Atenuação da Ferroptose Neuronal por Inibição de RKIP Após Hemorragia Intracerebral Espontânea via Ativação da Via NRF2/HO-1

Resumo

Ao realizar estudos baseados em organismos e culturas de células, foi demonstrado que a inibição da proteína inibidora da quinase Raf (RKIP) pode mitigar a ferroptose neuronal após hemorragia intracerebral espontânea, reduzindo assim a lesão cerebral. A citoproteção observada surge através da modulação do eixo de sinalização NRF2/HO-1 .

Resumo

A proteína inibidora da quinase Raf (RKIP), um membro primário da família de proteínas de ligação à fosfatidiletanolamina, é reconhecida por seu envolvimento em vários processos fisiológicos, incluindo diferenciação celular, migração, ciclo celular e apoptose. Este estudo explorou sua função na ferroptose neuronal após hemorragia intracerebral espontânea (HIC) e os mecanismos associados. Um modelo celular de HIC espontânea foi desenvolvido usando células de feocromocitoma de rato (PC12) cultivadas estimuladas com hemina. Foram avaliadas a viabilidade celular, a expressão de RNA, os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e o hidroperóxido lipídico (LPO). Além disso, os níveis de expressão de proteínas foram medidos. Este estudo confirmou que a inibição do RKIP é neuroprotetora in vitro após HIC. Este efeito foi associado ao aumento da expressão da glutationa peroxidase 4 (GPX4) e à diminuição da expressão da família de cadeia longa acil-CoA sintetase 4 (ACSL4), juntamente com os níveis de ROS e LPO nos neurônios. A inibição de RKIP demonstrou um papel protetor contra a ferroptose neuronal in vitro após HIC, potencialmente por meio da ativação da via do fator nuclear E2 relacionado ao fator E2 / heme oxigenase-1 (NRF2 / HO-1). Esse mecanismo pode oferecer insights sobre estratégias terapêuticas direcionadas à ferroptose neuronal na HIC.

Introdução

A hemorragia intracerebral espontânea (HIC) é uma condição cerebrovascular caracterizada por sangramento devido a dano vascular intracraniano, necrose e ruptura de vasos, comumente afetando os gânglios da base e representando um subtipo importante de acidente vascular cerebral hemorrágico¹. A taxa de mortalidade entre pacientes diagnosticados com HIC é de aproximadamente 50%, e uma proporção significativa de sobreviventes apresenta perda grave de independência². As opções de tratamento atuais para HIC espontânea são limitadas, sem terapias existentes que reduzam significativamente a mortalidade ou melhorem significativamente os resultados neurológicos pós-HIC.

A ferroptose, uma forma de morte celular programada dependente de ferro, é definida pela peroxidação lipídica, acúmulo de íons ferrosos e depleção de glutationa, distinguindo-a de outras formas de morte celular programada em termos genéticos, morfológicos e biológicos³. Evidências crescentes destacam o papel da ferroptose neuronal na patologia da HIC. A proteína inibidora da raf quinase (RKIP), também conhecida como proteína 1 de ligação à fosfatidiletanolamina (PEBP1), está envolvida no desenvolvimento neural e forma o complexo 15LOX/PEBP1 por meio de sua ligação com a 15-lipoxigenase (15LOX), um regulador chave da ferroptose⁴. No entanto, o papel específico e os mecanismos do RKIP na ferroptose ligados à progressão da HIC espontânea permanecem inexplorados.

Este estudo examinou os efeitos anti-ferroptose da inibição de RKIP nos neurônios, demonstrando que a inibição da expressão de RKIP poderia suprimir a ferroptose neuronal após ICH, potencialmente através da ativação da via do fator nuclear E2 relacionado ao fator E2 / heme oxigenase-1 (NRF2 / HO-1). Esses achados são significativos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas direcionadas à patogênese da HIC.

Protocolo

Cultura de células PC12
A linhagem celular PC12 foi propagada em meio de crescimento Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina, com manutenção de rotina em condições de cultura padrão (37 °C, 5% de CO₂ atmosfera umidificada). Para procedimentos experimentais, as células aderentes foram plaqueadas em vasos de cultura e deixadas proliferar até atingir monocamadas quase confluentes (aproximadamente 90% de cobertura de superfície). A dissociação celular foi realizada por meio de tratamento enzimático com solução de tripsina-EDTA a 0,25%, seguido por três ciclos sucessivos de subcultura para garantir a estabilidade da população. As células processadas foram posteriormente alocadas para aplicações experimentais a jusante e avaliações analíticas.

Ensaios de viabilidade celular
A viabilidade celular foi avaliada para avaliar a citotoxicidade da hemina e da locostatina em células PC12, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante do kit de ensaio. As células PC12 foram semeadas uniformemente em placas de 96 poços e cultivadas com hemina ou locostatina por 24 h. Após a lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS), as células foram incubadas em meio RPMI-1640 contendo solução salina de tetrazólio a 10% por 90 min a 37 °C. Os valores de densidade óptica (OD) foram então medidos em 450 nm usando um leitor de microplacas.

Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR)
O RNA total foi extraído das células PC12 usando o reagente de extração de RNA. Primeiramente, a amostra foi homogeneizada no reagente de extração, garantindo uma lise completa. O clorofórmio foi adicionado à mistura, agitado vigorosamente e centrifugado para separar as fases (12.000 × g, 15 min, 4 °C). A fase aquosa contendo o RNA foi coletada, e o RNA foi precipitado pela adição de isopropanol (fase aquosa: iPrOH = 1:1) e incubação à temperatura ambiente. A centrifugação foi feita para pellet do RNA (12.000 × g, 10 min, 4 °C), 1 mL de etanol a 70% foi adicionado para remover as impurezas e, finalmente, o pellet de RNA foi dissolvido em água livre de RNase para armazenamento a -80 °C. Modelos complementares de DNA (cDNA) foram gerados por transcrição reversa com o RT Master Mix. Os modelos resultantes foram então diluídos na proporção de 1:5 e submetidos a PCR quantitativo em tempo real em um instrumento de PCR em tempo real. Cada amostra foi amplificada em triplicata e a quantidade relativa de produto de PCR foi calculada. Os primers usados estão listados na Tabela 1, com a β-actina servindo como gene de limpeza. A concentração relativa de mRNA foi determinada usando a fórmula E = 2^−ΔΔCt, e o valor do ciclo de limiar crítico (CT) foi registrado para cada reação.

Ensaios de espécies reativas de oxigênio (ROS) e hidroperóxido lipídico (LPO) intracelulares
Os níveis de ROS e LPO foram medidos por citometria de fluxo. As células PC12 foram tratadas com hemina (80 μM), locostatina (5 μM) e ML385 (5 μM) por 24 h e lavadas 3x com PBS em pratos. As células foram então incubadas a 37 °C com 5% de CO₂ por 40 min na presença de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), uma sonda ROS, e BODIPY 581/591 C11, uma sonda LPO. Após lavagens de PBS para remover o excesso de sondas, a intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo. Uma estratégia de gating consistente foi aplicada em todas as amostras: primeiro, as células foram fechadas em FSC-A vs. SSC-A para excluir detritos, em seguida, células únicas foram selecionadas por FSC-A vs. FSC-H gating. Células não coradas e células tratadas apenas com hemina foram usadas como controles negativos e positivos para estabelecer a compensação de fluorescência e as portas. Os dados foram analisados por meio do software vinculado.

Extração de proteínas e western blot
Extração total de proteínas
O sobrenadante das células PC12 tratadas foi descartado, seguido por três lavagens com PBS gelado. As células foram colhidas com tripsina e centrifugadas a 200 × g por 5 min. Após a remoção do sobrenadante, o pellet celular foi homogeneizado em tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) a frio contendo 10% de inibidor de protease e 10% de inibidor de fosfatase. Após uma incubação de 30 min em gelo, o lisado foi centrifugado a 12.000 × g por 15 min a 4 °C. O sobrenadante transparente foi misturado com tampão de carga (4:1) e aquecido a 95 °C por 5 min para desnaturar as proteínas. As amostras de proteína foram armazenadas a -80 °C para uso posterior.

Análise de Western blot
As proteínas foram separadas por SDS-PAGE usando um gel de empilhamento e gel de resolução, com amostras carregadas em poços. A eletroforese foi realizada a 80 V para o gel de empilhamento e 120 V para o gel de resolução. As proteínas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (pré-ativada em metanol por 1 min) usando um sistema de transferência a uma corrente constante de 300 mA por 1-2 h. A membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado em TBST por 2 h em temperatura ambiente para evitar ligação inespecífica. Após três lavagens com TBST (10 min cada), a membrana foi incubada durante a noite a 4 °C com os seguintes anticorpos primários diluídos em TBST: Coelho anti-ACSL4 (1:1.000), Coelho anti-GPX4 (1:1.000), Coelho anti-HO-1 (1:2.000), Coelho anti-NRF2 (1:1.000), Coelho anti-RKIP (1:1.500) e Camundongo anti-β-actina (1:5.000). A membrana foi lavada por 3 x 10 min com TBST e incubada com anticorpos secundários conjugados com HRP por 2 h em temperatura ambiente: IgG anti-camundongo de cabra marcado com HRP (1:1.000), IgG anti-coelho de cabra marcado com HRP (1:1.000). Após lavagens adicionais de TBST por 3 x 5 min, os sinais de proteína foram visualizados usando um ECL Western Blot Kit e quantificados usando o software ImageJ.

Coloração de imunofluorescência
As células foram semeadas em lamínulas pré-colocadas em placas de cultura e deixadas aderir. Após os tratamentos experimentais, o sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas 3x com PBS. As células foram fixadas com paraformaldeído (PFA) a 4% por 15 min em temperatura ambiente, seguidas de três lavagens com PBS. Posteriormente, as células foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% por 10 min em temperatura ambiente e lavadas 3x com PBS. A ligação inespecífica foi bloqueada pela incubação com albumina de soro bovino (BSA) a 3% por 30 min à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram aplicados durante a noite a 4 °C: Coelho anti-HO-1 (1:500), Coelho anti-NRF2 (1:500). Após três lavagens de PBS no dia seguinte, as células foram incubadas com anticorpos secundários fluorescentes no escuro por 1 h em temperatura ambiente: Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Após as lavagens finais, as amostras foram montadas com meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2'-fenilindol (DAPI) para contracoloração nuclear. As imagens foram capturadas usando um microscópio confocal de varredura a laser.

Análise estatística
Os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Dados quantitativos representando resultados de três ensaios replicados independentes foram tomados para análise. Para comparações entre dois grupos, foi aplicado um teste t, enquanto uma análise de variância (ANOVA) de uma via foi usada para comparações entre vários grupos, seguida pelo teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A hemina pode induzir danos à membrana plasmática, por isso é frequentemente usada para a construção de modelos celulares in vitro de HIC. Este estudo investigou os efeitos do tratamento com hemina em concentrações e durações variadas na viabilidade celular PC12, ao mesmo tempo em que analisou a dinâmica da expressão da proteína RKIP sob condições experimentais correspondentes por meio da análise de western blot (Figura 1A). A viabilidade celular foi significativamente reduzida em c...

Discussão

Este estudo investigou os efeitos e mecanismos subjacentes do knockdown de RKIP na ferroptose induzida por ICH em um ambiente in vitro . A estimulação das células com hemina desencadeia o estresse oxidativo, acompanhado pela geração excessiva de ROS e LPO, promovendo assim a ferroptose. A inibição da expressão endógena de RKIP acelera o NRF2 liberado para se translocar para o núcleo e se ligar ao Elemento de Resposta Antioxidante (ARE), iniciando a tra...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
IgG com a marca Alexa Fluor 488 para Cabras Anti-Coelho	Beyotime Biotech	A0423
Anticorpo anti-ACSL4	Sinalização celular	38493T
Anticorpo anti-GPX4	Sinalização celular	59735S
Anticorpo anti-HO-1	MedChemExpress	HY-P80499
Anticorpo anti-NRF2	Sinalização celular	12721T
Anticorpo anti-RKIP	Abcam	ab76582
Anticorpo anti-β-actina	Abcam	ab179467
BeyoECL Plus	Beyotime Biotech	P0018M
BSA	NCM Biotech	WB6504-100g
Kit de Contagem de Células-8	Beyotime Biotech	C0037
SALVAMENTO DE CÉLULAS	NCM Biotech	C40050
ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix	Vazyme	Q411-02
DMSO	Beyotime Biotech	ST038
Soro Fetal Bovino	Gibco	A5670801
GraphPad Prisma
Hemin	MedChemExpress	HY-19424
HiScript Q RT SuperMix para qPCR (+limpador de gDNA)	Vazyme	R123-01
IgG Anti-Camundongo Marcado com HRP	Thermo	C31430100
IgG Anti-Coelho Marcado com HRP	Thermo	C31460100
Kit de Ensaio de Conteúdo de Peróxido Lipídico (LPO)	Solarbio	BC5245
Locostatina	MedChemExpress	HY-W013411A
ML385	MedChemExpress	HY-100523
Montagem Média? Antidesvanecimento (com DAPI)	Solarbio	S2110
Leite em pó DESNATADO	Solarbio	D8340
PBS (pólvora?pH7.2-7.4)	Solarbio	P1010
PC-12Adh	Biotecnologia BioChannel de Nanjing	BC-C-RA-005
Líquido de Penicilina-Estreptomicina	Solarbio	P1400
PRMI-1640	Gibco	A1049101
Cocktail de protease e inibidor de fosfatase para uso geral, 50x	Beyotime Biotech	P1045
Marcador de Proteína	Thermo	26617
PVDF	Millipore	RIKB43638
Kit de Ensaio de Espécies Reativas de Oxigênio	Solarbio	CA1410
Buffer RIPA (alto)	Solarbio	R0010
Kit de Preparação Rápida para Gel SDS-PAGE	Epizima	PG110
Buffer de Carregamento de Exemplos SDS-PAGE, 5x	Beyotime Biotech	P0015
TritonX-100	Solarbio	IT9100
Trizol	Thermo	15596018CN
Solução de tripsina-EDTA? 0,25% (sem fenol vermelho)	Solarbio	T1300