Modelo de tecido tridimensional com capacidade de alto rendimento para quantificação de limiares de eletroporação

Summary

Este protocolo usa modelagem computacional para quantificar limiares de eletroporação reversíveis e irreversíveis usando a distribuição espacial de células transfectadas dentro de uma imitação de tecido tridimensional para análise de alto rendimento de protocolos de eletroporação.

Abstract

A eletroporação é uma tecnologia promissora que utiliza pulsos elétricos para entrega de macromoléculas e ablação de tecidos moles, com aplicações que incluem profilaxia de última geração e o tratamento de doenças genéticas, como o câncer. Este estudo demonstra um modelo de cultura de tecidos 3D com capacidade de alto rendimento para quantificação dos limiares de eletroporação reversíveis e irreversíveis para um determinado protocolo de eletroporação. Usando um campo elétrico não uniforme e analisando a distribuição espacial das células transfectadas, os limiares reversíveis e irreversíveis podem ser identificados dentro de uma única amostra, aumentando a eficiência na qual os protocolos de eletroporação podem ser caracterizados, especialmente para tradução in vivo . Para mostrar essa capacidade, imitadores de tecido 3D contendo células HEK293 foram transfectados usando um eletrodo de anel e pino para fornecer um plasmídeo codificador de GFP. Os limiares de eletroporação foram então derivados com base em imagens de microscopia fluorescente das amostras transfectadas. Este modelo demonstra potencial para uso como meio de avaliação de alto rendimento de protocolos de eletroporação, uma vantagem importante sobre os métodos atuais para avaliar esses limites, que tendem a ser demorados e menos representativos das condições in vivo .

Introduction

A eletroporação reversível (ER) é uma metodologia bem estabelecida para fornecer uma variedade de compostos e moléculas normalmente impermeáveis à membrana nas células ^1,2,3. Aqui, campos elétricos pulsados (PEFs) são usados para atingir uma intensidade de campo elétrico crítico que induz nanoporos transitórios e localizados ao longo de porções da membrana celular. O ER tem sido usado para fornecer uma variedade de moléculas e compostos que vão desde corantes e ácidos nucléicos até quimioterápicos e outras drogas^<....

Protocol

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação celular

1. Em um gabinete de biossegurança, a placa 1 × 10⁵ células/mL da linhagem celular HEK293 em um volume de 10 mL por frasco T75 de cultura de tecidos em meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Incubar células HEK293 em uma incubadora umidificada a 37 ° C com ambiente de 5% de CO₂ .
3. Colha células para experimentos 2 dias após a semeadura, ....

Results

O eletrodo de anel e pino entregou com sucesso um plasmídeo de DNA que codifica uma proteína fluorescente verde (GFP) em imitadores de tecido de colágeno 3D incorporados com células HEK293. A quantificação bem-sucedida do limiar de ER foi alcançada medindo o raio externo da região transfectada e derivando a intensidade de campo correspondente do modelo computacional da configuração experimental, conforme visto na Figura 2. O limiar de IRE foi quantificado de .......

Discussion

Com este método, os limiares de eletroporação reversíveis e irreversíveis podem ser identificados sem a necessidade de testar várias amostras em tensões discretas. O uso de um campo elétrico não uniforme permite a quantificação com base na distribuição espacial das células transfectadas no modelo. No entanto, existem limitações associadas a essa distribuição não uniforme. Em primeiro lugar, os limiares de RE e IRE descritos aqui são os limiares para transfecção bem-sucedida e morte celul.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% de tripsina-EDTA	Gibco	25200056
Ponteiras de pipeta de 1000 uL	Fisher Científico	13-811-164
Tubo cônico de 15 mL	Fisher Científico	14-959-70C
Ponteiras de pipeta de 200 uL	Fisher Científico	13-811-139
Agulhas de ponta romba de aço inoxidável 304	McMaster Carr	Rolamento 75165A753
Tubulação de aço inoxidável 316	McMaster Carr	Rolamento 89785K319
Acrílico	McMaster Carr	8505K754
Gabinete de Biossegurança	Fisher Científico	13-261-312
Software CAD	Sistemas Dassault	SolidWorks
Centrifuga	Nuaire	NU-C200R
Eletroporador	Hbio	45-0662	Um dispositivo personalizado e um sistema BTX ECM 830 foram usados neste estudo
EMEM	Fisher Científico	MT10009CV	Isso pode variar  se estiver usando uma linha celular diferente de HEK293
Placa de Cultura de Células Multipoços Falcon de 12 poços com TC de Fundo Plano Transparente, com Tampa	Corning	353043	Qualquer placa de 12 poços pode ser usada, apenas certifique-se de que as dimensões do poço sejam levadas em consideração ao fabricar o suporte do eletrodo.
FBS	Fisher Científico	A5670701
Sonda de temperatura de fibra óptica	Micronor Inc.	TS5-20MM-02
Plasmídeo GFP	Aldeveron	gWiz-GFP
Células HEK293	ATCC	CRL-1573	Outras linhagens celulares podem ser usadas, apenas certifique-se de que o meio de cultura correto seja usado
Placa quente	Corporação Americana de Resfriamento Termoelétrico	AHP-301CPV
Banho de gelo ou refrigerado	Fisher Científico	10-876-001
Software de análise de imagens	Leica	LAS X
Incubadora	Fisher Científico	15-015-2633
Microscópio de fluorescência invertida	Leica	DMi8
Cortador a laser	McMaster Carr	7344N11
Penicilina-estreptomicina	Fisher Científico	15140122
Kit de pipeta	Fisher Científico	14-388-100
Software de simulação	COMSOL	COMSOL Multifísica 6.2
Frasco T75	Fisher Científico	156499
Solução de colágeno bovino tipo I	Biomatriz Avançada	5005	3 mg/ml