Gravações de matriz de multieletrodos de alta densidade de ondas retinianas usando uma plataforma de eletrofisiologia

Summary

Matrizes de multieletrodos de alta densidade (HD-MEAs) são usadas para estudar ondas retinianas espontâneas, que desempenham um papel crucial no desenvolvimento do circuito neural. Este protocolo descreve as etapas para preparar o tecido da retina de camundongos e realizar registros eletrofisiológicos usando HD-MEAs em uma plataforma de eletrofisiologia.

Abstract

As ondas retinianas espontâneas são uma marca registrada da atividade da rede retiniana durante o desenvolvimento, desempenhando um papel crucial na formação do sistema visual, influenciando o refinamento dos axônios, a permeabilidade da vasculatura e a maturação geral dos circuitos neurais. Essas ondas são comumente estudadas em preparações retinianas ex vivo usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs), que permitem registros eletrofisiológicos de grandes populações de atividade de células ganglionares da retina (RGC). A eletrofisiologia baseada em MEA tornou-se uma ferramenta poderosa devido à sua facilidade de uso para coletar rapidamente dados de alto rendimento, tornando-a ideal para estudar a atividade da retina em uma variedade de condições experimentais.

Neste protocolo, descrevemos as etapas críticas para a preparação do tecido retiniano para a aquisição de dados eletrofisiológicos usando um MEA de alta densidade (HD-MEA) em uma plataforma de eletrofisiologia. O processo começa com o isolamento cuidadoso de retinas intactas de animais neonatais em condições fisiológicas. Uma vez preparada, a retina é cuidadosamente montada em um chip HD-MEA, que consiste em uma grade de 26.400 eletrodos capazes de realizar gravações extracelulares simultâneas de pelo menos 1.000 RGCs. As gravações podem durar até várias horas. Em última análise, essa abordagem metodológica oferece aplicações valiosas na investigação do desenvolvimento da retina, doenças e estudos comparativos potencialmente entre espécies, contribuindo para avanços mais amplos na pesquisa em neurociência e visão.

Introduction

As ondas espontâneas da retina são explosões periódicas de atividade correlacionada observadas na retina em desenvolvimento antes do início da visão. Em camundongos, os circuitos que iniciam e propagam as ondas da retina mudam rapidamente durante o desenvolvimento, começando embrionicamente e terminando na abertura dos olhos (14º dia pós-natal)¹. À medida que os circuitos retinianos se desenvolvem, as propriedades espaço-temporais das ondas retinianas mudam drasticamente ^2,3. Vários estudos sustentam que essas propriedades espaço-temporais específicas i....

Protocol

Este protocolo descreve as etapas para isolar e preparar o tecido retiniano de camundongos neonatais para gravações MEA de ondas retinianas usando a plataforma HD-MEA da Maxwell Biosystems. O procedimento é projetado para preservar as condições fisiológicas, garantindo que o tecido da retina permaneça estruturalmente intacto, livre de danos e devidamente preparado para o contato ideal com o eletrodo. Esses experimentos foram aprovados pelo Programa de Cuidados e Uso de Animais Vanderbilt, sob o número de protocolo M2200056-00. Os camundongos (1-2 semanas de idade, ambos os sexos) foram alojados em um viveiro de ciclo dia/noite de 12 h....

Results

Gravações de alto rendimento e análise de ondas retinianas com HD-MEAs
Realizamos um registro HD-MEA de uma hora de ondas retinianas espontâneas (Figura 2). Um gráfico raster da atividade neuronal mostra o padrão estruturado das ondas retinianas, onde cada ponto representa um potencial de ação detectado de um eletrodo individual (Figura 2A, abaixo). A soma da atividade entre os eletrodos resulta em um único traço, o que facil.......

Discussion

O protocolo descrito aqui fornece um método reprodutível e de alto rendimento para preparar o tecido retiniano e realizar gravações HD-MEA, oferecendo um método robusto para estudar a atividade da rede retiniana. A tecnologia HD-MEA oferece vantagens significativas em relação às técnicas eletrofisiológicas e de imagem tradicionais, particularmente na captura de dados de alto rendimento. O HD-MEA oferece registros de precisão em escala de milissegundos em tempo real da dinâmica espontânea.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipeta de transferência descartável de 3 mL (com corte final)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Auxilia na movimentação da retina entre placas de Petri.
Líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)			Mantém as condições fisiológicas para o tecido retiniano; composto de NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glicose e borbulhou com carbogênio.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Para preparar o líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
Fornecimento de carbogênio (95% O2, 5% CO2)			Usado para oxigenar o aCSF e manter a viabilidade do tecido.
Bisturi de lâmina curva (#10)	Integra	4-110	Usado para cortar tecidos com precisão.
Microscópio de dissecção (estereoscópio)	Zeiss	Stemi 508	Essencial para visualizar e manusear o tecido da retina.
glicose	Fisher Chemicals	BP350-1	Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
Aquecedor em linha	Sistema Multicanal	TC02	Aquece aCSF a 32-34° C para condições ideais.
Sistema de Perfusão Ismatec	Ismatec	ISM4208	Mantém o fluxo contínuo de aCSF oxigenado.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
Unidade de Gravação MaxOne	Maxwell Biosystems	MX1-BRD	Interface entre o Chip MaxOne e o Sistema
MaxOne Sistema	Maxwell Biosystems	Sistema MX1-SYS	Core para recodificações eletrofisiológicas baseadas em MEA.
MaxOne Tissue Holder com um micromanipulador de 3 eixos e inserções substituíveis	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Garante a colocação precisa da retina no chip MEA.
Chip MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Matriz de microeletrodos de alta densidade para registro da atividade neuronal.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Para preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
Agulha (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Ajuda a fazer incisões na córnea.
Animais neonatais (P1-P14; camundongo)			Organismos modelo como camundongos, ratos ou outros usados para estudos de retina.
PC com software MaxLab Live Scope	HP	Z4	Usado para aquisição de dados e análise de gravações.
Placa de Petri (35 mm ou 60 mm)	Pyrex	3483E12	Utilizado como espaço de trabalho para dissecação.
Pinça Roboz micro Adson (RS-5232, 4,75" de comprimento, 1 x 2 dentes, ponta de 0,5 mm)	Pinça Roboz	RS-5232	especializada para dissecção fina.
Tesoura de mola Roboz (RS-5671, borda de corte de 10 mm, largura de ponta de 0,15 mm, 3¾ " comprimento total)	Roboz	RS-5671	Tesoura de precisão para cortar tecidos delicados.
		de pêlo único	Pincel pequeno modificado para um único pêlo para manusear tecidos delicados.
Duas pinças de ponta fina	Roboz	RS-5060	Usado para manuseio de tecidos delicados.
Papéis de filtro Whatman (#1), cortados em pequenos pedaços	GE Healthcare	1001-042	Usado para manusear e secar tecido retiniano.