Detecção do Ácido Nucleico e Gene de Resistência a Drogas de Mycoplasma pneumoniae

Resumo

Este protocolo fornece uma maneira rápida e confiável de detectar infecções por Mycoplasma pneumoniae e identificar resistência a antibióticos. Ajuda os profissionais a escolher os tratamentos certos mais rapidamente, melhorando o atendimento a pacientes com pneumonia e apoiando um melhor uso de antibióticos

Resumo

Mycoplasma pneumoniae (Mp) representa um dos patógenos mais prevalentes responsáveis pela pneumonia adquirida na comunidade (PAC) em populações pediátricas. A detecção de genes de resistência ao Mycoplasma pneumoniae fornece suporte técnico robusto e uma base teórica para o diagnóstico clínico preciso e o tratamento de infecções por MP. O diagnóstico preciso e a avaliação da resistência aos medicamentos na infecção por Mp são essenciais para o tratamento clínico. Os métodos comuns de detecção de Mycoplasma pneumoniae incluem cultura, detecção de anticorpos e ensaios baseados em biologia molecular. A cultura de Mp é o padrão-ouro para o diagnóstico, mas requer um meio específico, é demorada e tem baixa sensibilidade. A detecção de Mp baseada em anticorpos é amplamente utilizada; no entanto, podem ocorrer falsos negativos no estágio inicial da infecção. A detecção baseada em biologia molecular fornece retorno rápido, baixo risco de contaminação, alta sensibilidade, alta especificidade e não é limitada pelo momento da coleta da amostra ou pelo estado imunológico. Portanto, foi reconhecido como um novo padrão-ouro para o diagnóstico da infecção por Mycoplasma pneumoniae . Os agentes macrólidos são o tratamento de primeira escolha para a infecção por Mp em crianças. No entanto, com o uso extensivo de macrolídeos em infecções do trato respiratório em crianças, a incidência de infecção por Mycoplasma pneumoniae resistente a medicamentos tem aumentado. Os pacientes infectados com cepas resistentes apresentam duração da febre significativamente mais longa, hospitalização prolongada e febre prolongada após a administração em comparação com aqueles infectados com cepas sensíveis. Os locais de mutação identificados até o momento incluem 2063, 2064, 2067 e 2617. Na China, as mutações pontuais foram documentadas apenas nas posições 2063 e 2064, sendo a substituição de A para G na posição 2063 a mais comum. Para esses locais, a reação em cadeia da polimerase (PCR) combinada com a tecnologia de sonda fluorescente tem sido empregada para detectar os ácidos nucléicos e mutações de resistência a drogas de Mycoplasma pneumoniae em amostras de escarro humano. A detecção de genes de resistência ao Mycoplasma pneumoniae oferece suporte técnico crucial e uma base teórica para o diagnóstico preciso e o tratamento eficaz da infecção por Mp.

Introdução

Mycoplasma pneumoniae (Mp) é o menor microrganismo patogênico capaz de sobrevivência independente, situado em uma posição intermediária entre bactérias e vírus. É disseminada principalmente por gotículas respiratórias ou aerossóis e constitui o segundo patógeno mais comum associado à pneumonia adquirida na comunidade (PAC) em crianças¹, responsável por 20% a 40% dos casos de PAC². Mp mostra resistência inerente a antibióticos β-lactâmicos, como penicilina e cefalosporinas, devido à ausência de parede celular, que esses antibióticos visam obstruindo a síntese da parede celular. As principais modalidades terapêuticas para infecções por Mp incluem agentes que obstruem a síntese de proteínas, incluindo macrolídeos e tetraciclinas, ao lado de fármacos que impedem a replicação do DNA, como tetraciclinas e fluoroquinolonas ^3,4,5. Portanto, a pronta identificação laboratorial de Mp é essencial para informar a aplicação criteriosa de antibióticos. Os métodos contemporâneos de detecção laboratorial para Mp abrangem isolamento e cultura, detecção de antígenos, detecção de anticorpos e técnicas de diagnóstico genético.

Como método tradicional de detecção, o isolamento e a cultura continuam a ser o padrão definitivo para o diagnóstico da infecção por Mycoplasma pneumoniae . Kashyap et al. observaram que a cultura de Mp de esfregaços da garganta ou amostras de escarro é uma técnica de diagnóstico confiável⁶. Essa abordagem encontra obstáculos consideráveis, como os rigorosos pré-requisitos culturais do Mp, períodos de cultura prolongados e taxas de detecção positiva tipicamente baixas, que restringem seu uso clínico de rotina. A detecção do antígeno Mp depende de anticorpos específicos para Mp. Miyashita et al. usaram anticorpos monoclonais de várias cepas de Mp como agentes de revestimento em um sanduíche de anticorpo duplo ELISA e avaliaram sua eficácia usando PCR⁷. Os resultados não revelaram nenhuma diferença substancial entre as duas metodologias. No entanto, a necessidade de anticorpos monoclonais altamente específicos e de alto título restringe a ampla implementação desse método.

Após a infecção por Mp, o sistema imunológico gera anticorpos IgM e IgG específicos. Os anticorpos IgM geralmente se tornam detectáveis dentro de 1 semana após a infecção e atingem seu pico em 3 a 4 semanas, tornando-os indicadores diagnósticos valiosos para infecção precoce. No entanto, resultados falso-negativos podem surgir nos estágios iniciais devido à diminuição dos níveis de anticorpos⁸. Por outro lado, os anticorpos IgG se manifestam mais tarde e geralmente significam uma infecção prévia ^9,10. A detecção sorológica de Mp é classificada em ensaios de anticorpos não específicos e específicos. Embora os testes de anticorpos não específicos sejam simples de administrar, sua especificidade é limitada, pois as infecções por outros patógenos, incluindo rickettsia e adenovírus, também podem aumentar os níveis de aglutinina fria, resultando em resultados falso-positivos. Os ensaios de anticorpos específicos abrangem o teste de fixação do complemento, teste de aglutinação de partículas, teste de hemaglutinação indireta, ensaio de imunofluorescência indireta e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). O ELISA é amplamente utilizado na China devido à sua tecnologia estabelecida e acessibilidade comercial, proporcionando alta sensibilidade e simplicidade operacional, servindo assim como um método prático e confiável para o diagnóstico de infecções por Mp na prática clínica de rotina¹¹.

A PCR quantitativa fluorescente em tempo real se distingue por seu tempo de processamento rápido, especificidade elevada, sensibilidade robusta e ausência de reatividade cruzada. Este método identifica o DNA Mp em amostras de escarro, swab de garganta ou fluido de lavagem brônquica e requer 1-100 ng de DNA por reação. A detecção foi realizada usando um instrumento de PCR em tempo real. O molde de DNA sofre desnaturação em temperaturas mais altas, seguida de recozimento de primer e hibridização de sonda fluorescente. A tecnologia de amplificação gênica permite a replicação de fragmentos de ácidos nucleicos em concentrações extremamente baixas para milhões de cópias em um curto período de tempo, atingindo uma sensibilidade de detecção de ≥10 UFC/mL¹². Em comparação com a PCR convencional, a PCR quantitativa fluorescente em tempo real reduz os riscos de contaminação, permitindo alto rendimento e análise automatizada. Portanto, emergiu como a técnica preferida para detecção direta de Mp na prática clínica¹³. Devido à sua maior sensibilidade, medidas rigorosas são necessárias para evitar a contaminação, o que pode resultar em resultados falso-positivos ou falso-negativos.

No tratamento clínico, os macrolídeos constituem a principal intervenção terapêutica para pneumonia por Mycoplasma pneumoniae (MPP). O uso excessivo e a aplicação inadequada de antibióticos impuseram pressão seletiva, levando ao surgimento de Mp resistente a macrolídeos. Essa resistência é um contribuinte significativo para o MPP refratário. A resistência a macrolídeos em Mycoplasma pneumoniae é notavelmente elevada no Leste Asiático, particularmente na China e no Japão, enquanto a Europa e os Estados Unidos exibem taxas de resistência relativamente mais baixas. Pacientes pediátricos geralmente demonstram taxas de resistência elevadas em comparação com adultos, necessitando de maior escrutínio¹⁴. Desde 2000, a incidência de infecções por Mycoplasma pneumoniae (MRMPI) aumentou significativamente em escala global, especialmente no Leste Asiático. Na China, as cepas de MRMPI constituem 69% a 95% dos casos¹⁵, contribuindo substancialmente para doença grave, falha do tratamento, complicações e sequelas em longo prazo. Pesquisas indicam que mutações no gene 23S rRNA inibem a ligação de macrolídeos a locais-alvo, consequentemente diminuindo a eficácia do medicamento. Os loci de mutação freqüentes abrangem as posições 2063, 2064, 2067 e 2617. Na China, as mutações foram identificadas exclusivamente nas posições 2063 e 2064^16,17. Um estudo de 2016 indicou que as taxas de resistência a macrolídeos em Pequim, Harbin, Xangai e Xinjiang variaram entre 66,7% e 86,7%, enquanto Nanjing exibiu uma taxa mais baixa de 20%¹⁸. Cepas resistentes a macrolídeos surgiram em várias regiões, com taxas de resistência relatadas da seguinte forma: 8,3% -9,8% na França, 3,0% -3,6% na Alemanha, 8,2% nos Estados Unidos, 0,9% -2,9% na Dinamarca, 12,1% no Canadá, 20% na Itália, 22% em Israel, 8% na Espanha e 9,3% no Reino Unido 19,20,21,22,23,24,25,26^{, 27}. Essa tendência destaca a proliferação mundial da resistência a macrolídeos. Em 2008, Hindley et al. relataram 46 casos de Mycoplasma pneumoniae resistente a macrolídeos, com 40 casos demonstrando a mutação A2063G, um caso apresentando a mutação A2063C e cinco casos exibindo a mutação A2064G²⁸. Mutações de resistência comparáveis foram identificadas no Japão e nos Estados Unidos, com as mutações primárias ocorrendo nas posições 2063 e 2064²⁹. A pesquisa sugere uma relação entre os locais de mutação e os fenótipos de resistência a medicamentos: a mutação A2063G confere resistência a macrolídeos de 14 membros (ML), a mutação A2064G confere resistência a ML de 14 e 16 membros, C2617G confere resistência a ML de 14 e 15 membros e a mutação A2067G confere resistência a ML³⁰ de 16 membros. O monitoramento da resistência ao Mp é crucial para a identificação precoce de infecções resistentes a medicamentos e para informar as escolhas de tratamento clínico. Estudos têm demonstrado que o teste de suscetibilidade antimicrobiana in vitro pode prever a eficácia clínica^{dos medicamentos 31}. Em 2011, o American Clinical and Laboratory Standards Institute promulgou diretrizes defendendo o método de microdiluição para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) para avaliar a resistência a macrolídeos³². No entanto, a determinação da CIM pode exigir várias semanas, restringindo assim sua utilidade clínica no direcionamento da antibioticoterapia em tempo real.

O sequenciamento de Sanger é uma técnica direta para identificar mutações no gene 23S rRNA de Mp. Este método utiliza nucleotídeos marcados com fluorescência e análise eletroforética para determinar as sequências de DNA, facilitando a identificação de variações genéticas de Mp. O sequenciamento de Sanger, embora capaz de identificar simultaneamente múltiplas mutações e quantificar as proporções de cepas resistentes e suscetíveis, é trabalhoso e demorado, restringindo assim sua utilidade clínica^33,34. Em contraste, o pirosequenciamento fornece uma avaliação mais precisa das variações da sequência de DNA, identificando a liberação de pirofosfato durante a incorporação de nucleotídeos. Este método pode identificar cepas MRMPI e quantificar as proporções de cepas resistentes e suscetíveis em amostras clínicas com maior precisão do que o sequenciamento de Sanger. Além disso, o pirosequenciamento permite o monitoramento longitudinal de pacientes individuais, permitindo a avaliação em tempo real do desenvolvimento de resistência e informando as modificações do tratamento³³. No entanto, sua aplicação clínica é limitada pela necessidade de aparelhos especializados, pessoal proficiente e durações de processamento prolongadas.

Com base na análise do polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) do gene P1, Mp é categorizado em dois tipos: tipo I (dividido em cinco subtipos: 1a-1e) e tipo II (dividido em três subtipos: 2a-2c). Este teste pode detectar 8 subtipos de genes de Mycoplasma pneumoniae³⁵. Este método facilita a identificação qualitativa de Mycoplasma pneumoniae e mutações de resistência a macrolídeos (locais de mutação 23S rRNA 2063 (A:G) e 2064 (A:G)) em amostras de escarro pediátrico, fornecendo um instrumento de diagnóstico suplementar rápido e direto para infecções por Mycoplasma e vigilância de resistência a antibióticos.

Protocolo

Todos os protocolos do estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Popular de Heyuan (Aprovação nº. YXYJLL-LW2025001). Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito antes da participação.

1. Coleta de amostras

NOTA: Tenha cuidado ao manter a técnica asséptica durante a coleta de amostras.

1. Colete amostras de escarro do paciente ou paciente suspeito. Obtenha amostras dentro de 3 dias após o início da doença do paciente.
2. Instrua o paciente a enxaguar a boca com água, respirar profundamente, reter a respiração por 5 s e expirar gradualmente.
3. Peça ao paciente para expirar profundamente mais uma vez, tente expelir o escarro, deposite-o em um copo plástico designado e prenda a tampa. O escarro deve ser prontamente entregue ao laboratório clínico em temperatura ambiente (TR). Armazenar as amostras a 2-8 °C no frigorífico.

2. Preparação de reagentes de amplificação

1. Na área de preparação de reagentes do laboratório de PCR, descongele o tampão, a sonda de primer e a água do kit a 4 °C após recuperá-los do freezer de -20 °C. Remova a enzima, misture delicadamente agitando e centrifugue a 1.006 x g por 10 s.
2. Recupere um tubo de centrífuga estéril sem nuclease, etiquete-o e prepare o sistema de reação para cada indivíduo, conforme descrito na Tabela 1. O número total de reações de PCR deve ser igual à soma das amostras, um controle de qualidade positivo fraco, um produto de controle de qualidade W e um controle de extração negativo.
3. Determine a quantidade de cada reagente, incorpore-o em um tubo de centrífuga de tamanho adequado, misture bem e centrifugue brevemente em baixa velocidade. Dispense 20 μL de reagente em cada tubo de reação de PCR e realoque-o para a área de processamento da amostra.

3. Tratamento da amostra

1. Trate 1 mL de amostras de escarro com 2 mL de tampão de digestão de escarro, misturado em vórtice completamente, e incube por 30 min até que a liquefação completa seja alcançada.
2. Com base na quantidade de amostra, adicionar 5 μL do padrão interno sequencialmente à^1ª e^7ª colunas da placa de extração de ácido nucleico, seguido pela adição de 200 μL de amostras liquefeitas, solução salina normal e MM controle de qualidade positivo fraco em sucessão.
3. Recupere uma placa de extração de ácido nucleico usando um instrumento automatizado de extração de ácido nucleico. Adicionar os ácidos nucleicos extraídos após a realização dos ensaios a jusante nas colunas 6 e 12 da placa de extração.
4. Adição de amostra: Na área de preparação de amostras do laboratório de PCR, adicione ácido nucleico extraído nas^6ª e^12ª colunas da placa de extração. Posteriormente, transfira 5,0 μL do ácido nucleico da amostra preparada para o tubo de reação de PCR, que contém a mistura de reação de PCR (incluindo amostra, controles de qualidade positivos fortes e fracos, controle de qualidade W e controle negativo de extração).
5. Fixe o líquido do tubo de reação de PCR e realize centrifugação imediata para confirmar se o líquido está devidamente selado e sem bolhas.

4. Amplificação

1. Insira o tubo de reação no detector de PCR de fluorescência e configure os parâmetros do ciclo da seguinte forma na Tabela 2.
2. Adquira sinais de fluorescência em FAM (mutação 2063 ou 2064 A:G), VIC (Mycoplasma pneumoniae) e CY5 (padrão interno), com coleta de dados definida em 64 °C.

5. Análise dos dados

NOTA: Este estudo empregou PCR quantitativo em tempo real (qPCR), com resultados representativos indicando mutações associadas à resistência A:G nas posições 2063 ou 2064 de Mycoplasma pneumoniae. Os pacientes com teste positivo devem evitar antibióticos macrólidos no tratamento clínico.

1. Após a reação, o instrumento analisa e arquiva os resultados de forma autônoma. Verifique se os genes-alvo para controle negativo exibem fluorescência FAM Ct ≥ 35.33 e fluorescência VIC Ct ≥ 35.01, enquanto os genes-alvo para controle de qualidade W demonstram fluorescência FAM Ct ≥ 35.33 e fluorescência VIC Ct ≥ 35.01. Os valores de Ct para fluorescência FAM e VIC em produtos de controle de qualidade fracamente positivos variaram de 29,00 a 34,00.
2. Geralmente, o valor Ct do padrão interno é ≤ 35,00. Se uma curva de amplificação S característica for observada, mas o padrão interno não for amplificado devido à concentração elevada do gene alvo, relate-o diretamente como uma amostra positiva ou reavalie a amostra por meio de uma diluição de gradiente de 10 vezes.
3. Classifique a amostra que exibe UNDECT ou ausência de uma curva de amplificação típica do tipo S como negativa.
4. Considere as amostras negativas quando a fluorescência FAM (mutação 2063 ou 2064 A:G) Ct ≥ 35,33, fluorescência VIC (Mycoplasma pneumoniae) Ct ≥ 35,01 ou quando não houver curva de amplificação típica do tipo S. As amostras de Considere positivas quando seu valor de Ct atende à Tabela 3 e exibem uma curva de amplificação característica do tipo S.
   NOTA: Os resultados da detecção de amostras dependem da qualidade da coleta, processamento, transporte e preservação da amostra; Quaisquer erros podem resultar em resultados falsos negativos. A falha em controlar a contaminação cruzada durante o processamento da amostra pode resultar em resultados falsos positivos.

Resultados

Após a liquefação, extração de ácido nucleico e amplificação por PCR por fluorescência de amostras de escarro, o valor inicial, o valor final e o valor limite da linha de base foram modificados após a análise da curva de amplificação. O valor inicial era 3 e o valor final era 20.

Os resultados representativos deste experimento foram positivos para o ácido nucleico Mp, e uma mutação de resistência A: G ocorreu em 2063 ou 2064 loc...

Discussão

A PCR e suas técnicas derivadas demonstram sensibilidade e especificidade superiores em comparação com os métodos sorológicos na identificação, tipagem e detecção de resistência a medicamentos em Mycoplasma pneumoniae (MP). Além disso, as técnicas baseadas em PCR proporcionam facilidade de operação e redução de gastos, tornando-as uma alternativa viável para diagnósticos clínicos de rotina³⁶. Mp é um patógeno notável associado à PAC e demonstra uma preval...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumento de extração de ácidos nucleicos automatizado	Guangzhou Da 'an Gene Co., Ltd.	Inteligente 32
Dicas de filtro	Fornecedor:Coring Life Science Co., Ltd.	29822001	0-10µ L
Dicas de filtro	Fornecedor:Coring Life Science Co., Ltd.	03023001	1-50µ L
Dicas de filtro	Fornecedor:Coring Life Science Co., Ltd.	05623001	5-300µ L
Microtubos	Fornecedor:Coring Life Science Co., Ltd.	14124934	1,5mL
Mycoplasma pneumoniae kit de detecção de local de mutação de resistência a medicamentos e ácido nucleico (método de PCR de fluorescência)	Jiangsu Mole Biotecnologia Co., Ltd.	20241111
Reagente de extração de ácidos nucleares (método de esferas magnéticas)	Shengxiang Biotechnology Co., Ltd.	G24004
Tubos de PCR	DN Biotech(Hong Kong)  Co., Ltd.	6121003	0,2 mL
Instrumento de PCR fluorescente em tempo real	BIO-RAD	CFX96