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Artigo de método

Modelo de tecido tridimensional com capacidade de alto rendimento para quantificação de limiares de eletroporação

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DOI:

10.3791/68494

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19 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo usa modelagem computacional para quantificar limiares de eletroporação reversíveis e irreversíveis usando a distribuição espacial de células transfectadas dentro de uma imitação de tecido tridimensional para análise de alto rendimento de protocolos de eletroporação.

Resumo

A eletroporação é uma tecnologia promissora que utiliza pulsos elétricos para entrega de macromoléculas e ablação de tecidos moles, com aplicações que incluem profilaxia de última geração e o tratamento de doenças genéticas, como o câncer. Este estudo demonstra um modelo de cultura de tecidos 3D com capacidade de alto rendimento para quantificação dos limiares de eletroporação reversíveis e irreversíveis para um determinado protocolo de eletroporação. Usando um campo elétrico não uniforme e analisando a distribuição espacial das células transfectadas, os limiares reversíveis e irreversíveis podem ser identificados dentro de uma única amostra, aumentando a eficiência na qual os protocolos de eletroporação podem ser caracterizados, especialmente para tradução in vivo . Para mostrar essa capacidade, imitadores de tecido 3D contendo células HEK293 foram transfectados usando um eletrodo de anel e pino para fornecer um plasmídeo codificador de GFP. Os limiares de eletroporação foram então derivados com base em imagens de microscopia fluorescente das amostras transfectadas. Este modelo demonstra potencial para uso como meio de avaliação de alto rendimento de protocolos de eletroporação, uma vantagem importante sobre os métodos atuais para avaliar esses limites, que tendem a ser demorados e menos representativos das condições in vivo .

Introdução

A eletroporação reversível (ER) é uma metodologia bem estabelecida para fornecer uma variedade de compostos e moléculas normalmente impermeáveis à membrana nas células 1,2,3. Aqui, campos elétricos pulsados (PEFs) são usados para atingir uma intensidade de campo elétrico crítico que induz nanoporos transitórios e localizados ao longo de porções da membrana celular. O ER tem sido usado para fornecer uma variedade de moléculas e compostos que vão desde corantes e ácidos nucléicos até quimioterápicos e outras drogas 4,5,6,7,8,9,10. No entanto, se a intensidade do campo elétrico for aumentada o suficiente, ela pode atingir um limite crítico mais alto, o que resulta em um rápido declínio na viabilidade celular 1,2,11,12. Esse processo é conhecido como eletroporação irreversível (IRE) e tem sido estudado para ablação de tecidos moles, inclusive como tratamento para tumores inoperáveis e arritmias cardíacas 11,12,13,14,15,16. Para entender os resultados do tratamento e informar tratamentos futuros, a quantificação desses limiares de RE e IRE é uma prática comum na pesquisa de eletroporação 12,17,18,19,20. No entanto, os limiares de RE e IRE variam dependendo de muitos fatores, incluindo tipo de célula, tensão aplicada, duração do pulso, número de pulsos e taxa de entrega de pulso 1,17,18,21,22.

Os protocolos de eletroporação têm uma série de parâmetros que resultam em limiares de ER e IRE variados 1,17,18,21,22. As tensões e formas de onda de tratamento ideais têm sido investigadas há muito tempo. A maioria das tecnologias de eletroporação disponíveis comercialmente utiliza protocolos com PEFs monopolares da ordem de 100 μs-10 ms23. Embora esses protocolos alcancem resultados clinicamente relevantes, eles induzem intensas contrações musculares in vivo 24,25,26. Por isso, pulsos de microssegundos bipolares mais curtos, que aliviam essa estimulação, tornaram-se um tópico de interesse recente 1,11,24. No entanto, esses pulsos introduzem novos fatores que afetam os limiares de ER e IRE, incluindo simetria de pulso, duração da explosão e dependência da temperatura 1,17,22,27. Além disso, o tipo de célula e as propriedades do tecido também demonstraram afetar significativamente os resultados de RE e IRE 19,28,29. À medida que o campo continua a evoluir, é necessário caracterizar ainda mais como esses fatores e suas interações entre si e outros possíveis fatores ambientais afetam os limites de ER e IRE, tornando cada vez mais necessário melhorar a eficiência experimental para permitir experimentos de maior rendimento.

Experimentos típicos de eletroporação in vitro testam protocolos tratando células em uma cubeta com placas condutoras paralelas, o que resulta em uma distribuição uniforme do campo elétrico dentro da cubeta durante o tratamento 19,30,31,32,33,34. Como mencionado anteriormente, é necessário identificar os limiares de RE e/ou IRE de um protocolo para identificar uma tensão aplicada ideal para um determinado tratamento. Para que isso seja alcançado em estudos de cubetas, várias cubetas devem ser tratadas, cada uma com tensões aplicadas discretas. Isso requer um número significativo de amostras que devem ser preparadas, tratadas e analisadas separadamente, limitando o rendimento experimental. Para melhorar esse processo, modelos de cultura 2D35,36 e 3D 13,20,27,37,38,39 foram desenvolvidos para avaliar um continuum de intensidades de campo em uma única amostra usando eletrodos que criam distribuições de campo não uniformes 13,20,27,37,38,39. Os limiares RE e IRE são então derivados de modelos computacionais da distribuição do campo elétrico 13,20,27,37,38. Isso reduz muito o número de amostras necessárias, permitindo uma abordagem de alto rendimento para quantificação de limites.

Este artigo tem como objetivo demonstrar essa abordagem para quantificação de campo RE e IRE em um modelo 3D in vitro para demonstrar seu potencial como um meio de avaliação eficiente de protocolos de eletroporação em vários ambientes (por exemplo, tipos de células, parâmetros de tratamento, moléculas a serem entregues).

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Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação celular

  1. Em um gabinete de biossegurança, a placa 1 × 105 células/mL da linhagem celular HEK293 em um volume de 10 mL por frasco T75 de cultura de tecidos em meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Incubar células HEK293 em uma incubadora umidificada a 37 ° C com ambiente de 5% de CO2 .
  3. Colha células para experimentos 2 dias após a semeadura, removendo o meio de cultura e tratando as células com 4 mL de tripsina-EDTA a 0,25%.
  4. Incube as células e a tripsina por 3-5 min em uma incubadora umidificada a 37 ° C com ambiente de 5% de CO2 ou até que as células se desprendam da superfície da cultura.
  5. Inative a atividade enzimática da tripsina adicionando 4 mL do meio de cultura.
  6. Células em pellets centrifugando por 5 min a 180 × g e ressuspendendo em meio de cultura até uma concentração final de 8 × 106 células/mL.

2. 3D criação de modelos de tecidos

NOTA: Use pipetagem reversa para essas etapas para evitar a introdução de bolhas de ar na mistura.

  1. Em um gabinete de biossegurança, misture bem a suspensão de células preparada de 8 ×10 6 células/mL com solução de colágeno bovino tipo I (3 mg/mL) na proporção de 1:1. Coloque no gelo ou em um banho de esferas frias para evitar a polimerização prematura ao trabalhar com a mistura.
  2. Pipetar 500 μL da solução combinada para revestir o fundo de cada alvéolo de uma placa de 12 poços. Certifique-se de que o gel cubra o fundo uniformemente, começando a dispensar a solução no centro do poço e, em seguida, espiralando suavemente para fora.
  3. Gire suavemente a placa para garantir que as bordas do gel entrem em contato com as paredes do poço.
  4. Incubar os géis numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2 durante 6 h ou até que os géis fiquem firmes e não se movam ao inclinar a placa.
  5. Incline a placa do poço e adicione suavemente 500 μL de meio de cultura a cada poço, deixando-o deslizar pela parede da placa pelo menos 1 h antes do tratamento. Os géis devem ser tratados dentro de 48 h após a criação.

3. Fabricação de eletrodos

  1. Remova a conexão Luer de plástico em duas agulhas de seringa de ponta romba de aço inoxidável 304 de 1.64 mm. Reserve uma agulha para servir como eletrodo de pino. Para a outra agulha, alise os últimos 5 mm de uma extremidade.
  2. Crie o eletrodo de anel cortando uma seção de tubo de aço inoxidável 316 de 19 mm de diâmetro externo que seja longa o suficiente para ficar nivelada com o fundo da placa do poço.
  3. Projete um suporte de eletrodo como visto na Figura 1 com software CAD. Certifique-se de que o suporte tenha um orifício central para o eletrodo do pino, uma ranhura para o eletrodo do anel e um orifício que cruze a ranhura para que a agulha achatada possa ser inserida para criar um ajuste de pressão que mantenha o eletrodo do anel no lugar.
    1. Além disso, certifique-se de que o suporte tenha um lábio projetado para se encaixar perfeitamente em uma placa de 12 poços e centralizar os eletrodos de anel e pino no poço, de modo que os eletrodos e o poço sejam todos coaxiais38.
  4. Fabrique o porta-eletrodo de acrílico usando técnicas estabelecidas de corte a laser40.
  5. Monte o eletrodo encaixando os eletrodos de anel e pino no suporte do eletrodo.
  6. Prenda o eletrodo do anel encaixando a agulha com uma extremidade achatada no suporte.

4. Tratamento de modelo de tecido 3D com eletroporação

  1. Em um gabinete de biossegurança, incline a placa e aspire 400 μL de meios de cultura de cada poço. Tome cuidado para não entrar em contato com o gel. Devem ser deixados 100 μL de meio em cada poço aspirado para manter a hidratação do gel. Se houver menos de 400 μL de fluido para aspirar (a pipeta não deixa fluido/aspira ar), adicione 100 μL de meio de cultura.
  2. Adicione 20 μL de solução de plasmídeo GFP de 5 μg/μL a esses poços aspirados (para um volume total de 120 μL por poço) inclinando a placa e adicionando o reagente ao fluido que se acumula contra a parede de cada poço. Gire suavemente para garantir que se espalhe uniformemente pela superfície do gel.
  3. Incubar os géis em uma incubadora umidificada a 37 °C com ambiente de 5% de CO2 por 10 min.
  4. Insira a sonda de temperatura de fibra óptica no eletrodo do pino e comece a ler a temperatura.
  5. Conecte o fio positivo do eletroporador ao eletrodo do pino e o fio negativo à agulha que prende o eletrodo do anel.
  6. Ligue a placa de aquecimento e aqueça os géis para que mantenham uma temperatura de 37 °C.
  7. Insira o eletrodo de anel e pino com sonda de temperatura de fibra óptica no pino no poço. Certifique-se de que o pino esteja perpendicular à placa e que ambos os eletrodos estejam totalmente em contato com o gel.
  8. Certifique-se de que o gel esteja a 37 °C.
  9. Entregue tratamento de eletroporação.
  10. Adicione 100 μL de meio a qualquer gel que pareça seco.
  11. Repita as etapas 4.7 a 4.10.
  12. Quando todos os tratamentos estiverem concluídos, incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 °C com ambiente de 5% de CO2 por 10 min.
  13. Incline a placa do poço e adicione suavemente 500 μL de meio de cultura a cada poço, permitindo que ele deslize pela parede da placa.
  14. Incubar os géis em uma incubadora umidificada a 37 °C com ambiente de 5% de CO2 por 24 h.

5. Lavagem e imagem

  1. Incline a placa e aspire os meios de cultura de cada poço. Tome cuidado para não entrar em contato com o gel.
  2. Incline a placa e adicione suavemente 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cada poço, permitindo que ele deslize pela parede da placa.
  3. Incubar os géis em uma incubadora umidificada a 37 °C com ambiente de 5% de CO2 por 5 min.
  4. Incline a placa e aspire o PBS de cada poço. Tome cuidado para não entrar em contato com o gel.
  5. Incline a placa e adicione suavemente 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cada poço, permitindo que ele deslize pela parede da placa.
  6. Gire suavemente a placa, incline-a e aspire o PBS de cada poço. Tome cuidado para não entrar em contato com o gel.
  7. Adicione 100 μL de PBS fresco para manter os géis hidratados para a imagem.
  8. Placa de imagem usando técnicas padrão de microscopia fluorescente. Isso deve produzir imagens de géis com uma região verde distinta em forma de toro, onde os limiares de campo elétrico reversível e irreversível limitam as bordas externa e interna da região, respectivamente.
  9. Incline a placa do poço e adicione suavemente 500 μL de meio de cultura a cada poço, permitindo que ele deslize pela parede da placa.
  10. Incubar os géis em uma incubadora umidificada a 37 °C com ambiente de 5% de CO2 por 24 h.
  11. Repita as etapas 5.1 a 5.10 para cada ponto de tempo.

6. Criação de modelos computacionais

  1. Abra um software de simulação de física e crie um novo modelo axissimétrico 2D que utilize a física de Correntes Elétricas, Transferências de Calor em Sólidos e Aquecimento Eletromagnético.
  2. Crie parâmetros para a tensão, temperatura ambiente, temperatura da placa quente, ponto de ajuste de temperatura, taxa de entrega de pulso, dose elétrica integrada e dimensões dos eletrodos de anel e pino, o gel e a placa de poço da configuração experimental.
  3. Crie geometrias de domínio que representem uma seção transversal radial dos eletrodos de anel e pino, o gel e a placa de poço da configuração experimental, conforme visto na Figura 2A.
  4. Coloque um ponto de sonda dentro do eletrodo central na metade da altura do gel para representar a sonda de temperatura de fibra óptica usada durante a experimentação in vitro.
  5. Crie uma função por partes que use a temperatura como argumento de entrada.
  6. Defina a função de forma que seu valor seja 1 quando a temperatura for menor que o parâmetro de ponto de ajuste de temperatura definido na etapa 6.2 e 0 caso contrário.
  7. Aplique uma condição de contorno de tensão à superfície superior da geometria do domínio que representa o eletrodo de pino e defina o valor da tensão para o parâmetro de tensão definido na etapa 6.2 multiplicado pela função por partes da etapa 6.6 avaliada na temperatura do ponto de sonda criado na etapa 6.4.
  8. Aplique uma condição de limite de terra à superfície superior da geometria do domínio que representa o eletrodo do anel.
  9. Aplique uma condição de limite de isolamento elétrico a todos os limites de domínio restantes.
  10. Crie uma função contínua que use temperatura.
  11. Defina a função usando um modelo estabelecido27 da condutividade dependente da temperatura do gel de colágeno como 0,8277 + 0,0323 * T.
  12. Defina um material personalizado e defina a condutividade elétrica para a função contínua definida na etapa 6.11. Aplique este material ao domínio do gel.
  13. Defina materiais ou use padrões de software, se disponíveis, para atribuir materiais de aço inoxidável 304 e 316 aos domínios de eletrodo de pino e anel, respectivamente, e poliestireno aos domínios de placa de poço.
  14. Aplique uma condição de limite de temperatura à base do modelo e defina o valor da temperatura para 37 °C.
  15. Aplique uma condição de limite de radiação ambiente de superfície a todas as outras arestas de domínio que não interagem com outro domínio e defina a emissividade para 0,97, 0,9 e 0,075, dependendo se o domínio fazia parte da placa, gel ou eletrodo, respectivamente27.
  16. Adicione uma malha triangular livre ao modelo. Defina o tamanho do elemento como Mais fino.
  17. Se estiver avaliando uma variedade de níveis de parâmetro, crie uma varredura paramétrica que liste todos os valores nos quais um parâmetro deve ser avaliado.
  18. Execute a simulação clicando no botão Calcular .
  19. Após a conclusão, crie um Gráfico de Linha de Corte 2D do campo elétrico na seção Resultados.
  20. Defina a linha de corte a ser passada do eletrodo de pino para o eletrodo de anel através do meio do domínio do gel. Isso deve resultar em um decaimento exponencial da borda do eletrodo do pino para a borda do eletrodo do anel.
  21. Exporte os dados de plotagem como um arquivo .csv ou .xlsx para criar uma tabela de pesquisa.

7. Derivação de limite

  1. Usando o software do microscópio, meça o diâmetro das bordas externa e interna da região em forma de toro ao longo dos eixos vertical e horizontal. Se o software não tiver esse recurso, use o ImageJ para fazer isso.
  2. Calcule a média dos diâmetros externo e interno, respectivamente, e divida por dois para calcular os raios externo e interno da região em forma de toro. O raio externo demarca o limite de RE. O raio interno demarca o limite de IRE.
  3. Usando a tabela de pesquisa criada na etapa 6.21, derive a intensidade do campo elétrico nos raios medidos.

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Resultados

O eletrodo de anel e pino entregou com sucesso um plasmídeo de DNA que codifica uma proteína fluorescente verde (GFP) em imitadores de tecido de colágeno 3D incorporados com células HEK293. A quantificação bem-sucedida do limiar de ER foi alcançada medindo o raio externo da região transfectada e derivando a intensidade de campo correspondente do modelo computacional da configuração experimental, conforme visto na Figura 2. O limiar de IRE foi quantificado de ...

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Discussão

Com este método, os limiares de eletroporação reversíveis e irreversíveis podem ser identificados sem a necessidade de testar várias amostras em tensões discretas. O uso de um campo elétrico não uniforme permite a quantificação com base na distribuição espacial das células transfectadas no modelo. No entanto, existem limitações associadas a essa distribuição não uniforme. Em primeiro lugar, os limiares de RE e IRE descritos aqui são os limiares para transfecção bem-sucedida e morte celul...

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Divulgações

Os autores não têm divulgações.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado na Universidade Estadual da Carolina do Norte e financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01CA272550).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina-EDTAGibco25200056
Ponteiras de pipeta de 1000 uLFisher Científico13-811-164
Tubo cônico de 15 mLFisher Científico14-959-70C
Ponteiras de pipeta de 200 uLFisher Científico13-811-139
Agulhas de ponta romba de aço inoxidável 304McMaster CarrRolamento 75165A753
Tubulação de aço inoxidável 316McMaster CarrRolamento 89785K319
AcrílicoMcMaster Carr8505K754
Gabinete de BiossegurançaFisher Científico13-261-312
Software CADSistemas DassaultSolidWorks
CentrifugaNuaireNU-C200R
EletroporadorHbio45-0662Um dispositivo personalizado e um sistema BTX ECM 830 foram usados neste estudo
EMEMFisher CientíficoMT10009CVIsso pode variar  se estiver usando uma linha celular diferente de HEK293
Placa de Cultura de Células Multipoços Falcon de 12 poços com TC de Fundo Plano Transparente, com TampaCorning353043Qualquer placa de 12 poços pode ser usada, apenas certifique-se de que as dimensões do poço sejam levadas em consideração ao fabricar o suporte do eletrodo.
FBSFisher CientíficoA5670701
Sonda de temperatura de fibra ópticaMicronor Inc.TS5-20MM-02
Plasmídeo GFPAldeverongWiz-GFP
Células HEK293ATCCCRL-1573Outras linhagens celulares podem ser usadas, apenas certifique-se de que o meio de cultura correto seja usado
Placa quenteCorporação Americana de Resfriamento TermoelétricoAHP-301CPV
Banho de gelo ou refrigeradoFisher Científico10-876-001
Software de análise de imagensLeicaLAS X
IncubadoraFisher Científico15-015-2633
Microscópio de fluorescência invertidaLeicaDMi8
Cortador a laserMcMaster Carr7344N11
Penicilina-estreptomicinaFisher Científico15140122
Kit de pipetaFisher Científico14-388-100
Software de simulaçãoCOMSOLCOMSOL Multifísica 6.2
Frasco T75Fisher Científico156499
Solução de colágeno bovino tipo IBiomatriz Avançada50053 mg/ml

Referências

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