF suficiente no chip para cobrir o fundo do poço.
    2. Use a escova de cabelo único para manobrar suavemente a retina para ser posicionada acima dos eletrodos, a camada RGC voltada para os eletrodos.
    3. Usando a pipeta de 10 μL, remova suavemente o aCSF extra ao redor do tecido da retina. Incline o chip em um ângulo para se livrar do aCSF extra.
      NOTA: Nunca toque nos eletrodos ou amplificadores com a ponta da pipeta. À medida que o aCSF é removido, a retina se achata mais. Se alguma parte da retina estiver dobrada embaixo de si mesma, use a escova de cabelo único para colher suavemente sob o folheto desejado para desdobrá-lo. Para evitar que a retina se mova durante o desdobramento de qualquer parte dos folhetos, uma segunda escova de cabelo único pode ser usada para aplicar uma leve pressão no centro da retina, onde o nervo óptico se conecta.
    4. Seque o poço o máximo possível inclinando o cavaco em um ângulo de 45° e removendo o último aCSF que se acumula na parte inclinada do cavaco.
      NOTA: Isso aumentará a conexão entre a retina e os eletrodos.
    5. Use papel de filtro para enxugar e secar suavemente as bordas da retina. Coloque o chip MEA em uma câmara de gravação.
  2. Melhorando o contato do eletrodo-
    1. Use uma inserção de suporte de tecido substituível para empurrar suavemente a retina para os eletrodos, garantindo o contato ideal e melhorando a relação sinal-ruído.
      NOTA: A inserção do porta-lenços deve parar de ser abaixada assim que entrar em contato com a retina (uma "mancha úmida" clara será visível no ponto de contato). O abaixamento adicional do suporte do eletrodo corre o risco de danificar o tecido retiniano. Faça a transição rápida da etapa 2.1.4 para a 2.2.1 para minimizar o tempo que a retina permanece sem aCSF oxigenado; Esta etapa é crítica e deve ser concluída o mais rápido possível. É importante mover-se rapidamente ao achatar a retina no chip, no entanto, também é importante que a maior parte do aCSF da dissecção seja seca para que a retina faça um bom contato com o eletrodo. Ir muito rápido para colocar a retina sob oxigenação corre o risco de não ter um bom contato com os eletrodos de gravação, e ir muito devagar corre o risco de as células da retina ficarem hipóxicas e morrerem. Descobrimos que 30-60 s levam a um bom contato e retinas saudáveis (ou seja, observamos ondas retinianas típicas).
    2. Usando o sistema de perfusão referenciado, comece a encher o poço do chip MEA com aCSF oxigenado a uma taxa de fluxo de 2 mL / min.
      NOTA: Recomenda-se um sistema de perfusão aberto, pois o ruído elétrico permanece baixo e fornece aCSF fresco para a retina. Certifique-se de que um sistema de aquecimento em linha esteja conectado à configuração de perfusão para aquecer o aCSF a condições fisiológicas.
    3. Ligue o aquecedor em linha do sistema de perfusão para aquecer o aCSF a 32-34 °C.

3. Registros eletrofisiológicos

  1. Gravações extracelulares-
    1. Ligue o sistema de gravação.
    2. No computador de aquisição, clique duas vezes primeiro no ícone Servidor e depois em Escopo para abri-lo.
    3. Clique no ícone Inicializar na interface do Escopo e insira o ID do chip MEA para iniciar gravações extracelulares usando o sistema MEA.
    4. Clique no ícone Deslocamento na interface Escopo para configurar o deslocamento.
    5. Ajuste as configurações de ganho e filtro para otimizar a detecção do sinal. Use as configurações padrão de ganho 512 e um passa-alto de 300 Hz; definir a taxa de amostragem em 20 kHz.
    6. Selecione a configuração de gravação apropriada. A área ativa total que pode ser amostrada é de 3,85 x 2,1 mm2. O software permite que os usuários escolham como configurar o espaçamento dos eletrodos; Para seguir este protocolo, use a configuração padrão que distribui igualmente os eletrodos de gravação pela área ativa máxima, pois isso mostra o máximo possível da retina. Isso leva a um espaçamento de 87,5 μm por eletrodo de registro.
    7. Deixe a retina se aclimatar à câmara de registro por 60 min.
    8. Inicie gravações de atividades espontâneas de RGCs navegando até a guia Ensaio e selecionando o ícone Criar Novo Ensaio . Escolha o tipo de ensaio de rede , atribua um nome de arquivo apropriado e clique em OK para salvar a configuração. Defina a duração desejada para a gravação ajustando o parâmetro Tempo de gravação (seg). Ative a opção Apenas pico para focar nos dados de pico e clique no ícone Executar ensaio para iniciar a sessão de gravação.
      NOTA: Para gravações de ondas retinianas de 10 minutos ou mais, recomendamos usar a configuração somente picos , que salva apenas os carimbos de data/hora dos potenciais de ação usando uma ferramenta de detecção de pico integrada em vez do traço eletrofisiológico bruto completo por canal. Isso ocorre porque a gravação longa (>10 min) em 1.024 canais pode facilmente resultar em arquivos de dados do tamanho de TB que são tecnicamente difíceis de analisar e retardam drasticamente o progresso da pesquisa. Confirmamos que os dados brutos usando tempos de pico apenas replicam as propriedades espaço-temporais conhecidas das ondas da retina: para as ondas do estágio II, observamos grandes ondas que cobrem a maior parte da retina e ocorrem em frequências que correspondem a relatórios anteriores (ver Figura 2). Observamos que, se o projeto de pesquisa exigir uma análise mais aprofundada das formas de onda de pico, o registro do traço eletrofisiológico bruto é uma necessidade.
    9. Monitore periodicamente a gravação em andamento para garantir que a aquisição de dados esteja ocorrendo conforme o esperado e que o sistema esteja funcionando corretamente.

4. Procedimento de limpeza

  1. Quando a gravação estiver concluída e os dados forem salvos, desligue o aquecedor em linha e desligue o sistema de perfusão.
  2. Remova cuidadosamente a inserção do porta-lenços e extraia o chip MEA. Limpe o cavaco enxaguando-o primeiro com etanol a 70%, seguido de água deionizada (DI).
  3. Para evitar o entupimento da tubulação, lave o sistema de perfusão com água DI por 15 min.

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Resultados

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Gravações de alto rendimento e análise de ondas retinianas com HD-MEAs
Realizamos um registro HD-MEA de uma hora de ondas retinianas espontâneas (Figura 2). Um gráfico raster da atividade neuronal mostra o padrão estruturado das ondas retinianas, onde cada ponto representa um potencial de ação detectado de um eletrodo individual (Figura 2A, abaixo). A soma da atividade entre os eletrodos resulta em um único traço, o que facil...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descrito aqui fornece um método reprodutível e de alto rendimento para preparar o tecido retiniano e realizar gravações HD-MEA, oferecendo um método robusto para estudar a atividade da rede retiniana. A tecnologia HD-MEA oferece vantagens significativas em relação às técnicas eletrofisiológicas e de imagem tradicionais, particularmente na captura de dados de alto rendimento. O HD-MEA oferece registros de precisão em escala de milissegundos em tempo real da dinâmica espontânea...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apoiado pelo NIH concede R00EY030909 para A.T.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pipeta de transferência descartável de 3 mL (com corte final)Fisherbarnd13-711-9CMAuxilia na movimentação da retina entre placas de Petri.
Líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)Mantém as condições fisiológicas para o tecido retiniano; composto de NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glicose e borbulhou com carbogênio.
CaCl2Fisher ChemicalsC79-500Para preparar o líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
Fornecimento de carbogênio (95% O2, 5% CO2)Usado para oxigenar o aCSF e manter a viabilidade do tecido.
Bisturi de lâmina curva (#10)Integra4-110Usado para cortar tecidos com precisão.
Microscópio de dissecção (estereoscópio)ZeissStemi 508Essencial para visualizar e manusear o tecido da retina.
glicoseFisher ChemicalsBP350-1Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
Aquecedor em linhaSistema MulticanalTC02Aquece aCSF a 32-34° C para condições ideais.
Sistema de Perfusão IsmatecIsmatecISM4208Mantém o fluxo contínuo de aCSF oxigenado.
KClFisher ChemicalsP271-500Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
KH2PO4Sigma AldrichP5504-100gPara preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
Unidade de Gravação MaxOneMaxwell BiosystemsMX1-BRDInterface entre o Chip MaxOne e o Sistema
MaxOne SistemaMaxwell BiosystemsSistema MX1-SYSCore para recodificações eletrofisiológicas baseadas em MEA.
MaxOne Tissue Holder com um micromanipulador de 3 eixos e inserções substituíveisMaxwell BiosystemsMX1-HLDGarante a colocação precisa da retina no chip MEA.
Chip MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)Maxwell BiosystemsMX1-S-CHPMatriz de microeletrodos de alta densidade para registro da atividade neuronal.
MgCl2Fisher ChemicalsM33-500Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
NaClFisher ChemicalsS271-1Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
NaHCO3Fisher ChemicalsS233-500Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
Agulha (30 G x ½)BD Biosciences305106Ajuda a fazer incisões na córnea.
Animais neonatais (P1-P14; camundongo)Organismos modelo como camundongos, ratos ou outros usados para estudos de retina.
PC com software MaxLab Live ScopeHPZ4Usado para aquisição de dados e análise de gravações.
Placa de Petri (35 mm ou 60 mm)Pyrex3483E12Utilizado como espaço de trabalho para dissecação.
Pinça Roboz micro Adson (RS-5232, 4,75" de comprimento, 1 x 2 dentes, ponta de 0,5 mm)Pinça RobozRS-5232especializada para dissecção fina.
Tesoura de mola Roboz (RS-5671, borda de corte de 10 mm, largura de ponta de 0,15 mm, 3¾ " comprimento total)RobozRS-5671Tesoura de precisão para cortar tecidos delicados.
de pêlo únicoPincel pequeno modificado para um único pêlo para manusear tecidos delicados.
Duas pinças de ponta finaRobozRS-5060Usado para manuseio de tecidos delicados.
Papéis de filtro Whatman (#1), cortados em pequenos pedaçosGE Healthcare1001-042Usado para manusear e secar tecido retiniano.
Pincel

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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