Atenuação da Ferroptose Neuronal por Inibição de RKIP Após Hemorragia Intracerebral Espontânea via Ativação da Via NRF2/HO-1

A hemorragia intracerebral espontânea (HIC) é uma condição cerebrovascular caracterizada por sangramento devido a dano vascular intracraniano, necrose e ruptura de vasos, comumente afetando os gânglios da base e representando um subtipo importante de acidente vascular cerebral hemorrágico¹. A taxa de mortalidade entre pacientes diagnosticados com HIC é de aproximadamente 50%, e uma proporção significativa de sobreviventes apresenta perda grave de independência². As opções de tratamento atuais para HIC espontânea são limitadas, sem terapias existentes que reduzam significativamente a mortalidade ou melhorem significativamente os resultados neurológicos pós-HIC.

A ferroptose, uma forma de morte celular programada dependente de ferro, é definida pela peroxidação lipídica, acúmulo de íons ferrosos e depleção de glutationa, distinguindo-a de outras formas de morte celular programada em termos genéticos, morfológicos e biológicos³. Evidências crescentes destacam o papel da ferroptose neuronal na patologia da HIC. A proteína inibidora da raf quinase (RKIP), também conhecida como proteína 1 de ligação à fosfatidiletanolamina (PEBP1), está envolvida no desenvolvimento neural e forma o complexo 15LOX/PEBP1 por meio de sua ligação com a 15-lipoxigenase (15LOX), um regulador chave da ferroptose⁴. No entanto, o papel específico e os mecanismos do RKIP na ferroptose ligados à progressão da HIC espontânea permanecem inexplorados.

Este estudo examinou os efeitos anti-ferroptose da inibição de RKIP nos neurônios, demonstrando que a inibição da expressão de RKIP poderia suprimir a ferroptose neuronal após ICH, potencialmente através da ativação da via do fator nuclear E2 relacionado ao fator E2 / heme oxigenase-1 (NRF2 / HO-1). Esses achados são significativos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas direcionadas à patogênese da HIC.

Cultura de células PC12
A linhagem celular PC12 foi propagada em meio de crescimento Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina, com manutenção de rotina em condições de cultura padrão (37 °C, 5% de CO₂ atmosfera umidificada). Para procedimentos experimentais, as células aderentes foram plaqueadas em vasos de cultura e deixadas proliferar até atingir monocamadas quase confluentes (aproximadamente 90% de cobertura de superfície). A dissociação celular foi realizada por meio de tratamento enzimático com solução de tripsina-EDTA a 0,25%, seguido por três ciclos sucessivos de subcultura para garantir a estabilidade da população. As células processadas foram posteriormente alocadas para aplicações experimentais a jusante e avaliações analíticas.

Ensaios de viabilidade celular
A viabilidade celular foi avaliada para avaliar a citotoxicidade da hemina e da locostatina em células PC12, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante do kit de ensaio. As células PC12 foram semeadas uniformemente em placas de 96 poços e cultivadas com hemina ou locostatina por 24 h. Após a lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS), as células foram incubadas em meio RPMI-1640 contendo solução salina de tetrazólio a 10% por 90 min a 37 °C. Os valores de densidade óptica (OD) foram então medidos em 450 nm usando um leitor de microplacas.

Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR)
O RNA total foi extraído das células PC12 usando o reagente de extração de RNA. Primeiramente, a amostra foi homogeneizada no reagente de extração, garantindo uma lise completa. O clorofórmio foi adicionado à mistura, agitado vigorosamente e centrifugado para separar as fases (12.000 × g, 15 min, 4 °C). A fase aquosa contendo o RNA foi coletada, e o RNA foi precipitado pela adição de isopropanol (fase aquosa: iPrOH = 1:1) e incubação à temperatura ambiente. A centrifugação foi feita para pellet do RNA (12.000 × g, 10 min, 4 °C), 1 mL de etanol a 70% foi adicionado para remover as impurezas e, finalmente, o pellet de RNA foi dissolvido em água livre de RNase para armazenamento a -80 °C. Modelos complementares de DNA (cDNA) foram gerados por transcrição reversa com o RT Master Mix. Os modelos resultantes foram então diluídos na proporção de 1:5 e submetidos a PCR quantitativo em tempo real em um instrumento de PCR em tempo real. Cada amostra foi amplificada em triplicata e a quantidade relativa de produto de PCR foi calculada. Os primers usados estão listados na Tabela 1, com a β-actina servindo como gene de limpeza. A concentração relativa de mRNA foi determinada usando a fórmula E = 2^−ΔΔCt, e o valor do ciclo de limiar crítico (CT) foi registrado para cada reação.

Ensaios de espécies reativas de oxigênio (ROS) e hidroperóxido lipídico (LPO) intracelulares
Os níveis de ROS e LPO foram medidos por citometria de fluxo. As células PC12 foram tratadas com hemina (80 μM), locostatina (5 μM) e ML385 (5 μM) por 24 h e lavadas 3x com PBS em pratos. As células foram então incubadas a 37 °C com 5% de CO₂ por 40 min na presença de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), uma sonda ROS, e BODIPY 581/591 C11, uma sonda LPO. Após lavagens de PBS para remover o excesso de sondas, a intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo. Uma estratégia de gating consistente foi aplicada em todas as amostras: primeiro, as células foram fechadas em FSC-A vs. SSC-A para excluir detritos, em seguida, células únicas foram selecionadas por FSC-A vs. FSC-H gating. Células não coradas e células tratadas apenas com hemina foram usadas como controles negativos e positivos para estabelecer a compensação de fluorescência e as portas. Os dados foram analisados por meio do software vinculado.

Extração de proteínas e western blot
Extração total de proteínas
O sobrenadante das células PC12 tratadas foi descartado, seguido por três lavagens com PBS gelado. As células foram colhidas com tripsina e centrifugadas a 200 × g por 5 min. Após a remoção do sobrenadante, o pellet celular foi homogeneizado em tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) a frio contendo 10% de inibidor de protease e 10% de inibidor de fosfatase. Após uma incubação de 30 min em gelo, o lisado foi centrifugado a 12.000 × g por 15 min a 4 °C. O sobrenadante transparente foi misturado com tampão de carga (4:1) e aquecido a 95 °C por 5 min para desnaturar as proteínas. As amostras de proteína foram armazenadas a -80 °C para uso posterior.

Análise de Western blot
As proteínas foram separadas por SDS-PAGE usando um gel de empilhamento e gel de resolução, com amostras carregadas em poços. A eletroforese foi realizada a 80 V para o gel de empilhamento e 120 V para o gel de resolução. As proteínas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (pré-ativada em metanol por 1 min) usando um sistema de transferência a uma corrente constante de 300 mA por 1-2 h. A membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado em TBST por 2 h em temperatura ambiente para evitar ligação inespecífica. Após três lavagens com TBST (10 min cada), a membrana foi incubada durante a noite a 4 °C com os seguintes anticorpos primários diluídos em TBST: Coelho anti-ACSL4 (1:1.000), Coelho anti-GPX4 (1:1.000), Coelho anti-HO-1 (1:2.000), Coelho anti-NRF2 (1:1.000), Coelho anti-RKIP (1:1.500) e Camundongo anti-β-actina (1:5.000). A membrana foi lavada por 3 x 10 min com TBST e incubada com anticorpos secundários conjugados com HRP por 2 h em temperatura ambiente: IgG anti-camundongo de cabra marcado com HRP (1:1.000), IgG anti-coelho de cabra marcado com HRP (1:1.000). Após lavagens adicionais de TBST por 3 x 5 min, os sinais de proteína foram visualizados usando um ECL Western Blot Kit e quantificados usando o software ImageJ.

Coloração de imunofluorescência
As células foram semeadas em lamínulas pré-colocadas em placas de cultura e deixadas aderir. Após os tratamentos experimentais, o sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas 3x com PBS. As células foram fixadas com paraformaldeído (PFA) a 4% por 15 min em temperatura ambiente, seguidas de três lavagens com PBS. Posteriormente, as células foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% por 10 min em temperatura ambiente e lavadas 3x com PBS. A ligação inespecífica foi bloqueada pela incubação com albumina de soro bovino (BSA) a 3% por 30 min à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram aplicados durante a noite a 4 °C: Coelho anti-HO-1 (1:500), Coelho anti-NRF2 (1:500). Após três lavagens de PBS no dia seguinte, as células foram incubadas com anticorpos secundários fluorescentes no escuro por 1 h em temperatura ambiente: Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Após as lavagens finais, as amostras foram montadas com meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2'-fenilindol (DAPI) para contracoloração nuclear. As imagens foram capturadas usando um microscópio confocal de varredura a laser.

Análise estatística
Os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Dados quantitativos representando resultados de três ensaios replicados independentes foram tomados para análise. Para comparações entre dois grupos, foi aplicado um teste t, enquanto uma análise de variância (ANOVA) de uma via foi usada para comparações entre vários grupos, seguida pelo teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

A hemina pode induzir danos à membrana plasmática, por isso é frequentemente usada para a construção de modelos celulares in vitro de HIC. Este estudo investigou os efeitos do tratamento com hemina em concentrações e durações variadas na viabilidade celular PC12, ao mesmo tempo em que analisou a dinâmica da expressão da proteína RKIP sob condições experimentais correspondentes por meio da análise de western blot (Figura 1A). A viabilidade celular foi significativamente reduzida em concentrações de hemina de 60 μM ou mais ( Figura 1B ), e essa redução ocorreu de maneira dose-dependente com o aumento das concentrações. Além disso, a citotoxicidade da hemina foi dependente do tempo, atingindo o pico nas primeiras 24 h de exposição antes de diminuir gradualmente ( Figura 1C ). A análise de Western blot indicou que a expressão da proteína RKIP foi significativamente elevada a 80 μM de hemina ( Figura 1D , E ) e atingiu seu pico em 24 h após a estimulação ( Figura 1 F , G ). Com base nesses achados, escolhemos 80 μM de hemina e um período de tratamento de 24 horas para experimentos subsequentes para elucidar os mecanismos subjacentes e as vias de sinalização envolvidas.

Para investigar o papel do RKIP na ferroptose neuronal após HIC, usamos a locostatina para inibir a expressão de RKIP ( Figura 2A ). A locostatina se liga ao RKIP, interrompe as interações entre o RKIP e a quinase Raf-1 e o GRK2, atenuando assim os efeitos funcionais do RKIP para atingir o objetivo inibitório. Neste estudo, empregamos a locostatina como inibidor de RKIP para investigar os mecanismos moleculares associados 5,6. A citotoxicidade da locostatina foi avaliada pela primeira vez em uma faixa de concentração de 0-40 μM usando o ensaio de viabilidade. Os resultados não mostraram citotoxicidade significativa a ≤5 μM, estabelecendo uma faixa de concentração segura para experimentos subsequentes (Figura 2B). Confirmamos ainda o efeito inibitório da 5 μM de locostatina na expressão de RKIP usando análises de western blotting e RT-qPCR. O Western blot revelou uma diminuição significativa nos níveis de proteína RKIP ( Figura 2C, D ), enquanto o RT-qPCR mostrou diminuição dos níveis de mRNA de RKIP ( Figura 2E ). Esses achados demonstram a eficácia da locostatina 5 μM na inibição da expressão de RKIP.

Neste estudo, um modelo de célula PC12 induzido por hemina de hemorragia intracerebral (HIC) foi desenvolvido para delinear a função regulatória do RKIP na ferroptose. Nossos resultados indicaram que a estimulação com hemina aumentou significativamente a expressão de RKIP enquanto diminuía a viabilidade celular. Com base em estudos existentes, especulamos que a morte celular induzida pela hemina pode estar intimamente relacionada à ferroptose, um processo de peroxidação lipídica catalisado por ferro marcado pela deposição patológica de ferro dentro dos compartimentos celulares e níveis elevados de espécies reativas de oxigênio (ROS).

Para explorar ainda mais a relação entre RKIP e ferroptose, tratamos células PC12 estimuladas por hemina com locostatina. A análise de Western blot revelou que a expressão da acil-CoA sintetase da família de cadeia longa 4 (ACSL4), um dos principais impulsionadores da ferroptose, aumentou significativamente no grupo tratado com hemina ( Figura 3A , B ). ACSL4 é um gene pró-morte crítico na ferroptose, promovendo a esterificação de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) e, assim, aumentando a sensibilidade celular à ferroptose. Além disso, a expressão da glutationa peroxidase 4 (GPX4), um inibidor da ferroptose, diminuiu significativamente no grupo tratado com hemina ( Figura 3A , C ). O GPX4 é um regulador chave da ferroptose que inibe a peroxidação lipídica eliminando os peróxidos lipídicos, protegendo assim as células contra danos oxidativos. Esses resultados indicam que a estimulação da hemina aumenta a ferroptose em células PC12. No entanto, em comparação com o grupo hemina, a inibição farmacológica de RKIP com Locostatina reverteu essas alterações, indicando que a supressão da expressão de RKIP inibiu a ferroptose em células PC12. Resultados consistentes também foram observados no nível de mRNA (Figura 3 F,G).

Também investigamos a expressão de moléculas da via relacionada à ferroptose. A via NRF2 / HO-1 demonstrou desempenhar um papel fundamental na ferroptose. Com base nisso, levantamos a hipótese de que a inibição de RKIP pode suprimir a ferroptose neuronal ativando a via NRF2 / HO-1. Para testar essa hipótese, primeiro estimulamos células PC12 com hemina e descobrimos que a expressão da proteína NRF2 foi significativamente aumentada ( Figura 3A , D ), juntamente com um aumento significativo em seu produto a jusante HO-1 ( Figura 3A , E ). Esses achados sugerem que a ferroptose induzida pela hemina ativa a via NRF2/HO-1, que exerce um efeito protetor nas células. Como um importante regulador das respostas antioxidantes celulares, o NRF2 aumenta a capacidade antioxidante celular, regulando a expressão de genes-alvo a jusante, como o HO-1, inibindo assim a ferroptose. Posteriormente, o tratamento com locostatina aumentou ainda mais a expressão de HO-1 e NRF2 em comparação com o grupo tratado com hemina ( Figura 3A , D ). Resultados consistentes também foram observados no nível de mRNA ( Figura 3I, J ), confirmando ainda mais que a inibição de RKIP suprime a ferroptose em células PC12 estimuladas por hemina modulando NRF2 e sua molécula a jusante HO-1.

Notavelmente, outro inibidor da ferroptose, a cadeia pesada de ferritina 1 (FTH1), mostrou expressão aumentada após a estimulação da hemina, e sua expressão foi ainda mais elevada quando o RKIP foi inibido ( Figura 3H ). FTH1 é um dos principais componentes da ferritina, responsável pelo armazenamento e oxidação do ferro. Ele converte íons de ferro em uma forma mais estável, reduzindo o estresse oxidativo induzido pelo ferro livre. A regulação positiva de FTH1 após estimulação com hemina pode representar uma resposta compensatória à sobrecarga de ferro, pois as células tentam armazenar o excesso de ferro para evitar danos oxidativos. O aumento adicional na expressão de FTH1 após o tratamento com locostatina sugere níveis reduzidos de ferro livre e aumento da capacidade antioxidante, reforçando a conclusão de que a inibição de RKIP suprime a ferroptose induzida por hemina em células PC12.

Os níveis de ROS e hidroperóxido lipídico (LPO) nas células PC12 foram avaliados por citometria de fluxo. O tratamento com hemina levou a um aumento significativo nos níveis de ROS e LPO, que foi revertido após a administração de locostatina. Esse achado indica que a inibição do RKIP pode ajudar a suprimir a ferroptose nos neurônios ( Figura 4A-D ).

Em resumo, a dose induzida pela hemina e as reduções dependentes do tempo na viabilidade celular PC12, concomitantes com um aumento acentuado nos níveis de proteína RKIP . Este processo foi associado a níveis elevados de ACSL4 e supressão da expressão de GPX4. Concomitantemente, foi observado um acúmulo significativo de marcadores de dano oxidativo (ROS e LPO), com ambos servindo como principais impulsionadores da ferroptose, mediando o estresse oxidativo e a ruptura da membrana lipídica. Além disso, a regulação positiva da proteína de armazenamento de ferro FTH1 sugeriu uma resposta celular compensatória à sobrecarga de ferro. Criticamente, a inibição farmacológica do RKIP pela locostatina reverteu essas alterações e revogou a ferroptose induzida pela hemina (Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4).

Os resultados dos ensaios indicaram que a inibição do RKIP suprimiu efetivamente a ferroptose neuronal e regulou a expressão de NRF2 / HO-1 . Dado que a via NRF2 / HO-1 desempenha um papel fundamental na ferroptose, foi levantada a hipótese de que a supressão da ferroptose neuronal observada com a inibição de RKIP pode ser mediada pela estimulação dessa via. Para testar essa hipótese, outros experimentos foram realizados (Figura 5A).

ML385, um inibidor seletivo de NRF2, foi usado, e os resultados confirmaram que a expressão de NRF2 foi efetivamente reduzida nos níveis de proteína ( Figura 5B , C ) e mRNA ( Figura 5E ). Além disso, a expressão de HO-1, uma molécula a jusante de NRF2, foi avaliada. Os resultados indicaram que, embora a inibição de RKIP inicialmente tenha aumentado a expressão de HO-1, esse efeito foi revertido após a inibição de NRF2 ( Figura 5B, D , F ). Esses resultados sugerem que a inibição do RKIP pode atenuar a ferroptose neuronal ativando a via NRF2/HO-1. A coloração por imunofluorescência apoiou ainda mais esses achados, pois a translocação nuclear de NRF2 foi observada após a inibição do RKIP (Figura 5G-J).

Posteriormente, avaliamos ainda mais os níveis de ROS e LPO em células PC12 usando citometria de fluxo. Descobrimos que a inibição de NRF2 com ML385 reverteu a redução induzida pela Locostatina nos níveis de ROS e LPO. Esses achados sugerem que a supressão de RKIP pode inibir a ferroptose neuronal ativando a via NRF2 / HO-1 ( Figura 6A-D ).

DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os conjuntos de dados gerados durante o estudo atual estão incluídos no Arquivo Suplementar 1.

Figura 1: Construção de um modelo de doença in vitro por células PC12 estimuladas por hemina. (A) Ilustração esquemática da construção do modelo de célula PC12 estimulado por hemina. (B) Determinação da concentração ideal de hemina para o estabelecimento do modelo de hemorragia intracerebral in vitro usando o ensaio de viabilidade celular para avaliar a viabilidade celular. (C) Ensaio de viabilidade celular com células PC12 tratadas com hemina (80 μM) por vários pontos de tempo. (D, E) Análise representativa de western blot e avaliação quantitativa dos níveis de expressão de RKIP em células PC12 tratadas com diferentes concentrações de hemina (24 h). (F, G) Análise representativa de western blot e avaliação quantitativa dos níveis de expressão de RKIP em células PC12 expostas à hemina (80 μM) por durações variadas. Todos os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: CCK8 = Kit de Contagem de Células-8; WB = western blot; RKIP = proteína inibidora da Raf quinase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Efeito da Locostatina na expressão de RKIP em células PC12 estimuladas com hemina. (A) Ilustração esquemática do procedimento experimental para tratamento com Locostatina em células PC12. (B) A viabilidade celular das células PC12 tratadas com diferentes concentrações de Locostatina foi avaliada usando o ensaio de viabilidade celular. (C, D) A expressão de RKIP em células PC12 tratadas com hemina (80 μM,24 h) e/ou locostatina (5 μM,24 h) foi analisada por western blot, com blots representativos e análise estatística mostrados. (E) A expressão de mRNA RKIP em células PC12 tratadas com hemina (80 μM, 24 h) e / ou Locostatina (5 μM, 24 h) foi medida usando RT-qPCR. Todos os dados são apresentados como média ± DP (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: CCK8 = Kit de Contagem de Células-8; WB = western blot; RT-qPCR = Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa; ROS = Espécies reativas de oxigênio; LPO = peroxidação lipídica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeito da inibição de RKIP na ferroptose em células PC12 após estimulação com hemina. (AE) Análise de Western blot de alterações na expressão de proteínas em ACSL4, GPX4, NRF2 e HO-1 em células PC12 tratadas com hemina (80 μM, 24 h) e / ou Locostatina (5 μM, 24 h). (F-J) Análise de RT-qPCR dos níveis de expressão de mRNA de ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 e FTH1 em células PC12 tratadas com hemina (80 μM, 24 h) e / ou Locostatina (5 μM, 24 h). Todos os dados são apresentados como média ± DP (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: WB = western blot; RT-qPCR = Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa; RKIP = proteína inibidora da Raf quinase; ACSL4 = família de cadeia longa acil-CoA sintetase 4; GPX4 = Glutationa peroxidase 4; NRF2 = fator nuclear E2 relacionado ao fator 2; HO-1 = Heme oxigenase-1; FTH1 = Cadeia pesada de ferritina 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Efeito da inibição do RKIP no estresse oxidativo em células PC12 após estimulação com hemina. (A, C) Análise por citometria de fluxo da produção de espécies reativas de oxigênio em células PC12 tratadas com hemina (80 μM, 24 h) e / ou locostatina (5 μM, 24 h). (B, D) Análise por citometria de fluxo da peroxidação lipídica em células PC12 tratadas com hemina (80 μM,24 h) e/ou Locostatina (5 μM,24 h). Todos os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: ROS = Espécies reativas de oxigênio; LPO = peroxidação lipídica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O papel do NRF2 nos efeitos antiferroptóticos mediados pela inibição do RKIP. (A) Ilustração esquemática do procedimento experimental para o tratamento de células PC12 em diferentes condições. (BD) Análise de Western blot de alterações na expressão de proteínas em NRF2 e HO-1 sob diferentes condições de tratamento em células PC12 com hemina (80 μM, 24 h) e/ou Locostatina (5 μM,24 h) e/ou ML385 (5 μM, 24 h). (E, F) Análise RT-qPCR dos níveis de expressão de mRNA de NRF2 e HO-1 em células PC12 tratadas com hemina (80 μM, 24 h) e/ou Locostatina (5 μM, 24 h) e/ou ML385 (5 μM, 24 h). (G-J) Análise de imunofluorescência da expressão de NRF2 e HO-1 e quantificação da intensidade média de fluorescência em células PC12 tratadas com hemina (80 μM, 24 h) e/ou Locostatina (5 μM, 24 h) e/ou ML385 (5 μM, 24 h). Barras de escala = 50 μm. Todos os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: WB = western blot; RT-qPCR = Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa; Coloração IF = Coloração por imunofluorescência; NRF2 = fator nuclear E2 relacionado ao fator 2; HO-1 = Heme oxigenase-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: O papel do NRF2 na supressão do estresse oxidativo mediado pela inibição do RKIP. (A, C) Análise por citometria de fluxo da produção de espécies reativas de oxigênio em células PC12 com hemina (80 μM, 24 h) e/ou Locostatina (5 μM, 24 h) e/ou ML385 (5 μM, 24 h). (B, D) Análise por citometria de fluxo da peroxidação lipídica em células PC12 tratadas com hemina (80 μM, 24 h) e / ou Locostatina (5 μM, 24 h) e / ou ML385 (5 μM, 24 h). Todos os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: ROS = Espécies reativas de oxigênio; LPO = peroxidação lipídica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Representação esquemática da inibição de RKIP atenuando a ferroptose neuronal após ICH espontânea ativando a via NRF2 / HO-1. Nossos achados demonstram que a inibição de RKIP promove efetivamente a translocação nuclear de NRF2, suprime o acúmulo de ROS lipídicos e, consequentemente, protege contra a ferroptose induzida por hemina e o estresse oxidativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Primers para transcrição reversa quantitativa-PCR.

Arquivo Suplementar 1: Dados quantitativos brutos e processados que suportam os primeiros seis números, incluindo ensaios CCK-8, Western blot, RT-qPCR e análises de citometria de fluxo. Os dados são organizados por subpainéis de figuras e incluem todos os valores replicados usados para análises estatísticas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.