Artigo de método

Quantificação de violaceína em Chromobacterium violaceum e sua inibição por compostos bioativos

DOI:

10.3791/68507

⸱

8 de agosto de 2025

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1Food Research Center, Department of Food and Experimental Nutrition, Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo (USP)

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é quantificar a produção de violaceína por Chromobacterium violaceum ATCC 12472 como um proxy para avaliar a inibição de quorum sensing por compostos bioativos.

Resumo

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As bactérias se comunicam por meio de um sistema conhecido como quorum sensing (QS), que lhes permite coordenar seu comportamento em resposta a mudanças na densidade celular. Esse processo envolve a produção, secreção e detecção de pequenas moléculas de sinalização extracelular, geralmente chamadas de autoindutores (IA). O QS regula uma ampla gama de genes e funções, incluindo formação e dispersão de biofilme, motilidade de enxame, produção de fatores de virulência, resistência a antibióticos e bioluminescência, entre outros. A inibição do QS tornou-se uma estratégia antivirulência promissora contra bactérias resistentes a antibióticos, pois exerce uma pressão seletiva mais baixa em comparação com os antibióticos tradicionais. Na bactéria Chromobacterium violaceum ATCC 12472, as proteínas QS CviI/CviR, que são homólogas às proteínas QS do tipo LuxI/LuxR de Aliivibrio fisheri, controlam muitos genes, incluindo aqueles responsáveis pela produção do pigmento roxo violaceína. C. violaceum tem sido amplamente utilizado como cepa biossensora em estudos de inibição de QS, particularmente na inibição da produção de violaceína. Muitos compostos têm o potencial de inibir o QS ligando-se às proteínas QS, homólogos LuxI ou LuxR, interrompendo os circuitos QS. Este protocolo descreve o método de quantificação da violaceína produzida por C. violaceum ATCC 12472 e sua inibição por compostos bioativos em concentrações que não afetam o crescimento bacteriano. O ensaio aqui descrito demonstra uma redução significativa na produção de violaceína pelos compostos testados. Este estudo destaca o potencial de usar este protocolo para selecionar candidatos promissores na pesquisa de inibição de QS.

Introdução

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As bactérias podem se comunicar por meio de um sistema conhecido como QS, que permite a modulação coordenada de seu comportamento em resposta a mudanças na densidade celular. Esse processo envolve a produção, secreção e detecção de pequenas moléculas sinalizadoras extracelulares, também chamadas de autoindutores, que permitem a comunicação entre espécies diferentes e dentro de uma mesma espécie 1,2.

Essa comunicação é capaz de regular genes e funções como formação e dispersão de biofilme, motilidade e adesão, proliferação celular, síntese de exoenzimas e sideróforos, esporulação, resistência a ácidos, transferência horizontal de genes, resistência a antibióticos, bioluminescência, produção de exopolissacarídeos, entre outros 3,4,5. Dada a relevância dos fenótipos regulados por QS, há grande interesse no desenvolvimento de sistemas capazes de interferir nessa comunicação celular. A inibição da sinalização QS também é denominada quorum extenching (QQ)6. A QQ pode ocorrer de várias maneiras, incluindo inibidores da síntese de autoindutores, inativação enzimática desses sinais e moléculas com efeito antagônico sobre essas moléculas 4,7.

A crescente ameaça de resistência a antibióticos impulsionou a pesquisa de terapias alternativas, incluindo inibidores de detecção de quórum (QSIs), que interrompem a comunicação bacteriana sem matar diretamente os patógenos. Esses compostos podem apresentar efeitos sinérgicos quando combinados com antibióticos, aumentando a suscetibilidade bacteriana e permitindo doses reduzidas de antibióticos, o que é uma estratégia fundamental para retardar o desenvolvimento de resistência. Por exemplo, o resveratrol e a canamicina juntos retardam o crescimento de Aeromonas hydrophila 8, enquanto a N-acetilcisteína sinergiza com a tobramicina para interromper os biofilmes de Pseudomonas aeruginosa 5.

Com o uso excessivo de antibióticos e o desenvolvimento estagnado de medicamentos, as abordagens antivirulência, como a inibição do QS, oferecem uma mudança de paradigma9. Em vez de visar a viabilidade, eles visam fatores de virulência, tornando as bactérias menos prejudiciais e mais vulneráveis à imunidade do hospedeiro ou antibióticos5. Essa estratégia impõe uma pressão seletiva mais fraca em comparação com os antibióticos tradicionais, minimizando a resistência e preservando a microbiota benéfica10,11. Apesar dos resultados laboratoriais promissores, a validação no mundo real por meio de ensaios clínicos permanece poucoexplorada 12. A inibição do QS representa um complemento promissor aos antibióticos, mas sua tradução para a prática requer mais evidências de eficácia e segurança em ambientes biológicos complexos.

C. violaceum é uma proteobactéria beta que forma colônias violetas com uma superfície lisa e brilhante. São bacilos anaeróbios facultativos e não formam esporos13. O mecanismo de QS em C. violaceum envolve um ciclo de feedback positivo baseado no sistema gênico análogo ao modelo lux de Aliivibrio fisheri, que contém as proteínas CviI (homóloga a LuxI) e CviR (homóloga a LuxR; Figura 1). A violaceína exibe atividade biocida contra vários organismos, incluindo fungos, bactérias, nematóides e vírus, particularmente durante a fase de crescimento estacionário microbiano, quando a densidade populacional é extremamente alta e os nutrientes estão quase esgotados. Consequentemente, a produção de violaceína pode ser considerada uma estratégia competitiva para prolongar a sobrevivência da colônia microbiana14.

As plantas produzem compostos originários do metabolismo secundário, que desempenham um papel crucial no aumento de sua capacidade de adaptação a ambientes desfavoráveis. Esses metabólitos, como alcaloides, fenóis, flavonoides, quinonas, taninos, terpenos e lectinas, são amplamente reconhecidos como mecanismos de defesa contra herbívoros e microrganismos15. O potencial de compostos derivados de plantas como QSI tem atraído atenção especial devido às interações dinâmicas entre plantas e microrganismos. Estudos sobre interações planta-patógeno na rizosfera demonstraram que as plantas podem responder a autoindutores bacterianos secretando compostos bioativos capazes de atuar como inibidores contra patógenos16.

Neste estudo, descrevemos um método prático que visa quantificar a produção de violaceína por C. violaceum, com foco em sua inibição por compostos bioativos. Este método serve como uma ferramenta de triagem inicial para selecionar compostos com potenciais atividades de QSI. Ele fornece uma abordagem rápida e prática para o desenvolvimento terapêutico futuro contra bactérias patogênicas Gram-negativas. Esse protocolo padronizado será útil porque fornece uma descrição detalhada que não foi feita em estudos anteriores e facilitará a comparação entre diferentes estudos no futuro 17,18,19.

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Protocolo

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1. Preparo da cultura (Figura 2)

  1. Cultive em um tubo de ensaio uma cultura de 5 mL de C. violaceum ATCC 12472 em caldo Luria Bertani (LB: triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, 5g/L NaCl) a 30 °C em uma incubadora agitada (220 rpm) por 24 h.
  2. Ajuste a cultura para um OD595 de 0,1 em caldo LB, correspondendo a aproximadamente 1 x 108 UFC / mL.

2. Preparação do composto

  1. Em uma placa de fundo plano de 96 poços, adicione o caldo LB e o composto bioativo de acordo com um cálculo de diluição seriado, seguindo a descrição abaixo. Dependendo de sua solubilidade, os compostos bioativos são normalmente diluídos em DMSO puro ou em uma solução DMSO: água (1:1).
    NOTA: Nas metodologias que avaliam o QSI, é crucial garantir que as concentrações utilizadas estejam abaixo da concentração inibitória mínima (sub-MIC), o que significa que não afetam o crescimento bacteriano. Portanto, recomenda-se realizar ensaios de curva de crescimento em diferentes concentrações para confirmar que o composto inibe especificamente a comunicação célula a célula, em vez da viabilidade microbiana. Consulte a Figura 1 suplementar para ensaios de curva de crescimento dos compostos bioativos testados usados neste protocolo.
  2. Para calcular a concentração de compostos bioativos no poço, considerando uma solução estoque de farnesol e linalol a 20 mg/mL e uma concentração alvo de 200 μg/mL no poço, bem como resveratrol a 2,5 mg/mL na solução estoque e 25 μg/mL no poço, faça o cálculo da seguinte forma:
    C1V1 = C2V2
    20.000 μg/mL x V1 = 200 μg/mL x 200 μL
    V1 = 40.000/20.000 μL
    V1 = 2 μL
    onde C1 = concentração da solução-mãe (20 mg/mL, o que equivale a 20.000 μg/mL); V1 = volume da solução-mãe a adicionar; C2 = concentração final desejada (200 μg/mL); V2 = volume final no poço (200 μL).

3. Diluição seriada20 e preparação da placa (figura 3)

NOTA: A diluição em série é usada para avaliar rapidamente uma faixa de concentrações de um composto testado. Nesse processo, o composto é sucessivamente diluído em uma proporção constante, neste caso 1:2. Cada diluição reduz a concentração do composto para metade em relação à concentração anterior, resultando numa gama de concentrações decrescentes20.

  1. Na primeira coluna da diluição seriada, adicione 196 μL de caldo LB (em nosso exemplo, colunas 3, 5 e 7). Nos seguintes poços da diluição seriada, adicione 100 μL de caldo LB (no nosso caso, colunas 4, 6 e 8).
  2. Em seguida, adicione 2x a quantidade de composto bioativo calculada na etapa anterior (2.2) para realizar a diluição seriada. O cálculo resultou em 2 μL de cada composto testado para atingir a concentração final no primeiro poço, então adicione 4 μL do composto (colunas 3, 5 e 7).
  3. Transfira metade do volume total do poço (100 μL) para a próxima coluna (no nosso caso, colunas 4, 6 e 8) e assim por diante até a última concentração desejada, se estiver fazendo uma diluição em série. Lembre-se de misturar bem o conteúdo antes da transferência.
    NOTA: Nesta configuração experimental, usamos apenas duas concentrações para simplificar e todos os compostos cabem em apenas uma placa.
  4. Realizar a experiência em pelo menos triplicado por concentração de cada composto. Três réplicas biológicas também são recomendadas. Troque a ponta e repita o procedimento até a última concentração desejada. Na última coluna (no nosso caso, 4, 6 e 8), retire 100 μL e descarte.
  5. Adicionar 80 μL de caldo LB a todos os poços, totalizando 180 μL (linhas B a D). Em seguida, adicionar 20 μL da cultura de C. violaceum padronizada na etapa 1.2, garantindo um volume final de 200 μL por poço (linhas B a D). Certifique-se de trocar as ponteiras da pipeta todas as vezes ao trocar os poços para evitar o transporte de concentrações mais altas entre os poços ou contaminação.
  6. Se o composto for dissolvido em qualquer tipo de solvente, certifique-se de preparar o controle com esse solvente. Usamos DMSO. Neste caso, preparar um controlo solvente, que será o controlo não tratado - UC (sem composto bioactivo; coluna 9). Adicione 2 μL de DMSO por poço de controle. Isso dá uma concentração máxima de 1% de DMSO no teste.
    NOTA: O DMSO a 1% não afeta o crescimento bacteriano21,22.
  7. Prepare o espaço em branco ou controle de cor se estiver usando compostos pigmentados, sem bactérias. Após adicionar 80 μL de caldo LB a todos os poços, totalizando 180 μL (fileiras B a D, conforme descrito anteriormente), adicionar 20 μL de caldo LB aos poços em branco correspondentes, totalizando 200 μL (fileiras E a G). Isso é feito porque há alguma coloração de fundo do cristal violeta que precisa ser subtraída das leituras de OD, conforme descrito na etapa 5 deste protocolo.
  8. Se alguma coluna permanecer vazia, encha-a com 200 μL de caldo LB ou água destilada estéril (colunas 1, 2, 10, 11 e 12). Esta etapa é importante para evitar a secagem excessiva do meio na incubadora.

4. Incubação e extração de violaceína

  1. Cubra a placa com uma tampa ou uma película de vedação (conforme especificado na Tabela de Materiais) para evitar a evaporação, dependendo do espectrofotômetro usado.
  2. Incubar a placa a 30 °C com agitação a 130 rpm durante 24 h.Em seguida, retirar a placa da incubadora, colocá-la numa incubadora de secagem a 60 °C, retirar a tampa e deixar a placa secar completamente (aproximadamente 8 h).
  3. Depois que a placa secar, remova-a da incubadora e adicione 200 μL de DMSO puro a cada poço e, em seguida, cubra-o. Coloque a placa em uma incubadora a 25°C agitando a 130 rpm por 30 min para dissolver o pigmento violaceína.
  4. Após este tempo, retirar a placa da incubadora e transferir 100 μL para outra microplaca, evitando o contato entre a ponta e as paredes do poço.

5. Quantificação da produção de violaceína

  1. Quantificar a quantidade de produção de violaceína medindo a absorvância a 595 nm utilizando um espectrofotómetro de placas adequado (Tabela de Materiais). A inibição do pigmento violaceína é proporcional a leituras de absorbância mais baixas.
  2. Quantificar a produção de violaceína usando um controle negativo (controle não tratado) como referência para a produção de 100% de violaceína (Tabela 1). Primeiro, subtraia o valor de absorbância do branco de cada réplica de tratamento para obter a absorbância correspondente apenas ao pigmento violaceína (excluindo a interferência do caldo ou da cor composta). Em seguida, calcule a porcentagem de produção de violaceína para cada tratamento, usando a seguinte equação.
    % produção de violaceína = (DO do composto bioativo / DO do controle não tratado) x 100
  3. Calcular as análises estatísticas em três réplicas. Os resultados podem ser submetidos à ANOVA, seguido do teste de Tukey usando o software GraphPad Prism 8.0. O valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

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Para os resultados aqui apresentados, foram utilizados três compostos bioativos previamente estudados por nosso grupo de pesquisa8, resveratrol, farnesol e linalol. Cada composto foi testado quanto à sua capacidade de inibir a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472, um fenótipo regulado pelo sistema QS sobre o operon vioABCDE 23.

Os resultados validam a eficácia do nosso protocolo na quantificação da produção de viola...

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Discussão

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O primeiro método para extrair e caracterizar a violaceína de C. violaceum surgiu na década de 1990, com foco na identificação de fontes de carbono adequadas para a síntese de pigmentos. Nesse processo, a violaceína - junto com as células e o meio de cultura - foi seca, ressuspensa em etanol e depois separada por extração sobrenadante. A violaceína, agora dissolvida em etanol, foi posteriormente seca novamente, produzindo uma forma pura e seca do pigmento27

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPQ) por meio dos auxílios #403661/2023-4 e #444794/2024-7 e #306685/2022-1, e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelos auxílios #2024/05158-6 e 2023/17090-4 e pelo apoio financeiro ao Centro de Pesquisa em Alimentos (FoRC) #2013/07914-8.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMSO Synth
FarnesolSigma-AldrichF20395%
LinalolSigma-AldrichL260297%
Luria-Bertani MédioDifco244620
Filme adesivo ópticoThermo Fisher4311971MicroAmp
ResveratrolSigma-AldrichR5010≥ 99% (HPLC)
Leitor multimodo Synergy HTXBiotek
Placas de cultura de tecidos 96 poçosKasviK12-096

Referências

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