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Artigo de método

Abordagem escalável passo a passo da produção sustentável de bioplástico a partir de resíduos alimentares

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DOI:

10.3791/68499

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18 de julho de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Quasar Energy Group, 3Department of Environmental Science and Technology, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método escalável para converter resíduos alimentares em bioplásticos biodegradáveis de polihidroxialcanoato (PHA). Ele utiliza digestão anaeróbica parada para pré-tratamento de resíduos alimentares, fermentação microbiana halofílica para biossíntese de PHA e um processo downstream livre de produtos químicos para recuperação de PHA.

Resumo

A crise global dos microplásticos, juntamente com os crescentes desafios do descarte de resíduos alimentares, exige soluções inovadoras para abordar essas questões ambientais em conjunto. Os polihidroxialcanoatos (PHAs) são bioplásticos únicos que são totalmente biodegradáveis em todos os ambientes, incluindo ecossistemas marinhos, oferecendo uma alternativa sustentável aos plásticos à base de petróleo. Ao mesmo tempo, a utilização de resíduos alimentares como matéria-prima para a produção de PHA fornece uma estratégia eficaz para mitigar os desafios do descarte de resíduos alimentares enquanto produz plásticos biodegradáveis de alto valor. Este estudo fornece um protocolo passo a passo para a produção de PHA a partir de resíduos alimentares, enfatizando os cuidados críticos necessários para garantir alto teor e qualidade de PHA celular. O processo começa com a digestão anaeróbica interrompida, que converte os resíduos alimentares em ácidos graxos voláteis (AGV) microbianamente assimiláveis, mantendo um ambiente anaeróbico e otimizando parâmetros, como o tempo de retenção de sólidos, para maximizar a produção de AGV, um precursor chave para a síntese de PHA. O digerido rico em AGV é então usado para cultivar Haloflex mediterranei, um microrganismo halofílico capaz de acumular PHA até 66% ± 5% de seu peso de células secas. O ambiente de cultivo de alta salinidade de H. mediterranei evitou a contaminação da cultura, garantindo a produção ideal de PHA. O crescimento celular é monitorado medindo a densidade óptica para determinar o momento ideal para a colheita de PHA. As células são lisadas usando um método à base de água sem produtos químicos, aproveitando um gradiente de pressão osmótica, alcançando 93% ± 3% de recuperação de PHA, seguido de purificação de PHA à base de solvente para obter uma pureza de PHA de 96% ± 2%. Cada etapa é vital para garantir a produção de plásticos biodegradáveis de alta qualidade. Este artigo fornece métodos detalhados para digestão anaeróbica interrompida, fermentação de cultura pura, lise celular livre de produtos químicos e purificação de PHA à base de solvente, oferecendo uma abordagem escalável e sustentável para converter resíduos de alimentos em bioplásticos biodegradáveis adequados para aplicações piloto e em escala real.

Introdução

A poluição plástica e o descarte de resíduos alimentares são preocupações ambientais crescentes, destacando a necessidade de abordagens inovadoras que abordem os desafios por meio da gestão sustentável de resíduos e do desenvolvimento de materiais1. Os plásticos convencionais à base de petróleo são os principais contribuintes para a poluição ambiental e a contaminação por microplásticos, persistindo em aterros sanitários e ecossistemas aquáticos há séculos2. Os polihidroxialcanoatos (PHAs), uma classe de bioplásticos microbianos, oferecem uma alternativa totalmente biodegradável com propriedades mecânicas comparáveis aos plásticos convencionais, garantindo a degradação completa em ambientes naturais3. No entanto, os altos custos de produção dos PHAs continuam sendo uma barreira significativa para a adoção comercial generalizada4. Uma abordagem promissora para superar essa limitação é alavancar os resíduos orgânicos como uma fonte de carbono econômica para a biossíntese microbiana de PHA, já que a matéria-prima é responsável por aproximadamente 50% das despesas totais de produção nos processos industriais atuais que dependem de fontes de carbono puro, como amido de milho ou glicose5. Ao valorizar os resíduos, essa abordagem não apenas desvia o material orgânico dos aterros sanitários, mas também o transforma em uma alternativa sustentável aos plásticos à base de petróleo, abordando simultaneamente o acúmulo de resíduos e as questões de poluição plástica.

H. mediterranei, um microrganismo halofílico, demonstra grande potencial para a utilização de matérias-primas derivadas de resíduos para a produção de PHA devido à sua capacidade de prosperar em condições de alta salinidade (2-5 M NaCl), o que naturalmente previne a contaminação ao inibir o crescimento de micróbios não halofílicos6. Este ambiente de alta salinidade elimina a necessidade de esterilização rigorosa na fermentação industrial, reduzindo os custos operacionais. Ao contrário dos produtores tradicionais de PHA bacteriano, H. mediterranei metaboliza eficientemente uma gama diversificada de fontes de carbono derivadas de resíduos e foi relatado que acumula PHA em até 70% de seu peso de células secas (DCW) como um mecanismo de resposta ao estresse 7,8. Além disso, seu ambiente de alta salinidade permite um processamento simples a jusante, pois o choque osmótico induzido pela imersão em água efetivamente interrompe as células, permitindo a liberação de PHA sem a necessidade de tratamentos enzimáticos ou químicos9. Essas vantagens posicionam H. mediterranei como um candidato ideal para a produção escalável de bioplástico à base de resíduos.

Os estudos existentes exploraram vários resíduos, incluindo soro de queijo, águas residuais de moinhos de azeite e resíduos agroindustriais, para fermentação de PHA por H. mediterranei 6,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . A alta variabilidade da composição dos resíduos apresenta um desafio significativo, exigindo diferentes estratégias de pré-tratamento, como hidrólise enzimática, hidrólise ácida ou processamento térmico, antes da assimilação microbiana 11,17,19,20. Aqui, a digestão anaeróbica parada (aAD) fornece uma solução escalável, convertendo diversos resíduos alimentares em um digerido homogêneo rico em ácidos graxos voláteis (VFA), servindo como um precursor direto para a síntese de PHA por H. mediterranei21,22. Esse processo aumenta a consistência da matéria-prima e mitiga a variabilidade do substrato, melhorando a eficiência da fermentação microbiana.

Apesar de seu potencial, apenas alguns estudos demonstraram com sucesso esse processo de dois estágios integrando aAD e fermentação microbiana de PHA para conversão geral de resíduos alimentares em bioplástico por H. mediterranei 23,24,25. Este estudo fornece um protocolo passo a passo detalhado que abrange o pré-tratamento de resíduos alimentares, a produção de AGV por AAD semicontínuo e a fermentação de cultura pura de H. mediterranei para a produção de PHA. Além disso, embora estudos anteriores tenham validado a extração de PHA à base de água de H. mediterranei, nenhum quantificou a eficiência e a pureza da recuperação de PHA usando este método11,18. Este estudo aborda essa lacuna demonstrando o método de recuperação de PHA livre de produtos químicos utilizando lise osmótica com água e quantificando sua eficiência de recuperação em comparação com os métodos tradicionais de recuperação de PHA à base de hipoclorito de sódio (NaClO)26. Além disso, este estudo avalia a pureza do PHA recuperado com água, fornecendo uma avaliação abrangente de sua eficácia para a produção escalável de bioplástico.

Para preencher a lacuna entre a viabilidade em escala laboratorial e a implementação industrial, este protocolo foi projetado para escalabilidade em aplicações industriais, incorporando fermentação aAD e PHA em escala piloto, juntamente com centrifugação de disco para separação celular, uma técnica amplamente utilizada em bioprocessamento e fermentação microbiana em larga escala27. Ao otimizar a conversão de resíduos alimentares em bioplástico, este método apoia a industrialização da valorização de resíduos em larga escala, avançando iniciativas de bioeconomia circular. A integração de matérias-primas derivadas de resíduos, fermentação halofílica e uma estratégia de recuperação de PHA ecologicamente correta permite a conversão eficiente de resíduos em biopolímeros, reduzindo a dependência de plásticos à base de combustíveis fósseis e promovendo a produção sustentável de bioplásticos.

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Protocolo

1. Coleta e preparação de resíduos alimentares

  1. Colete resíduos de alimentos de restaurantes locais, conforme mostrado na Figura 1A. Avalie visualmente os resíduos obtidos. As observações revelaram que os resíduos consistiam principalmente em cascas de vegetais, carne crua descartada e componentes ricos em carboidratos, como arroz e macarrão. A proporção carbono/nitrogênio (C: N) pode precisar ser medida conforme detalhado nas etapas 5.1 e 5.2 e ajustada se o desperdício de alimentos for predominantemente rico em carbono, com uma proporção ideal de C: N próxima a 20: 128.
  2. Coloque 10 kg de resíduos alimentares em um balde de 5 galões e adicione 2,5 L de água. Conecte o liquidificador a uma fonte de alimentação. Mergulhe a lâmina na mistura de resíduos de alimentos e água e pressione o botão Iniciar para começar a misturar. Misture por pelo menos 30 min até ficar totalmente homogeneizado (Figura 1B). Mova a lâmina para cima e para baixo para garantir uma mistura completa dos resíduos alimentares.
    CUIDADO: Para evitar o superaquecimento, o botão Iniciar do liquidificador pode precisar ser liberado por 1 minuto após cada 2 minutos de operação.
  3. Após a mistura, retire o liquidificador e limpe-o com água quente e detergente. Cobrir o balde com uma tampa, rotular o balde com o nome da amostra e a data de preparação e guardá-lo a 4 °C, se não for utilizado imediatamente.
    NOTA: Devido às variações nas propriedades dos resíduos alimentares coletados de diferentes fontes e tempos, os parâmetros básicos da pasta preparada, como sólidos totais (TS) e sólidos voláteis (VS), devem ser medidos com base na etapa 5.1 após cada preparação para garantir entradas precisas de TS e VS para uso posterior. Neste protocolo, 4 °C é para armazenamento de curto prazo (menos de 7 dias) e -20 °C é usado para armazenamento de longo prazo.

figure-protocol-1
Figura 1: Comparação visual do desperdício de alimentos em restaurantes antes e depois da homogeneização. As fotografias mostram (A) resíduos de alimentos crus e (B) lama homogeneizada de resíduos de alimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Produção de VFA através de aAD

  1. Funcionamento de um digestor aAD à escala piloto (100 l) (Figura 2A) para conversão de resíduos alimentares em AGV.
    1. Verifique a conexão de energia e a estanqueidade do digestor piloto aAD. Regular a temperatura do digestor a 35 °C e a velocidade de agitação a 150 rpm.
    2. Pressione o botão Levantar para levantar a tampa do digestor. Pare quando a tampa subir cerca de 40 cm pressionando o botão Parar .
    3. Adicionar a cultura coletada de um digestor de sementes aAD no digestor piloto aAD até atingir um volume de trabalho de 80 L. Informações detalhadas sobre o digestor de sementes podem ser encontradas em um estudo anterior25.
    4. Pressione o botão inferior até que a tampa esteja totalmente fechada e, em seguida, prenda-o com o clamps. Isso garante que o digestor mantenha as condições anaeróbicas.
    5. Neste estudo, um tempo de retenção sólido (SRT) de 9 dias foi mantido no digestor aAD. Alimente e descarregue 1/3 do volume de trabalho do digestor (aproximadamente cerca de 26.7 L) a cada 3 dias, conforme descrito abaixo.
      NOTA: A digestão anaeróbia tradicional é operada com um SRT de 14-30 dias para a produção de metano29,30. Um SRT curto de 9 dias é empregado aqui para inibir a metanogênese, promovendo o acúmulo de AGV para um aAD bem-sucedido.
    6. Descarga de uma parte do conteúdo de aAD antes da alimentação. Para facilitar a descarga e evitar entupimentos, aumente temporariamente a velocidade de agitação do digestor de 150 rpm para 200 rpm e mantenha essa velocidade por 20 minutos antes de descarregar.
      NOTA: O aumento da velocidade de agitação garante uma distribuição uniforme das partículas sólidas no digerido, facilitando a descarga e a amostragem homogênea.
    7. Abra a válvula de descarga na parte inferior do digestor piloto aAD e descarregue 1/3 do volume de trabalho do digerido. Coletar o digerido descarregado em baldes e armazená-los a 4 °C para análise de VFA e subsequente separação sólido-líquido na etapa 2.2.
    8. Use uma taxa de carga orgânica (OLR) de 2,5 g VS / L-dia, e o VS da pasta de resíduos alimentares foi em média ~ 14,5% (Tabela 1). Para isso, são necessários 4,1 kg de peso úmido da pasta de resíduos alimentares com base na Equação 1 para atingir o OLR projetado. Prove esta pasta de 4,1 kg e coloque-a em um balde separado para alimentação posterior.
      Peso úmido do chorume de resíduos alimentares a ser alimentado = figure-protocol-2 (1)
      em que o OLR é de 2,5 g VS/L-dia, o intervalo de alimentação é de 3 dias, o volume de trabalho é de 80 L e o VS é de 14,5%.
    9. Adicione água a um balde separado contendo a pasta de resíduos alimentares de 4,1 kg de peso úmido mencionada acima até atingir o volume calculado a partir da Equação 2, que é de 26,7 L neste exemplo.
      figure-protocol-3(2)
      Onde o intervalo de alimentação é de 3 dias, o volume de trabalho é de 80 L e o SRT é de 9 dias.
    10. Use uma bomba peristáltica para alimentar esta pasta de resíduos alimentares de 26.7 L no digestor aAD na Figura 2A. Certifique-se de que a tubulação de entrada da bomba peristáltica permaneça submersa no líquido do balde de alimentação até que todo o líquido seja transferido.
      NOTA: Durante o processo de admissão, a tubulação pode vibrar levemente, o que é normal.
    11. Desligue a bomba e desconecte a energia. Redefina a velocidade de agitação do digestor piloto para 150 rpm por 30 min para homogeneizar a nova alimentação com o digerido existente.
    12. Descarregue 3 L de digerido homogeneizado em um balde para fins de ajuste de pH. Dispensar 100 ml do digerido do digestato homogeneizado de 3 L para um copo e medir o pH.
    13. Adicione gradualmente pellets de NaOH no digerido de 100 mL até que seu pH atinja 5,5. Para calcular o peso dos pellets de NaOH adicionados, calcule a perda de peso do recipiente de pellets de NaOH antes e depois do ajuste do pH.
    14. Adicione pellets de NaOH proporcionalmente ao volume do digerido no digestor piloto na Figura 2A para ajustar o pH para 5,5. Por exemplo, se forem necessários pellets de NaOH de 0,09 g para ajustar o digerido homogeneizado de 100 mL para pH 5,5, os pellets de NaOH de 72 g precisam ser carregados no digestor piloto aAD porque seu volume de trabalho é de 80 L, ou seja, 80 L / 0,1 L × 0,09 g = 72 g.
      NOTA: Como a faixa de pH ideal para aAD é 5-5,531, após cada alimentação, o pH deve ser ajustado para 5,5. Durante o aAD, o pH sempre cairá devido à reação de acidificação. Portanto, é altamente recomendável seguir as etapas 2.1.13 a 2.1.16 para verificar e ajustar o pH diariamente, se necessário.
    15. Verifique o digestor piloto para certificar-se de que todas as válvulas estão fechadas e ajuste a velocidade de agitação a 150 rpm para fornecer mistura intermitente para o próximo ciclo de operação aAD.
      NOTA: O digestor piloto aAD neste estudo é operado em modo semicontínuo para imitar processos industriais32.
  2. Separação sobrenadante para recuperação de VFA para fermentação PHA
    1. Ligue o interruptor de alimentação principal da centrífuga de disco.
    2. Aguarde até que o texto STANDSTILL apareça na tela do sistema da Interface Homem-Máquina (HMI). Verifique se o nível de óleo lubrificante está acima do limite mínimo.
    3. Abra a válvula da linha de água e ajuste a pressão para 45 psi. Abra a válvula da linha de serviço público de ar e ajuste a pressão para 90 psi.
    4. Pressione o botão verde na tela do sistema HMI para iniciar o processo de produção da centrífuga de disco. Aguarde até que o sistema conclua suas verificações.
    5. Monitore até que o sistema atinja a velocidade total definida, que é indicada por STANDBY na tela do sistema HMI.
      NOTA: A velocidade da centrífuga de disco é ajustada em sua capacidade máxima para separação de alta eficiência.
    6. Certifique-se de que a mangueira de entrada esteja submersa no recipiente de digerido descarregado. Conecte o tubo de saída do sobrenadante da centrífuga de disco a um balde vazio de 5 galões para coletar o sobrenadante, que será usado para a fermentação subsequente do PHA. Conecte a saída de sólidos a um balde vazio separado para coletar os sólidos residuais do digerido (Figura 2B).
    7. Use a bomba peristáltica para alimentar o digerido para a entrada da centrífuga de disco. Enquanto isso, clique no botão PROD na tela do sistema HMI. PROD significa Produção.
    8. Ajuste a válvula de entrada para manter uma vazão entre 0,2-0,5 m3/h e uma contrapressão entre 0,5-1 bar.
      NOTA: O sobrenadante circula para obter maior taxa de separação durante o processo de produção, que se refere ao estágio de separação sólido-líquido da centrífuga de disco, enquanto os sólidos são acumulados na centrífuga de disco.
    9. Após 30 minutos do processo de produção, pressione o botão Descarga na tela do sistema HMI para descarregar os sólidos e o sobrenadante na respectiva caçamba (Figura 2B).
      NOTA: Esta etapa é baseada em uma verificação visual, pois a eficiência de separação em termos de TS não pode ser medida instantaneamente. Normalmente, 30 minutos de operação são suficientes para alcançar a separação desejada do sobrenadante e do resíduo sólido.
    10. Armazenar o sobrenadante recolhido a 4 °C para posterior fermentação do PHA. Descarte os sólidos residuais de acordo com os regulamentos de descarte de resíduos biológicos ou recirculados de volta para o digestor aAD para posterior digestão.
    11. Inicie o ciclo de limpeza no local (CIP) selecionando o botão CIP na tela da IHM. Lave a centrífuga de disco seguindo as etapas especificadas na Tabela 2.
      NOTA: Uma bomba peristáltica é usada para alimentar e descarregar o meio de lavagem. Esta etapa de lavagem é importante para a manutenção do equipamento.
    12. Depois de concluir a lavagem, desligue e desconecte a bomba peristáltica e, em seguida, pressione o botão PROD para certificar-se de que a centrífuga de disco descarrega tudo do tanque de separação. Reduza a velocidade de rotação gradualmente.
    13. Pressione o botão vermelho na tela do sistema HMI para interromper as operações. Gire as válvulas da linha de água e ar para a posição OFF . Desligue a alimentação principal.

figure-protocol-4
Figura 2: Equipamento utilizado para produção de AGV e separação sólido-líquido. (A) Digestor aAD à escala piloto de 100 l. (B) descarga de sobrenadante e sólidos nos respectivos baldes do tanque de separação da centrífuga de disco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ParâmetrosDesperdício de alimentos
TS (%)~ 16,5
VS (%)~ 14,5
C:N~17:1

Tabela 1: Características de exemplo desperdício de alimentos.

PassoMídiaTemperaturaPropósitoPeríodo de tempo (min)Volume de descarga (L)Anotações
1ÁguaFrioPara lavagem primária51A água usada geralmente passa para drenar.
2ÁguaQuente (70 °C)Para a lise térmica de leveduras, se aplicável51A água usada normalmente passa para drenar ou circula.
3Solução de NaOH a 2%Quente (70 °C)Para dissolver depósitos de proteínas, se aplicável201A solução é normalmente circulada.
4ÁguaQuente (70 °C)Para lavagem51A água usada normalmente passa para drenar ou circula.
5Solução de ácido nítrico a 1%Quente (70 °C)Para dissolver depósitos inorgânicos101Se for usada água macia, a lavagem ácida é necessária apenas algumas vezes por ano. Nesse caso, o retorno pode passar para drenar. Se for usada água dura, pode ser necessária lavagem ácida em cada CIP. Neste caso, deve ser utilizado um sistema de circulação.
6ÁguaQuente (80–95 °C)Para lavagem e esterilização51Se a turbidez da descarga desta etapa for alta, repita a partir da Etapa 2.

Tabela 2: Instruções de lavagem da centrífuga de disco.

3. Fermentação de PHA usando sobrenadante de digerido rico em VFA

  1. Fermentação de PHA em escala de bancada para determinar as condições ideais para o aumento de escala.
    1. Adicione água para diluir o sobrenadante do digerido coletado na etapa 2.2.9 a um gradiente de concentrações para identificar o tempo de diluição ideal que minimize os efeitos inibitórios de compostos tóxicos potenciais presentes no sobrenadante do digestato de resíduos alimentares, garantindo o comprometimento mínimo do crescimento celular23.
      NOTA: Um mínimo de diluição de 2 tempos é normalmente necessário para mitigar esses efeitos inibitórios25.
    2. Suplementar o sobrenadante digerido diluído com sal e nutrientes, especificamente, 156 g/L de NaCl, 5 g/L de extrato de levedura, 13 g/L de MgCl26H2O, 20 g/L de MgSO47H2O, 1 g/L de CaCl22H2O, 4 g/L de KCl, 0,2 g/L de NaHCO3 e 0,5 g/L de NaBr, e NH4Cl conforme necessário33.
    3. Meça a salinidade do sobrenadante do digerido usando uma sonda de condutividade antes de adicionar NaCl. O digerido de resíduos alimentares normalmente tem salinidade insignificante; no entanto, se houver alta salinidade, ajuste a dosagem de NaCl com base na Equação 3.
      Adição de NaCl (g) = 156 g/L NaCl × volume total do meio preparado - figure-protocol-5 × volume do sobrenadante do digerido adicionado (3)
    4. Manter a relação C:N do meio feito de sobrenadante digerido em 15. Determinar a adição de NH4Cl com base na relação C:N autóctone do sobrenadante do digerido medida em termos de carbono orgânico total (COT) e azoto total (TN), conforme especificado nos passos 5.2 e 5.3.
    5. Agite o meio usando uma placa de agitação magnética a 200 rpm até que todos os suplementos estejam totalmente dissolvidos. Ajuste o pH do meio para 7,0 ± 0,05 usando 1 N NaOH ou 1 N H2SO4.
    6. Aloque o meio preparado em frascos Erlenmeyer estéreis, enchendo apenas 1/5 do volume para manter um grande espaço livre para transferência de ar adequada durante o cultivo (Figura 3A). Cobrir o balão com algodão ou qualquer tipo de material respirável com porosidade suficiente para permitir as trocas gasosas durante o cultivo.
    7. Descongele a cultura de sementes de H. mediterranei (ativada a partir da American Type Culture Collection (ATCC) 33500 comercial que é armazenada a -80 °C) por agitação suave em banho-maria ajustado para uma temperatura normal de crescimento da cepa H. mediterranei (por exemplo, 37 °C). O descongelamento deve ser rápido, ou seja, aproximadamente 2 min ou até que todos os cristais de gelo derretam.
    8. Inocular 0,2% (v/v) de cultura de sementes de H. mediterranei com OD600nm de ~0,5 no meio preparado. Preparar um balão de controlo positivo com inoculação e um balão de controlo negativo sem inoculação com meio ATCC 117633.
      NOTA: O meio ATCC tem a mesma composição de nutrientes detalhada na Etapa 3.1.2, exceto que o sobrenadante do digerido é substituído por 1 g / L de glicose e nenhuma fonte adicional de nitrogênio é adicionada.
    9. Incubar todos os balões a 37 °C com agitação a 150 rpm num agitador orbital. Meça a densidade óptica (OD600nm) diariamente até que ela se estabilize na fase estacionária e, em seguida, pare o cultivo. Colete o caldo rosado (Figura 3B) para recuperação de PHA a jusante.
  2. Fermentação PHA em escala piloto em fermentador de vidro de 50 L.
    1. Conecte o fermentador piloto PHA (Figura 4) e o aquecedor de circulação de água à fonte de alimentação.
    2. Ligue o interruptor de aquecimento do banho-maria. Defina a temperatura para 37 °C. Ligue o agitador e ajuste-o para 150 rpm.
    3. Adicione o sobrenadante do digestato de resíduos alimentares, preparado usando o fator de diluição ideal, juntamente com os suplementos de sal e nutrientes identificados na etapa 3.1.2, para obter um volume de trabalho de 40 L.
    4. Ajuste o valor do pH para 7. Inocular 10% (v/v) de cultura de sementes de H. mediterranei com OD600nm de ~0,5 no meio preparado.
    5. Ligue a bomba de ar do fermentador piloto e ajuste a taxa de aeração em 110 m3/h. Colete a amostra e meça o diâmetro externode 600 nm diariamente. Quando o OD600nm atingir a fase estacionária, interrompa a fermentação e armazene o caldo de fermentação a 4 °C para recuperação de PHA a jusante.
    6. Lave o fermentador com água da torneira e etanol a 70%.

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Figura 3: Frascos pré e pós-fermentação da produção de PHA por H. mediterranei. (A) Meio em frascos feitos de sobrenadante de digerido de resíduos alimentares antes da incubação/fermentação. (B) Cultura rosada de H. mediterranei rica em PHA após a fermentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Fermentador PHA em escala piloto de 50 L. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Recuperação downstream de PHA

  1. Alimente o caldo de fermentação de H. mediterranei na centrífuga de disco para separar o sobrenadante salgado e as células de H. mediterranei . Colete a célula coletada (parte Solid Out na Figura 5) para lise celular subsequente. Descarte a fração de saída de líquido de acordo com os regulamentos de descarte de resíduos biológicos.
    NOTA: A operação da centrífuga de disco aqui é a mesma das etapas em 2.2.
  2. Ressuspenda as células colhidas em água a 100 mL / g de células úmidas e misture a 150 rpm por 2 h à temperatura ambiente para permitir a lise celular por choque de pressão osmótica.
  3. Ressuspenda uma pequena porção (50 mL) de células colhidas na etapa 4.1 em solução de NaClO a 4% (2 mL de solução de NaClO a 4% por g de células úmidas) e misture por 5 min.
    NOTA: O tratamento com NaClO é usado para fornecer uma linha de base que pode presumivelmente recuperar 100% de PHA de células de H. mediterranei . Essa suposição é feita com base no fato de que esse tratamento com NaClO é o método mais amplamente adaptado para a recuperação de HAP34. Este tratamento com NaClO é geralmente considerado agressivo o suficiente para a lise celular completa e a recuperação do PHA, independentemente da espécie celular.
    CUIDADO: NaClO é um forte agente oxidante. Pode causar queimaduras graves na pele, danos aos olhos e irritação respiratória. Sempre manuseie o NaClO em uma área bem ventilada ou sob uma coifa, usando equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo luvas, óculos de segurança e jaleco. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente a área afetada com água em abundância e procure atendimento médico se a irritação persistir. Descarte os resíduos contendo NaClO de acordo com os regulamentos locais de resíduos perigosos para evitar a contaminação ambiental.
  4. Centrifugue a suspensão lisada a 10.000 x g por 30 min para coletar grânulos de PHA. Descarte o sobrenadante de acordo com os regulamentos de descarte de resíduos biológicos no laboratório.
  5. Liofilizar os grânulos de PHA a -50 °C por ~48 h até que o peso constante seja alcançado para obter o pó de PHA bruto (Figura 6A).
  6. Adicione etanol ao pó bruto de PHA a 10 mL / g para remover as impurezas residuais. Centrifugue a 10.000 x g por 30 min para coletar grânulos de PHA purificados. Descarte o sobrenadante de acordo com os regulamentos de descarte de resíduos químicos.
  7. Liofilizar o pellet de PHA a -50 °C durante ~48 h até atingir o peso constante para obter o pó de PHA purificado (Figura 6B).

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Figura 5: Sobrenadante salgado separado (esquerda) e células (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: PHA em pó. (A) PHA em pó bruto e (B) PHA em pó purificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Métodos analíticos

  1. Meça TS e VS seguindo métodos padrão35. Determinar TN pelos kits de ensaio de Hach seguindo o método padrão utilizando um espectrofotómetro35.
  2. Medir o COT por um analisador de COT seguindo os métodos descritos em estudo anterior25. Meça o pH por um medidor de pH de bancada.
  3. Determine a quantificação de AGV usando um kit36. Monitore o diâmetro externode 600 nm usando um leitor de microplacas.
  4. Estimar a DCW a partir dos sólidos suspensos voláteis (VSS) do caldo de células medidos de acordo com o método de medição VSS padrão25,35. Resumidamente, centrifugue 50 mL de caldo de células a 8.000 x g por 15 min e transfira o pellet para um cadinho para análise VSS.
    NOTA: Use o VSS para estimar o DCW, pois reflete a biomassa orgânica e evita a superestimação devido ao teor de sal em H. mediterranei23.
  5. Realizar a quantificação do PHA por cromatografia gasosa (GC) seguindo os métodos de um estudo anterior25, no qual a biomassa liofilizada é metanolisada em clorofórmio e metanol acidificado a 105 °C por 2 h, e os monômeros resultantes são quantificados usando GC com benzoato de metila como padrão interno. Calcule a recuperação de PHA usando a Equação 4 e a pureza de PHA está usando a Equação 5. Determine toda a massa de PHA de GC.
    Recuperação de PHA (%) = figure-protocol-10 (4)
    Pureza PHA (%) = figure-protocol-11 (5)
    CUIDADO: O clorofórmio e o ácido sulfúrico usados na quantificação de PHA são perigosos e devem ser manuseados com extremo cuidado. O clorofórmio é um solvente orgânico volátil que apresenta riscos de toxicidade por inalação e pode causar danos ao fígado e aos rins após exposição prolongada. O ácido sulfúrico é um produto químico corrosivo forte que pode causar queimaduras graves ao contato com a pele ou com os olhos. Sempre manuseie esses produtos químicos dentro de um exaustor para evitar a exposição por inalação. Certifique-se do uso de EPI adequado, incluindo luvas resistentes a produtos químicos, óculos de segurança e jaleco. Descarte adequadamente todos os resíduos de clorofórmio e ácido sulfúrico de acordo com os regulamentos locais de resíduos perigosos para manter práticas laboratoriais seguras.

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Resultados

Características do desperdício de alimentos e produção de AGV a partir de aAD
Um exemplo da relação TS, VS e C:N na pasta de resíduos alimentares preparados é mostrado na Tabela 1. Devido à variabilidade inerente na composição do desperdício de alimentos em diferentes fontes e tempo de amostragem, são esperadas flutuações nos valores da razão TS, VS e C:N. Embora a variabilidade seja aceitável, as medições regulares da relação TS, VS e C:N são essenciais para o monitoramento do proces...

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Discussão

Produção de VFA da aAD
O VFA desempenha um papel crucial como precursor chave para H. mediterranei na conversão de resíduos alimentares em PHA. Portanto, manter uma alta concentração de AGV durante a aAD é essencial. Várias estratégias podem ser empregadas para aumentar a produção de AGV em aAD25. Uma abordagem eficaz é a otimização do SRT, com duração ideal de 8 dias ou menos, que promove a eliminação de metanogênicos enquanto maximiz...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Departamento de Energia-Escritório de Eficiência Energética e Energia Renovável (Prêmio Prime No. DEEE0009268) e Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (Prêmio nº 2023-79000-38973).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ArGás de arAI UZ300Usado para operação GC
Máquina PneumáticaRaio de nuvemHailea ACO-009D
Cloreto de amônioAcros OrgânicosA0396560
AutoclaveSTERISLaboratório AMSCO 250Usado na preparação do meio ATCC
EquilíbrioMETTLER TOLEDOME204TE/00
LiquidificadorVEVORIB750LV + BLD300 + WB-1
BaldeLowe'sModelo 50640Balde geral de plástico livre de BPA de 5 galões
Cloreto de cálcio di-hidratadoAcros OrgânicosA0362932
ClorofórmioMillipore SigmaC2432
AaronQualquer tipo que possa ser usado na medição TS, VS, VSS
Tubos de digestão, tampa de rosca com revestimento de PTFEMillipore SigmaCLS982613
Bloco de reator digitalHach CompanyDRB200Utilizado nos métodos de quantificação de VFA da Hach
Agitador digitalSCILOGEXSCI550-Pro
Centrífuga de discoAlfa Laval Inc.Clara 20
Balões de ErlenmeyerAmazonaB07V3JPQMM
EtanolAmazonaB09DGVL4ML
LiofilizadorLabconco10030133, 1027319 e 0109621Sistemas de liofilização FreeZone de 2,5 litros
HotteCorporação Científica KewauneeSupreme Air LV
FornoThermo CientíficoModelo F30428C
Cromatografia gasosa (GC)AgilentModelo 8890 
Haloferax mediterraneiATCC33500
HidrogénioGás de arHY UHP300Usado para operação GC
FacaQualquer tipo usado para cortar o desperdício de alimentos
Óleo lubrificanteCompanhia Científica FisherNC9844626
Cloreto de magnésio hexahidratadoCompanhia Científica FisherBP214-500
Sulfato de magnésio heptahidratadoMillipore SigmaM1880
MethonalMillipore Sigma34860
Benzoato de metiloMillipore Sigma93583Usado como padrão interno na quantificação de PHA
Leitor de microplacas Sinergia BioTekSinergia H1
AzotoGás de arNI UHP300Usado para operação GC
FornoThermo CientíficoOMH750
Bomba peristálticaSimplesmente Bombas Inc.C.A. PM6000Bomba autoescorvante de alto fluxo com excelente capacidade de funcionamento a seco, capaz de lidar com polpas com alto teor de partículas e projetada para tubos de parede de 1/8 de polegada.
Medidor de pHCompanhia Científica FisherAE150
Padrão PHAMillipore Sigma403105
Digestor piloto aADGrupo de energia Quasar, Independence, Ohio, EUAFermentador de aço inoxidável com um volume total de 100 L e um volume de trabalho de 80 L 
Fermentador piloto PHAÁrvore de ManukaSF-50l ISO 9001 CEReator de vidro revestido de camada dupla
Cloreto de potássioG-BIOCIÊNCIAS162006
Tubulação da bombaQualquer marca de tubo de silicone com 1/8 '' ID e 3/8 '' OD
Bicarbonato de sódioFisher Química241787
Brometo de sódioCarolina21139-45
Cloreto de sódioAmazon B0787CFHF3
Hidróxido de sódio, pelletsBiorreagentes Fisher236088
Hipoclorito de sódioMillipore Sigma425044
Centrífuga Superspeed Sorvall LYNX 4000Thermo Científico75006580Usado para coleta de grânulos de PHA na recuperação de PHA a jusante 
Espectrofotômetro Hach CompanyDR3900Utilizado nos métodos de quantificação de VFA da Hach
Ácido sulfúricoMillipore Sigma258105
Filtro de seringaAmazonaB06X6GTKVY
Analisador de TOCShimadzuModelo TOC-LCSN
Teste de frascos de ácidos voláteis TNTplusHach CompanyTNT 872Capaz de medir VFA na faixa de 50 - 2.500 mg/L de ácido acético.
Aquecedor de águaBosch Inc.Tronic 3000 T 7 galões (ES8)
Extrato de leveduraCompanhia Científica FisherAAJ6028736

Referências

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